王錦軍

蛇床子素增強(qiáng)TNF-α對骨肉瘤細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)活性及機(jī)制研究

王錦軍

目的觀察蛇床子素增強(qiáng)腫瘤壞死因子對骨肉瘤細(xì)胞的凋亡能力及其機(jī)制。方法將骨肉瘤細(xì)胞系HOS分為對照組、TNF-α組及蛇床子素聯(lián)合TNF-α組和蛇床子素+TNF-α+CYLD siRNA組；MTT法檢測HOS細(xì)胞的細(xì)胞活力，Annexin V/PI染色檢測HOS細(xì)胞的凋亡，免疫共沉淀聯(lián)合Western blot法檢測HOS細(xì)胞RIP1蛋白的泛素化，Western blot法檢測HOS細(xì)胞caspase-8的活化和CYLD去泛素化酶的相對表達(dá)量。結(jié)果與對照組比較，TNF-α組、蛇床子素+TNF-α組對HOS細(xì)胞活力的抑制率增加 [（12.5±0.9）%、（58.6±3.8）%比0，P＜0.05]，TNF-α組、蛇床子素+ TNF-α組對HOS細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)率提高（8.3±0.5）%、（39.9±2.5）%比（1.9±0.3）%，P＜0.05]，而蛇床子素+TNF-α+CYLD siRNA組的HOS細(xì)胞活力抑制率、HOS細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)率均低于蛇床子素+TNF-α組[（22.1±1.2）%比（58.6±3.8）%，P＜0.05；（13.5±0.9）%比（39.9±2.5）%，P＜0.05]。與對照組、TNF-α組比較，蛇床子素+TNF-α組RIP1泛素蛋白相對表達(dá)量降低（0.28±0.02比1.00±0.07、0.81±0.06，P＜0.05），蛇床子素+TNF-α組活化的caspase-8蛋白的相對表達(dá)量明顯提高（0.46±0.04比0.01±0.01、0.08±0.02，P＜0.05），蛇床子素+TNF-α組CYLD蛋白的相對表達(dá)量也明顯增加（0.81±0.05比0.28± 0.02、0.30±0.02，P＜0.05）。與蛇床子素+TNF-α組比較，蛇床子素+TNF-α+CYLD siRNA組RIP1泛素蛋白相對表達(dá)量增加（0.77±0.05比0.28±0.02，P＜0.05），顯示CYLD siRNA能顯著抑制蛇床子素對TNF-α的協(xié)同作用。結(jié)論蛇床子素通過上調(diào)去泛素化酶CYLD的表達(dá)水平，促進(jìn)TNF-α依賴的RIP1蛋白的去泛素化，進(jìn)而誘導(dǎo)骨肉瘤細(xì)胞caspase-8的活化和凋亡的發(fā)生。

骨肉瘤；蛇床子素；TNF-α；RIP1；去泛素化；caspase-8；細(xì)胞凋亡

骨肉瘤是最常見的原發(fā)性惡性骨腫瘤，好發(fā)于兒童和青少年時期，很容易發(fā)生局部浸潤和早期全身性轉(zhuǎn)移，嚴(yán)重危害少年兒童人群的健康[1]。腫瘤壞死因子（TNF-α）是一種由活化的巨噬細(xì)胞分泌的多功能細(xì)胞因子，能介導(dǎo)細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)。TNF-α能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡，然而為了獲得令人滿意的腫瘤治療效果，臨床中往往需要較大的TNF-α使用劑量，而病人往往不能耐受高劑量TNF-α造成的副作用[2]。因此，尋找TNF-α的增敏藥物以降低它的使用劑量并避免其毒性反應(yīng)具有十分重要的意義。本文研究蛇床子素是否能增強(qiáng)腫瘤壞死因子對骨肉瘤細(xì)胞的凋亡能力并研究其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 噻唑藍(lán)（3-（4，5-dimethylthiazol-2-yl）-2，5-diphenyltetrazolium bromide，MTT）、蛇床子素（osthole）、腫瘤壞死因子（TNF-α），Annexin V/PI凋亡檢測試劑盒購于美國Sigma-Aldrich。細(xì)胞蛋白提取液、RIP1（受體相互作用蛋白激酶1）抗體、RIP1泛素蛋白抗體、活化型caspase-8（cleaved caspase-8）抗體、CYLD（頭帕腫瘤綜合征蛋白)抗體和β-actin抗體購于美國Cell Signaling。蛋白G免疫共沉淀瓊脂糖珠購于美國Santa Cruz。CYLD siRNA購于廣州銳博生物科技有限公司。Lipofectamine 2000購于美國Invitrogen。ECL（增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光底物）試劑盒購于美國Pierce。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 人骨肉瘤細(xì)胞系HOS購于美國ATCC（美國模式菌種收集中心）。將細(xì)胞置于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，37°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)并通入5%CO2。

