馬永凱,吳燕燕,李來(lái)好,楊賢慶

(1.中國(guó)海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,山東青島 266003;2.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所,農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東廣州 510300)

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重組大腸桿菌制備珍珠貝源抗氧化肽發(fā)酵條件優(yōu)化

馬永凱1,2,吳燕燕2,*,李來(lái)好2,楊賢慶2

(1.中國(guó)海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,山東青島 266003;2.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所,農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東廣州 510300)

為進(jìn)一步提高實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建的產(chǎn)抗氧化肽重組工程菌株DE3-pEGX6p-1-PFMAP制備珍珠貝源抗氧化肽的制備效率,通過(guò)搖瓶發(fā)酵過(guò)程中發(fā)酵條件包括誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)時(shí)間、IPTG濃度、培養(yǎng)基、搖床轉(zhuǎn)速和接種量的單因素優(yōu)化實(shí)驗(yàn)確定最佳發(fā)酵條件,并進(jìn)一步利用正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化50 L發(fā)酵罐發(fā)酵條件,結(jié)果表明搖瓶和50 L發(fā)酵罐最佳發(fā)酵條件一致,均為誘導(dǎo)溫度30 ℃、誘導(dǎo)時(shí)間4 h、IPTG濃度0.2 mmol/L、培養(yǎng)基pH7、搖床轉(zhuǎn)速220 r/min和接種量5%(v/v)。該工藝操作方便、過(guò)程簡(jiǎn)單、時(shí)間短,能高效制備出目的蛋白,為珠母貝源抗氧化肽的下一步工業(yè)化應(yīng)用提供了有力技術(shù)支撐。

珍珠貝源抗氧化肽,重組大腸桿菌,發(fā)酵條件,優(yōu)化

我國(guó)海域廣闊,橫跨熱帶、亞熱帶、溫帶三個(gè)氣候帶,海洋物種豐富,為科研工作者提供了一個(gè)天然海洋蛋白質(zhì)類(lèi)抗氧化活性物質(zhì)庫(kù)源,進(jìn)而應(yīng)用實(shí)際生產(chǎn)來(lái)改善人民膳食營(yíng)養(yǎng)結(jié)構(gòu)、提高人民的健康生活水平。合浦珠母貝(Pinctadafucata)是我國(guó)海水養(yǎng)殖生產(chǎn)“南珠”的母貝,屬軟體動(dòng)物門(mén)瓣鰓綱珍珠貝目珍珠貝科珠母貝屬,主要分布在廣西、廣東、海南和臺(tái)灣海峽南部沿海、日本沿海一帶。本實(shí)驗(yàn)室利用酶解分離純化技術(shù)從合浦珠母貝貝肉中分離純化出的抗氧化肽(Pinctadafucatameat antioxidant peptides,簡(jiǎn)稱(chēng)PFMAP)[1-2]具有很強(qiáng)的總抗氧化能力、自由基清除能力、羥自由基清除能力等特點(diǎn)[3]。從珠母貝中分離純化出的抗氧化肽在生物機(jī)體清除自由基方面有著不可替代的作用,但由于從珍珠貝肉中酶法制備的抗氧化肽,產(chǎn)量小,很難滿(mǎn)足工業(yè)化生產(chǎn)應(yīng)用的需求。

目前制備抗氧化肽的方法主要有三種:酶解分離純化方法、化學(xué)固相合成方法和基因工程發(fā)酵制備方法。其中利用酶技術(shù)從珍珠貝肉中制備的抗氧化肽產(chǎn)量太小,不利于工業(yè)化生產(chǎn);利用化學(xué)固相合成方法得到高純度的抗氧化肽的技術(shù)較成熟,但存在直接合成的序列短、耗時(shí)、合成效率和純度低、成本高及合成試劑的毒性大等缺點(diǎn)[4-5]?；蚬こ贪l(fā)酵制備方法是近年來(lái)研究的熱點(diǎn),利用DNA重組等技術(shù),將表達(dá)活性肽的基因整合到某種菌中,利用基因工程手段進(jìn)行大規(guī)模的微生物發(fā)酵獲取活性肽,大大提高生產(chǎn)產(chǎn)量、效率,降低生產(chǎn)成本,將是未來(lái)制備抗氧化活性肽等功能活性肽的重要途徑[6-7]。