1.3 細(xì)胞活力檢測 將HOS細(xì)胞按5×103/孔接種在96孔板上，分為對照組，TNF-α組，蛇床子素+ TNF-α組和蛇床子素+TNF-α+CYLD siRNA組。對照組為HOS細(xì)胞不加藥物培養(yǎng)48h，蛇床子素組為在HOS細(xì)胞中加入100mol/L的蛇床子素培養(yǎng)48h，TNF-α組為在HOS細(xì)胞中加入10ng/mL的TNF-α培養(yǎng)48h，蛇床子素聯(lián)合TNF-α組為在HOS細(xì)胞中加入100mol/L的蛇床子素和10ng/mL的TNF-α培養(yǎng)48h，蛇床子素+TNF-α+CYLD siRNA組為先將50pmol/mL的 CYLD siRNA用 Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染入HOS細(xì)胞培養(yǎng)24h，之后更換培養(yǎng)基再加入100mol/L的蛇床子素和10ng/mL的TNF-α繼續(xù)培養(yǎng)48h。藥物處理完畢后在培養(yǎng)體系中加入20μL 5g/L MTT再培養(yǎng)4h，棄去上清，往孔中加入150μL

1.4 細(xì)胞凋亡實驗 將HOS細(xì)胞按1×106/孔接種在6孔板上，分為對照組，TNF-α組，蛇床子素+ TNF-α組和蛇床子素+TNF-α+CYLD siRNA組。藥物處理同上。藥物處理完畢后將細(xì)胞用生理鹽水洗滌2次，按照凋亡試劑盒說明書步驟將PI（碘化丙啶）和Annexin-V加入細(xì)胞中孵育20min，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測腫瘤細(xì)胞的凋亡，凋亡率用Annexin-V陽性、PI陰性細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)的百分比表示。

1.5 免疫共沉淀 將HOS細(xì)胞接種在細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，待細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)瓶后進(jìn)行實驗，分組及藥物處理同上。藥物處理完畢后對HOS細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)，取2× 106的各組細(xì)胞用免疫沉淀緩沖液進(jìn)行裂解，緩沖液的成分如下：50mmol/L Tris-HCl（pH 7.4)，1%NP-40細(xì)胞裂解液，150mmol/L NaCl，1mmol/L EDTA，1%混合蛋白酶抑制劑（Sigma-Aldrich）。HOS細(xì)胞在裂解液下處理15min后，將其在12 000g下離心10min，收取上清液并在其中加入RIP1抗體孵育過夜，之后加入蛋白G瓊脂糖珠孵育2h。孵育完成后將其在1200g速度下離心5min，將瓊脂糖珠離心至管底，之后將上清小心吸去，瓊脂糖珠用免疫沉淀緩沖液洗滌2次后加入Western blot上樣緩沖液，沸水浴煮5min后備用，用于檢測與RIP1結(jié)合的泛素蛋白。