搖瓶發(fā)酵條件優(yōu)化和中試是科研成果轉(zhuǎn)化生產(chǎn)力的關(guān)鍵。本研究在本實(shí)驗(yàn)室前期研究珍珠貝肉抗氧化肽,獲得抗氧化肽的結(jié)構(gòu)并建重組工程菌基礎(chǔ)上,進(jìn)一步對(duì)前期構(gòu)建的重組工程菌進(jìn)行搖瓶發(fā)酵條件單因素優(yōu)化確定其最佳發(fā)酵培養(yǎng)條件,同時(shí)進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)確定50 L中試發(fā)酵罐最佳發(fā)酵條件,SDS-PAGE電泳檢測(cè)目的蛋白來(lái)驗(yàn)證制備效果,為珍珠貝源抗氧化肽工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)及其在化妝品、保健食品等領(lǐng)域工業(yè)化應(yīng)用提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

重組大腸桿菌DE3-pEGX6p-1-PFMAP來(lái)源于農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保藏;酵母提取物、胰蛋白胨 OXOID公司,葡萄糖、IPTG、DTT、Triton-100、GSH等 Solabio公司;GST瓊脂糖填料 Sangon公司;實(shí)驗(yàn)所用試劑 均為分析純;

蛋白電泳儀 美國(guó)Life invitrogen公司;天能凝膠成像儀 天能公司;發(fā)酵罐 上海百倫生物有限公司;-20 ℃冰箱 海爾公司;恒溫?fù)u床 天津西普器械廠(chǎng)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 發(fā)酵液菌體中目的蛋白的檢測(cè) 將誘導(dǎo)發(fā)酵完成后的發(fā)酵液在4 ℃條件下8000 r/min離心5 min收集菌體,加入預(yù)冷的破碎Buffer緩沖液重懸菌體,然后利用超聲細(xì)胞破碎儀破碎工程菌株重懸液直至液體澄清透明,最后在4 ℃,12000 r/min條件下離心20 min收集上清液和細(xì)胞破碎沉淀物,并用12% SDS-PAGE電泳檢測(cè)目的蛋白[8-9]。

1.2.2 發(fā)酵液相對(duì)生物量的測(cè)定 在工程菌株發(fā)酵培養(yǎng)過(guò)程中,無(wú)菌條件下移液器準(zhǔn)確量取2 mL發(fā)酵液于康寧離心管中,渦旋振蕩混勻后用紫外分光光度計(jì)測(cè)其OD600值以確定其相對(duì)生物量,且以等體積已滅菌的LB培養(yǎng)基作為空白對(duì)照實(shí)驗(yàn)組,重復(fù)三次取平均值[10-11]。

1.2.3 種子液的制備與發(fā)酵罐培養(yǎng) 種子液的制備:將在-20 ℃下貯存的重組大腸桿菌DE3-pEGX6p-1-PFMAP在無(wú)菌條件下用接種環(huán)接種于已滅菌100 mL的LB-氨芐-氯霉素培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中,在220 r/min,37 ℃條件下過(guò)夜培養(yǎng)活化;然后將活化后的工程菌液接種于中試設(shè)備的副發(fā)酵罐制備種子液,在副發(fā)酵罐中培養(yǎng)至發(fā)酵液的OD600值為0.8～1.0,即得種子液[12]。

發(fā)酵罐培養(yǎng):利用無(wú)菌空氣大氣壓差把種子液從副發(fā)酵罐中壓入50 L中試設(shè)備的主發(fā)酵罐中,啟動(dòng)發(fā)酵并把主發(fā)酵罐中的攪拌器的轉(zhuǎn)速設(shè)為220 r/min,罐內(nèi)溫度設(shè)為37 ℃;待工程菌株發(fā)酵培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期加入誘導(dǎo)劑IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng),使加入的誘導(dǎo)劑IPTG在發(fā)酵液中的終濃度為0.2 mmol/L,與此同時(shí)將罐內(nèi)溫度設(shè)為30 ℃以利于工程菌株表達(dá)抗氧化肽;當(dāng)主發(fā)酵罐中誘導(dǎo)結(jié)束后,將發(fā)酵液用蠕動(dòng)泵泵到(固液兩相分離)中試離心機(jī)中,8000 r/min條件下離心5 min收集菌體備用;在此發(fā)酵罐培養(yǎng)過(guò)程中,添加氨芐青霉素、氯霉素和誘導(dǎo)劑IPTG都需在無(wú)菌條件下操作以防止空氣中微生物的污染[13]。

1.2. 4 搖瓶發(fā)酵過(guò)程中發(fā)酵條件優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

1.2. 4. 1 誘導(dǎo)溫度的優(yōu)化 將過(guò)夜活化后的重組大腸桿菌DE3-pEGX6p-1-PFMAP發(fā)酵液在無(wú)菌條件下接種入含有500 mL已滅菌LB-氨芐-氯霉素培養(yǎng)基的1000 mL三角瓶中,220 r/min、37 ℃培養(yǎng)至發(fā)酵液OD600值在0.8左右時(shí)在操鏡臺(tái)中加入IPTG,分別在不同溫度條件下誘導(dǎo)表達(dá),一定時(shí)間后離心收集菌體并利用細(xì)胞破碎儀破碎細(xì)胞,再經(jīng)離心收集上清液和細(xì)胞破碎沉淀物,最后以12% SDS-PAGE電泳檢測(cè)目的蛋白表達(dá)量來(lái)確定最佳誘導(dǎo)溫度。

1.2. 4. 2 誘導(dǎo)時(shí)間的優(yōu)化 將活化后的重組大腸桿菌發(fā)酵液接種入含有500 mL培養(yǎng)基的1000 mL三角瓶中,220 r/min、37 ℃培養(yǎng)至發(fā)酵液OD600值在0.8左右時(shí)加入IPTG誘導(dǎo)表達(dá),在此誘導(dǎo)發(fā)酵過(guò)程中分別在不同誘導(dǎo)時(shí)間取20 mL發(fā)酵液于50 mL離心管中,與此同時(shí)在每次取樣后用已滅菌的LB-氨芐-氯霉素培養(yǎng)基補(bǔ)足并繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng),發(fā)酵液菌體中目的蛋白的檢測(cè)方法同1.2.1,最后以12% SDS-PAGE電泳檢測(cè)目的蛋白的表達(dá)量來(lái)確定最佳誘導(dǎo)時(shí)間[14-15]。

1.2. 4. 3 IPTG濃度的優(yōu)化 將活化后的重組大腸桿菌發(fā)酵液接種入含有500 mL培養(yǎng)基的1000 mL三角瓶中,220 r/min、37 ℃培養(yǎng)至發(fā)酵液OD600值在0.8左右后,無(wú)菌條件下向不同的三角瓶中加入不同終濃度的IPTG誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)表達(dá),在發(fā)酵誘導(dǎo)表達(dá)完成后結(jié)束發(fā)酵并離心收集菌體,與此同時(shí)以未加入IPTG誘導(dǎo)的發(fā)酵液在相同條件下培養(yǎng)作為陰性對(duì)照組,利用1.2.1的目的蛋白檢測(cè)方法檢測(cè)目的蛋白的表達(dá)量來(lái)確定最佳誘導(dǎo)IPTG濃度[16-17]。

1.2. 4. 4 培養(yǎng)基pH的優(yōu)化 將活化后的重組大腸桿菌發(fā)酵液接種入不同pH的500 mL培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng),培養(yǎng)過(guò)程中每隔1 h取等體積發(fā)酵液后測(cè)其相對(duì)生物量,與此同時(shí)以等體積的LB-氨芐-氯霉素培養(yǎng)基補(bǔ)足發(fā)酵液繼續(xù)發(fā)酵,取樣過(guò)程應(yīng)在操鏡臺(tái)中進(jìn)行以防止空氣中微生物的交叉污染;測(cè)發(fā)酵液相對(duì)生物量方法參照1.2.2,重復(fù)三次取平均值,并以相對(duì)生物量的值在不同培養(yǎng)基pH的大小和生長(zhǎng)趨勢(shì)確定最佳培養(yǎng)基的pH。

1.2. 4. 5 搖床轉(zhuǎn)速的優(yōu)化 將活化后的重組大腸桿菌發(fā)酵液在無(wú)菌條件下接種入含有500 mL已滅菌的LB-氨芐-氯霉素培養(yǎng)基于1000 mL三角瓶中,在相同溫度條件下放入不同搖床轉(zhuǎn)速的搖床中發(fā)酵培養(yǎng),培養(yǎng)過(guò)程中在每隔1 h取等體積發(fā)酵液后測(cè)其相對(duì)生物量并用等體積LB-氨芐-氯霉素培養(yǎng)基補(bǔ)足發(fā)酵液繼續(xù)發(fā)酵,測(cè)發(fā)酵液相對(duì)生物量方法參照1.2.2,重復(fù)三次取平均值,并以相對(duì)生物量的值在不同搖床轉(zhuǎn)速的大小確定最佳搖床轉(zhuǎn)速。