1.6 Western blot實驗 將HOS細(xì)胞接種在細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，待細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)瓶后進(jìn)行實驗。實驗分為對照組、蛇床子素組、TNF-α組、蛇床子素+TNF-α組和蛇床子素+TNF-α+CYLD siRNA組,藥物處理同上。藥物處理完畢后將細(xì)胞用生理鹽水洗滌2遍并提取總蛋白質(zhì)。將蛋白提取液或免疫共沉淀處理樣品用12.5%SDS-PAGE進(jìn)行電泳分離。分離完畢后通過電轉(zhuǎn)方法將蛋白質(zhì)從分離膠上轉(zhuǎn)到PVDF膜上，用RIP1泛素蛋白抗體，cleaved caspase-8抗體，CYLD抗體或β-actin抗體孵育過夜，之后再用帶辣根過氧化物酶的二抗孵育2h，蛋白條帶用ECL試劑盒顯色發(fā)光。蛋白灰度值分析用Image J軟件處理。cleaved caspase-8和CYLD、相對表達(dá)水平用蛋白灰度值與β-actin灰度值比值表示。與RIP1結(jié)合的泛素蛋白的相對表達(dá)水平用以下公式計算：泛素蛋白相對表達(dá)水平=灰度值治療組/灰度值對照組。對雙邊t檢驗，P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 蛇床子素通過CYLD途徑顯著提高TNF-α對HOS的凋亡誘導(dǎo)效應(yīng) 將HOS細(xì)胞用蛇床子素和TNF-α處理后用MTT法檢測它們的細(xì)胞活力并用Annexin V/PI染色法檢測細(xì)胞的凋亡。結(jié)果發(fā)現(xiàn)蛇床子素能顯著提高TNF-α對HOS細(xì)胞的殺傷活性和凋亡誘導(dǎo)活性，然而轉(zhuǎn)染CYLD siRNA后蛇床子素對TNF-α的協(xié)同效應(yīng)受到明顯抑制，見表1。

2.2 蛇床子素通過上調(diào)去泛素化酶CYLD的表達(dá)促進(jìn)TNF-α依賴的RIP1去泛素化 為了明確蛇床子素對TNF-α發(fā)揮協(xié)同效應(yīng)的分子機(jī)制，作者進(jìn)行了后續(xù)實驗。通過免疫共沉淀及Western blot實驗我們發(fā)現(xiàn)蛇床子素能顯著促進(jìn)TNF-α依賴的RIP1去泛素化，進(jìn)而顯著活化HOS細(xì)胞內(nèi)的caspase-8誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡。通過進(jìn)一步實驗作者發(fā)現(xiàn)蛇床子素促進(jìn)RIP1蛋白去泛素化的機(jī)制可能和上調(diào)CYLD蛋白的表達(dá)量有關(guān)，將CYLD進(jìn)行基因沉默后，蛇床子素喪失了對RIP1蛋白去泛素化的促進(jìn)作用，同時caspase-8的活化受到了明顯抑制，結(jié)果見表2。

表1 蛇床子素顯著提高TNF-α對HOS細(xì)胞的抗腫瘤活性（±s）

表1 蛇床子素顯著提高TNF-α對HOS細(xì)胞的抗腫瘤活性（±s）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與TNF-α組比較，#P＜0.05；與蛇床子素+TNF-α比較，△P＜0.05。TNF-α：腫瘤壞死因子-α；CYLD siRNA：頭帕腫瘤綜合征蛋白小干擾RNA

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表2 蛇床子素促進(jìn)TNF-α依賴的RIP1蛋白去泛素化（±s）

表2 蛇床子素促進(jìn)TNF-α依賴的RIP1蛋白去泛素化（±s）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與TNF-α組比較，#P＜0.05；與蛇床子素+TNF-α組比較，△P＜0.05。TNF-α：腫瘤壞死因子-α；RIP1：受體相互作用蛋白激酶1；cleaved caspase-8：活化的半胱天冬酶8；CYLD：頭帕腫瘤綜合征蛋白；CYLD siRNA：頭帕腫瘤綜合征蛋白小干擾RNA

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3 討論

蛇床子素是從中藥蛇床子中提取的活性物質(zhì)，具有多種藥理活性。近年研究發(fā)現(xiàn)，蛇床子素除了具有抗?jié)裾?，抗皮膚瘙癢，抗炎癥，抗肝炎等臨床作用外，還具有顯著的抗腫瘤活性[3-5]。TNF-α能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡，因此TNF-α是一種有很好前景的抗腫瘤藥物[6]。然而大劑量TNF-α所誘發(fā)的副作用大大限制了TNF-α的臨床應(yīng)用，因此研究如何提高腫瘤細(xì)胞對TNF-α的敏感性以降低其使用劑量是目前研究工作的重點(diǎn)。本研究顯示蛇床子素能顯著提高TNF-α對骨肉瘤細(xì)胞的殺傷活性和凋亡誘導(dǎo)能力，因此蛇床子素是一種有良好前景的TNF-α輔助治療藥物。