1.2. 4. 6 接種量的優(yōu)化 將活化后的重組大腸桿菌發(fā)酵液在無(wú)菌條件下以不同的接種量接種入含有500 mL已滅菌的LB-氨芐-氯霉素培養(yǎng)基的1000 mL三角瓶中發(fā)酵培養(yǎng),培養(yǎng)過(guò)程中每隔1 h取等體積發(fā)酵液后測(cè)其相對(duì)生物量并用等體積LB-氨芐-氯霉素補(bǔ)足發(fā)酵液繼續(xù)發(fā)酵,測(cè)發(fā)酵液相對(duì)生物量方法參照1.2.2,重復(fù)三次取平均值,并以在不同接種量后發(fā)酵過(guò)程中相對(duì)生物量值的大小確定其最佳接種量[18-19]。

1.2.5 50 L中試發(fā)酵罐最佳發(fā)酵條件的正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化 利用正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案將單因素優(yōu)化的接種量、搖床轉(zhuǎn)速和培養(yǎng)基pH7對(duì)應(yīng)的培養(yǎng)時(shí)間進(jìn)行四因素三水平的正交實(shí)驗(yàn)[10],見(jiàn)表1。按照正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案中對(duì)應(yīng)的條件參數(shù)進(jìn)行中試發(fā)酵培養(yǎng),發(fā)酵結(jié)束后參照方法1.2.2測(cè)其相對(duì)生物量,重復(fù)三次取平均值;最后以正交分析結(jié)果確定中試發(fā)酵罐的最佳發(fā)酵條件。

表1 正交實(shí)驗(yàn)(L9(34))因素水平
Table 1 Factors and levels of L9(34)orthogonal test

水平因素A接種量(v/v)%B搖床轉(zhuǎn)速(r/min)C誘導(dǎo)時(shí)間(h)1116012522023102804

最后利用12% SDS-PAGE電泳檢測(cè)正交實(shí)驗(yàn)最佳方案對(duì)應(yīng)發(fā)酵液中目的蛋白的表達(dá)情況來(lái)驗(yàn)證50 L中試發(fā)酵罐最佳發(fā)酵條件。

1.3 數(shù)據(jù)處理方法

發(fā)酵條件優(yōu)化實(shí)驗(yàn)過(guò)程中每組數(shù)據(jù)重復(fù)三次并利用Excel軟件求平均值和誤差分析,然后利用Excel2010軟件做圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 搖瓶發(fā)酵過(guò)程中發(fā)酵條件的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 誘導(dǎo)溫度的確定 在利用工程菌株制備抗氧化肽的發(fā)酵過(guò)程中,一般情況下誘導(dǎo)溫度越低,越容易保留外源蛋白的天然構(gòu)象從而保留其抗氧化活性,溫度的升高則會(huì)加大誘導(dǎo)目的蛋白形成包涵體的可能[20-21]。本實(shí)驗(yàn)分別在20 ℃條件下誘導(dǎo)過(guò)夜12 h、30 ℃條件下誘導(dǎo)培養(yǎng)6 h、37 ℃條件下誘導(dǎo)培養(yǎng)6 h。結(jié)果如圖1,在35 ku蛋白分子量附近1～6道泳道均有明顯的目的蛋白電泳條帶,這與目的蛋白理論分子量33 ku相符,說(shuō)明在三個(gè)不同誘導(dǎo)溫度條件下目的蛋白被成功表達(dá)出;且隨著溫度升高蛋白表達(dá)量成遞減趨勢(shì),原因可能是由于在誘導(dǎo)表達(dá)PFMAP發(fā)酵過(guò)程中隨著溫度的升高導(dǎo)致蛋白酶活性升高加劇目的蛋白的降解[22-23];圖1中在30 ℃誘導(dǎo)溫度下的目的蛋白對(duì)應(yīng)的上清和細(xì)胞破碎沉淀物的電泳條帶顯示其表達(dá)量介于20 ℃和37 ℃之間,考慮到三個(gè)溫度中20 ℃誘導(dǎo)時(shí)間長(zhǎng)、37 ℃目的蛋白降解最嚴(yán)重兩個(gè)原因,最終確定30 ℃為最佳誘導(dǎo)溫度。

圖1 搖瓶中不同誘導(dǎo)溫度下PFMAP表達(dá)量的SDS-PAGE圖Fig.1 SDS-PAGE of preparation of PFMAP in the shake flask with different induction temperature注:M:蛋白marker;1:20 ℃誘導(dǎo)溫度后上清液;2:20 ℃誘導(dǎo)溫度后細(xì)胞破碎沉淀物;3:30 ℃誘導(dǎo)溫度后上清液;4:30 ℃誘導(dǎo)溫度后細(xì)胞破碎沉淀物;5:37 ℃誘導(dǎo)溫度后上清液;6:37 ℃誘導(dǎo)溫度后細(xì)胞破碎沉淀物。

2.1.2 誘導(dǎo)時(shí)間的確定 當(dāng)發(fā)酵液的OD600值達(dá)到0.8時(shí)加入IPTG在30 ℃、220 r/min條件下誘導(dǎo)表達(dá),并分別在誘導(dǎo)表達(dá)1、2、3、4、5、6、7 h后分別取樣且以SDS-PAGE檢測(cè)目的蛋白表達(dá)量,結(jié)果如圖2所示。由圖2可以得知,目的蛋白的表達(dá)量隨著誘導(dǎo)時(shí)間的增加而增大;誘導(dǎo)時(shí)間在1～4 h范圍內(nèi)隨著誘導(dǎo)時(shí)間的增加,目的蛋白含量增長(zhǎng)較快,而在4～7 h誘導(dǎo)時(shí)間發(fā)酵過(guò)程中,目的蛋白含量增速較小,這說(shuō)明在誘導(dǎo)時(shí)間4 h后工程菌株進(jìn)入穩(wěn)定期。考慮到隨著誘導(dǎo)時(shí)間的增加加劇目的蛋白的降解,因此綜合考慮確定4 h作為最佳誘導(dǎo)時(shí)間。

圖2 搖瓶中不同誘導(dǎo)時(shí)間下PFMAP表達(dá)量的SDS-PAGE圖Fig.2 SDS-PAGE of preparation of PFMAP in the shake flask with different induction time注:M:蛋白marker;1:誘導(dǎo)表達(dá)1 h上清液;2:誘導(dǎo)表達(dá)2 h上清液;3:誘導(dǎo)表達(dá)3 h上清液;4:誘導(dǎo)表達(dá)4 h上清液;5:誘導(dǎo)表達(dá)5 h上清液;6:誘導(dǎo)表達(dá)6 h上清液;7:誘導(dǎo)表達(dá)7 h上清液。

2.1.3 IPTG濃度的確定 在操鏡臺(tái)中向待誘導(dǎo)表達(dá)的發(fā)酵液中加入終濃度分別為0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0 mmol/L,的IPTG誘導(dǎo)劑,30 ℃,220 r/min誘導(dǎo)培養(yǎng)至發(fā)酵結(jié)束后破碎細(xì)胞并離心收集上清并用12% SDS-PAGE檢測(cè)目的蛋白表達(dá)量,蛋白電泳結(jié)果如圖3所示。由圖3可知,陰性對(duì)照組1道未發(fā)現(xiàn)目的電泳條帶,這說(shuō)明未加入IPTG誘導(dǎo)的工程菌株沒(méi)有表達(dá)目的蛋白;而實(shí)驗(yàn)組2～10道在35 ku附近均有明顯條帶,說(shuō)明目的蛋白加入IPTG后被成功表達(dá),其中3道電泳條帶對(duì)應(yīng)的IPTG終濃度為0.2 mmol/L和7道電泳條帶對(duì)應(yīng)的IPTG終濃度為0.7 mmol/L的目的蛋白表達(dá)量明顯高于其它實(shí)驗(yàn)組,這與趙金星等[13]通過(guò)優(yōu)化IPTG濃度在重組大腸工程菌株過(guò)程中隨著IPTG濃度升高而導(dǎo)致活性降低和表達(dá)量下降的結(jié)果相符。因此,綜合考慮IPTG自身的毒性和經(jīng)濟(jì)成本原因確定最佳IPTG誘導(dǎo)濃度為0.2 mmol/L。

圖3 搖瓶中不同誘導(dǎo)IPTG濃度下PFMAP表達(dá)量的SDS-PAGE圖Fig.3 SDS-PAGE of preparation of PFMAP in the shake flask with different concentration of IPTG注:M:蛋白marker;1:未加入IPTG誘導(dǎo);2:IPTG濃度0.2 mmol/L;3:IPTG濃度0.3 mmol/L;4:IPTG濃度0.4 mmol/L;5:IPTG濃度0.5 mmol/L;6:IPTG濃度0.6 mmol/L;7:IPTG濃度0.7 mmol/L;8:IPTG濃度0.8 mmol/L;9:IPTG濃度0.9 mmol/L;10:IPTG濃度1.0 mmol/L。