在TNF-α誘導(dǎo)的凋亡通路中，RIP1蛋白的去泛素化是其中的關(guān)鍵步驟。當(dāng)TNF-α與其受體結(jié)合后，細(xì)胞中的RIP1蛋白會發(fā)生去泛素化，繼而形成RIP1依賴的死亡受體復(fù)合物，該復(fù)合物能進(jìn)一步活化caspase-8最終導(dǎo)致凋亡的發(fā)生。在本研究中，筆者首次發(fā)現(xiàn)蛇床子素能顯著促進(jìn)TNF-α依賴的骨肉瘤細(xì)胞RIP1蛋白的去泛素化。當(dāng)腫瘤細(xì)胞中的RIP1蛋白發(fā)生去泛素化后，腫瘤細(xì)胞中的caspase-8發(fā)生顯著活化，且凋亡程度顯著增加，實驗結(jié)果與文獻(xiàn)報道一致[7]，表明蛇床子素能通過RIP1途徑發(fā)揮對TNF-α的協(xié)同作用。

本研究發(fā)現(xiàn)蛇床子素在HOS細(xì)胞中的直接靶點(diǎn)是CYLD蛋白，它能顯著增加骨肉瘤細(xì)胞CYLD的表達(dá)水平。當(dāng)在骨肉瘤細(xì)胞中轉(zhuǎn)染CYLD siRNA抑制CYLD的表達(dá)后，蛇床子素對TNF-α的協(xié)同抗腫瘤作用喪失，證明CYLD的過表達(dá)是蛇床子素發(fā)揮對TNF-α協(xié)同作用的分子機(jī)制。去泛素化酶CYLD是一種腫瘤抑制因子，當(dāng)TNF-α與相應(yīng)受體結(jié)合后，凋亡通路被激活，CYLD被募集到RIP1蛋白周圍并特異性去除RIP1蛋白上的泛素蛋白，從而激活RIP1蛋白依賴的死亡受體復(fù)合物和凋亡信號通路，因此CYLD的表達(dá)水平在一定程度上決定了腫瘤細(xì)胞對TNF-α的敏感性。這些文獻(xiàn)報道[8-9]與本實驗結(jié)果一致，表明蛇床子素增強(qiáng)TNF-α對骨肉瘤細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)活性的機(jī)制可能是通過CYLD/RIP1/caspase-8途徑。

綜上所述，本研究證明蛇床子素能顯著提高骨肉瘤細(xì)胞對TNF-α的敏感性。其機(jī)制是蛇床子素可能通過上調(diào)去泛素化酶CYLD的表達(dá)水平促進(jìn)TNF-α依賴的RIP1蛋白的去泛素化進(jìn)而誘導(dǎo)骨肉瘤細(xì)胞caspase-8的活化和凋亡的發(fā)生。這些研究為如何提高TNF-α的抗腫瘤活性，減少它的治療副作用提供了新的思路和理論依據(jù)。

［1］Rad MP，F(xiàn)attahi Masoum SH，Rad MS，et al.Primary Osteosarcoma of the Sternum：A case Report and Review of the Literature［J］.Arch Bone Jt Surg，2014，2（4）：272-275.

［2］Billiet T，Rutgeerts P，Vermeire S，et al.Targeting TNF-α for the treatment of inflammatory bowel disease［J］.Expert Opin Biol Ther，2014，14（1）：75-101.

［3］Wen YC，Lee WJ，Chien MH，et al.By inhibiting snail signaling and miR-23a-3p，osthole suppresses the EMT-mediated metastatic ability in prostate cancer［J］.Oncotarget， 2015，6（25）：21120-21136.