2.1.4 培養(yǎng)基pH的確定 不同的培養(yǎng)基pH、搖床轉(zhuǎn)速和接種量可以影響培養(yǎng)過(guò)程中工程菌相對(duì)生物量。對(duì)于培養(yǎng)基pH進(jìn)行單因素優(yōu)化,將活化后的發(fā)酵液分別接入pH5、pH7和pH9的培養(yǎng)基中培養(yǎng)并每隔1 h取發(fā)酵液測(cè)其相對(duì)生物量,結(jié)果如圖4所示。由圖4中可以看出隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng),三種不同培養(yǎng)基pH發(fā)酵液中的菌株相對(duì)生物量都是增大的,而且在3～4 h區(qū)間增加最快,說(shuō)明這段時(shí)間應(yīng)該是菌株處于生長(zhǎng)周期的對(duì)數(shù)期,菌株代謝和活力最佳;在4～8 h培養(yǎng)時(shí)間范圍內(nèi)工程菌相對(duì)生物量變化不大,原因是加入的IPTG誘導(dǎo)劑的毒性使得工程菌生長(zhǎng)緩慢和工程菌處于生長(zhǎng)周期的穩(wěn)定期;培養(yǎng)基處于酸性環(huán)境5和堿性環(huán)境9時(shí)的發(fā)酵液相對(duì)于中性環(huán)境7相對(duì)生物量少;工程菌在酸性環(huán)境中相對(duì)生物量值比在堿性環(huán)境大。陳曉平等[12]的在抗菌肽的發(fā)酵條件優(yōu)化過(guò)程中也發(fā)現(xiàn)在不同pH環(huán)境下產(chǎn)量會(huì)隨著酸堿環(huán)境的變化而變化,這是由于不同結(jié)構(gòu)肽鏈本身的酸堿性質(zhì)導(dǎo)致。因此,綜合考慮隨著發(fā)酵過(guò)程的時(shí)間延長(zhǎng),微生物的代謝產(chǎn)物如二氧化碳勢(shì)必會(huì)造成培養(yǎng)基環(huán)境的偏酸性,因此搖瓶發(fā)酵的最佳培養(yǎng)基pH確定為7。

圖4 不同的培養(yǎng)基pH對(duì)工程菌相對(duì)生物量的影響Fig.4 Effects of different culture medium pH to biomass of recombined bacteria

2.1.5 搖床轉(zhuǎn)速的確定 對(duì)于發(fā)酵過(guò)程中的搖床轉(zhuǎn)速進(jìn)行單因素優(yōu)化,將活化后的發(fā)酵液接種入三角瓶中后分別放入轉(zhuǎn)速設(shè)置為160、220、280 r/min的搖床中培養(yǎng),每隔1 h取發(fā)酵液測(cè)其相對(duì)生物量結(jié)果如圖5所示。由圖5中可以看出在1～4 h發(fā)酵時(shí)間中,三種不同搖床轉(zhuǎn)速的菌株相對(duì)生物量都是增大的,而且在3～4 h區(qū)間增加最快,說(shuō)明菌株此時(shí)處于菌株代謝和活力最佳的對(duì)數(shù)期;其中,轉(zhuǎn)速220 r/min和280 r/min相對(duì)于160 r/min在發(fā)酵培養(yǎng)4 h后的相對(duì)生物量有明顯的差異,而220 r/min和280 r/min在發(fā)酵4 h后二者的相對(duì)生物量相差不大;然而,由于轉(zhuǎn)速越高,在搖瓶實(shí)驗(yàn)或者中試實(shí)驗(yàn)中會(huì)由于機(jī)械運(yùn)動(dòng)產(chǎn)熱使得發(fā)酵液中心溫度升高,因此綜合考慮確定最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)轉(zhuǎn)速為220 r/min。

圖5 不同的搖床轉(zhuǎn)速(B)對(duì)工程菌相對(duì)生物量的影響Fig.5 Effects of different shaker speed to biomass of recombined bacteria

2.1.6 接種量的確定 對(duì)于接種量進(jìn)行單因素優(yōu)化,將活化后的發(fā)酵液按照1%(v/v)、5%(v/v)和10%(v/v)的接種量分別接種入三角瓶中后發(fā)酵培養(yǎng),并每隔1 h取發(fā)酵液測(cè)其相對(duì)生物量結(jié)果如圖6所示。由圖可以看出在1～4 h發(fā)酵時(shí)間中,三種不同接種量的菌株相對(duì)生物量都是增大的,且相對(duì)生物量大小與接種量成正比;在發(fā)酵培養(yǎng)4 h后,接種量5%(v/v)和10%(v/v)的發(fā)酵液生物量慢慢接近;然而越大的接種量對(duì)于接種后培養(yǎng)基的pH有一定的影響,一般情況下接種量越大,起始發(fā)酵液的pH越小,因此綜合考慮確定最佳接種量為5%(v/v)。

圖6 不同的接種量對(duì)工程菌相對(duì)生物量的影響Fig.6 Effects of different inoculum size production to biomass of recombined bacteria

在搖瓶發(fā)酵過(guò)程,影響目的蛋白和生物量的6個(gè)影響因素,經(jīng)單因素優(yōu)化實(shí)驗(yàn)可知誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)時(shí)間和IPTG濃度由于對(duì)目的蛋白活性和表達(dá)量影響較大,而培養(yǎng)基pH、搖床轉(zhuǎn)速和接種量對(duì)工程菌的發(fā)酵密度影響較大。而在中試放大實(shí)驗(yàn)研究中,對(duì)于目的蛋白活性和表達(dá)量則不需要另外優(yōu)化,但是從搖瓶實(shí)驗(yàn)放大至中試實(shí)驗(yàn)的參數(shù)使得工程菌的相對(duì)生物量的變化較大,因此對(duì)于影響生物量的培養(yǎng)基pH、搖床轉(zhuǎn)速、接種量三個(gè)因素有必要進(jìn)行50 L發(fā)酵罐中試正交實(shí)驗(yàn),確保中試發(fā)酵罐能快速高效率地制備出PFMAP。由圖4可見(jiàn)培養(yǎng)基pH影響發(fā)酵液中生物量變化也是與培養(yǎng)時(shí)間密切相關(guān)的,考慮到中試實(shí)驗(yàn)和實(shí)際生產(chǎn)過(guò)程中培養(yǎng)基pH是較難控制的,因此選取搖床轉(zhuǎn)速、接種量和培養(yǎng)時(shí)間進(jìn)行三因素三水平的正交實(shí)驗(yàn)確定最佳中試發(fā)酵條件。

2.2 50 L中試發(fā)酵罐最佳發(fā)酵條件的正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表2 正交實(shí)驗(yàn)(L9(33))優(yōu)化中試發(fā)酵條件結(jié)果
Table 2 Results of L9(33)orthogonal array design of pilot scale fermentation condition

實(shí)驗(yàn)A接種量(v/v)%B搖床轉(zhuǎn)速(r/min)C培養(yǎng)時(shí)間(h)工程菌相對(duì)生物量(OD600)111100222130863312032412201252230926321016713305682310089332037k1023040009-k2062040027-k3028034078-R039006069-最佳優(yōu)化方案A2B2C3

由2.1搖瓶中單因素優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果選出搖床轉(zhuǎn)速、接種量和培養(yǎng)時(shí)間按照表2中的四因素三水平設(shè)計(jì)方案對(duì)應(yīng)的接種量,搖床轉(zhuǎn)速和培養(yǎng)時(shí)間條件依次進(jìn)行發(fā)酵罐中試實(shí)驗(yàn),發(fā)酵結(jié)束后取發(fā)酵液測(cè)其工程菌相對(duì)生物量,然后利用公式求出三因素相對(duì)應(yīng)k值和極差R,結(jié)果如表2所示。表2結(jié)果中的極差R表明接種量(A),搖床轉(zhuǎn)速(B)和培養(yǎng)時(shí)間(C)三個(gè)培養(yǎng)因素對(duì)于工程菌相對(duì)生物量的影響大小依次為:C>A>B;同時(shí)相對(duì)生物量結(jié)果顯示A2B2C3的結(jié)果是優(yōu)于其它8組實(shí)驗(yàn)組;另外,需要注意的是極差分析A2B1C3實(shí)驗(yàn)組與最佳培養(yǎng)條件A2B2C3一致,這與搖床轉(zhuǎn)速對(duì)于工程菌生物量的影響是最小的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符;因此通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化確定50 L中試發(fā)酵罐最佳發(fā)酵條件是誘導(dǎo)時(shí)間4 h、搖床轉(zhuǎn)速220 r/min和接種量5%(v/v),這也證明了搖瓶的最佳發(fā)酵條件適合中試發(fā)酵條件。