［4］Lin YC，Lin JC，Way TD，et al.Osthole inhibits insulin-like growth factor-1-induced epithelial to mesenchymal transition via the inhibition of PI3K/Akt signaling pathway in human brain cancer cells［J］.J Agric Food Chem，2014，62（22）：5061-5071.

［5］Gao Z，Wen Q，Zou S.Osthole augments therapeutic efficiency of neural stem cells-based therapy in experimental autoimmune encephalomyelitis［J］.J Pharmacol Sci，2014，124 （1）：54-65.

［6］Xie L，Jiang F，Zhang XK，et al.Honokiol sensitizes breast cancer cells to TNF-α induction of apoptosis by inhibiting Nur77 expression［J］.Br J Pharmacol，2016，173（2）：344-356.

［7］Mahul-Mellier AL，Pazarentzos E，Lin B et al.Deubiquitinating protease USP2a targets RIP1 and TRAF2 to mediate cell death by TNF［J］.Cell Death Differ，2012，19（5）：891-899.

［8］Vanlangenakker N，Vanden Berghe T，Zobel K et al.cIAP1 and TAK1 protect cells from TNF-induced necrosis by preventing RIP1/RIP3-dependent reactive oxygen species production［J］.Cell Death Differ，2011，18（4）：656-665.

［9］Ding Z，Liu Y，Shen A，et al.Spy1 induces de-ubiquitinating of RIP1 arrest and confers glioblastoma's resistance to tumor necrosis factor（TNF-α）-induced apoptosis through suppressing the association ofCLIPR-59 and CYLD［J］. Cell Cycle，2015，14（13）：2149-2159.

（收稿：2016-04-15 修回：2016-05-29）

Osthole Promotes TNF-α-induced Apoptosis in Osteosarcoma and the Underlying Mechanism

WANG Jin->jun. Department of Pediatrics,Central Hospital of Jinhua City,Jinhua(321000),China

ObjectiveTo investigate the role of osthole in TNF-α-induced apoptosis in osteosarcoma and the underlying mechanism.MethodsHOS cells were divided into control group,TNF-α group,osthole group,osthole+TNF-α group,and osthole+TNF-α+CYLD siRNA group.The cell viability,cell apoptosis,ubiquitination of RIP1 protein, and the relative expression of cleaved caspase-8 and CYLD were detected by MTT assay,Annexin V/PI staining,coimmunoprecipitation together with Western Blot,respectively.Results The inhibitory rate of cell viability and the apoptotic rate of cells in TNF-α group group and osthole+TNF-α group were significantly higher than that in control group(12.5%±0.9%,58.6%±3.8%vs 0;8.3%±0.5%,39.9%±2.5%vs 1.9%±0.3%;all P＜0.05).Those index in osthole+ TNF-α+CYLD siRNA group were significantly lower than those in osthole+TNF-α group(22.1%±1.2%vs 58.6%±3.8%; 13.5%±0.9%vs 39.9%±2.5%;all P＜0.05).Compared with control group and TNF-α group,the relative expression of ubiquitin protein conjugated with RIP1 was significantly lower and the relative expression of cleaved caspase-8 was higher in osthole+TNF-α group(RIP1：0.28±0.02 vs 1.00±0.07,0.81±0.06;caspase-8：0.46±0.04 vs 0.01±0.01,0.08±0.02; CYLD：0.81±0.05 vs 0.28±0.02,0.30±0.02;all P＜0.05).The relative expression of ubiquitin protein conjugated with RIP1 in osthole+TNF-α+CYLD siRNA group was significantly higher than that in osthole+TNF-α group(0.77±0.05 vs 0.28±0.02,P＜0.05),indicating that transfection with CYLD siRNA significantly impaired the synergistic effect of osthole on the TNF-α-induced cell death and apoptosis.Conclusion Osthole promotes TNF-α-dependent deubiquitination of RIP1 and the subsequent cleavage of caspase-8 and apoptosis by upregulating the expression of CYLD.

osteosarcoma;osthole;TNF-α;RIP1;deubiquitination;caspase-8;apoptosis

浙江省金華市中心醫(yī)院兒一科（金華 321000）