圖7 50L中試最佳發(fā)酵條件下PFMAP表達(dá)量的SDS-PAGE圖Fig.7 SDS-PAGE of preparation of NPFMAP in the pilot-scale production(50L)注:M:蛋白Marker,1:正交實(shí)驗(yàn)最佳方案上清液。

按照正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果的最佳方案發(fā)酵制備PFMAP,OD600為0.95，利用12% SDS-PAGE電泳檢測(cè)發(fā)酵液中目的蛋白的表達(dá)情況,結(jié)果如圖7所示,表明中試發(fā)酵放大實(shí)驗(yàn)成功制備出目的蛋白;且該工藝便于操作,過(guò)程簡(jiǎn)單,時(shí)間短,這可以為目的蛋白的下一步的純化和應(yīng)用提供很大幫助。

3 結(jié)論

通過(guò)搖瓶中發(fā)酵條件6個(gè)影響因素包括誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)時(shí)間、IPTG濃度、培養(yǎng)基pH、搖床轉(zhuǎn)速、接種量進(jìn)行單因素優(yōu)化實(shí)驗(yàn),得到搖瓶發(fā)酵最佳條件為:誘導(dǎo)溫度為30 ℃、誘導(dǎo)時(shí)間4 h、添加IPTG誘導(dǎo)濃度為0.2 mmol/L、培養(yǎng)基pH為7、搖床轉(zhuǎn)速為220 r/min和接種量為5%(v/v)。

通過(guò)正交優(yōu)化實(shí)驗(yàn),獲得50 L中試發(fā)酵罐最佳發(fā)酵條件為:誘導(dǎo)溫度為30 ℃、IPTG誘導(dǎo)濃度0.2 mmol/L、培養(yǎng)基pH7、誘導(dǎo)時(shí)間4 h、搖床轉(zhuǎn)速220 r/min和接種量5%(v/v),該條件下可以有效制備目的蛋白,工程菌生物量OD600值達(dá)到0.95。優(yōu)化得到的重組大腸桿菌制備珍珠貝源抗氧化肽的發(fā)酵工藝簡(jiǎn)單,發(fā)酵效率高,中試放大效果良好,這為下一步珍珠貝源抗氧化肽的應(yīng)用提供技術(shù)支撐。

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Study on optimization of fermentation conditions for preparing antioxidant peptides of Pinctada fucata by recombinant E.coil

MA Yong-kai1,2,WU Yan-yan2,*,LI Lai-hao2,YANG Xian-qing2

(1.College of Food Science and Engineering,Ocean University of China,Qingdao 266003,China; 2.Key Laboratory of Aquatic Product Processing,Ministry of Agriculture;South China Sea Fisheries Research Institute,Chinese Academy of Fishery Science,Guangzhou 510300,China)

In order to improve the efficiency of preparing antioxidant peptides ofPinctadafucataby recombinantE.coil(DE3-pEGX6p-1-PFMAP),fermentation factors including induction temperature,induction time,concentration of IPTG,culture medium pH,shaker speed and inoculum size were optimized respectively in shake flask. Furthermore,the orthogonal experiment for the pilot-scale was optimized. Results showed that the best fermentation conditions of both shaking flask and orthogonal experiment,including induction temperature,induction time,concentration of IPTG,culture medium pH,shaker speed and inoculum size were 30 ℃,4 h,0.2 mmol/L,pH7,220 r/min,5%(v/v)respectively. And the process in this study was easy to operate and take a shorter time,which help further industrial application for preparing the antioxidant peptides ofPinctadafucataby recombinantE.coil.

antioxidant peptides ofPinctadafucata;recombinantE.coil;fermentation conditions;optimization

2016-07-08

馬永凱(1989-)，男，碩士研究生，研究方向：水產(chǎn)品加工與功能制品，E-mail:mayongkai2014@163.com。

*通訊作者:吳燕燕(1969-)，博士，研究員，研究方向：水產(chǎn)品加工與質(zhì)量安全控制,E-mail:wuyygd@163.com。

國(guó)家海洋局海洋公益性行業(yè)科研專(zhuān)項(xiàng)(201305018);廣東省海洋漁業(yè)科技與產(chǎn)業(yè)發(fā)展專(zhuān)項(xiàng)(Z2015008); 廣東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2016A030313144)。

TS254.5

A

1002-0306(2016)23-0124-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.23.015