李思夢,高風正,曾名湧

(中國海洋大學食品科學與工程學院,山東青島 266003)

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聚球藻7002藻藍蛋白的分離純化研究

李思夢,高風正,曾名湧*

(中國海洋大學食品科學與工程學院,山東青島 266003)

本文研究了聚球藻7002藻藍蛋白的分離純化工藝,為提高聚球藻7002藻藍蛋白的純度和提取率提供一定技術指導。采用組織搗碎法、超聲波法、反復凍融法對細胞進行破碎提取藻藍蛋白,比較了不同破壁法提取藻藍蛋白的純度和總蛋白提取率,采用響應面法確定了最佳破壁條件,通過硫酸銨鹽析、羥基磷灰石層析法提純藻藍蛋白,對結果進行SDS電泳鑒定。實驗顯示反復凍融法破壁效果最佳,響應面實驗確定了最佳破壁條件為菌體濃度3.53 mg/mL、凍融次數(shù)6次、解凍溫度37 ℃、最佳鹽析濃度為硫酸銨55%,經(jīng)羥基磷灰石層析后藻藍蛋白純度可達3.79。最終本實驗得到了分離純化聚球藻7002藻藍蛋白的最佳工藝方法。

聚球藻7002,藻藍蛋白,反復凍融,響應面優(yōu)化,分離純化

微藻是一種光合自養(yǎng)微生物,是生產(chǎn)藥品、食品高價值生物活性物質(zhì)和生物燃料的細胞“工廠”[1]。藍細菌聚球藻在海洋浮游植物中占有優(yōu)勢組分的地位。聚球藻7002(Synechococcussp.PCC7002)是一種單細胞藍藻生物,是一類超微型(0.5～2 μm)球粒狀光合自養(yǎng)原核生物[2],是海洋微藻的重要組成部分,全球碳循環(huán)的主要參與者和初級生產(chǎn)力的主要貢獻者之一[3]。聚球藻 7002(Synechococcussp.PCC7002)是目前發(fā)現(xiàn)的細胞倍增時間最短的藍細菌,是發(fā)酵生產(chǎn)海洋活性物質(zhì)的理想生物反應器。本文對聚球藻7002進行了成分測定,發(fā)現(xiàn)其蛋白質(zhì)含量高達40%以上,是獲得海洋活性蛋白質(zhì)的理想原料。

藻藍蛋白(C-Phycocyanin,C-PC)是藻類中一種重要生理活性的色素蛋白,它常見于藍藻中,是藻膽蛋白中的一種。藻藍蛋白在藻體中以藻膽蛋白體的形式存在,藻膽蛋白體由多種藻膽蛋白及連接蛋白或多肽組成。藻膽蛋白是強熒光的色素-蛋白絡合物,是藻體中重要的捕光色素蛋白。目前的研究發(fā)現(xiàn),藻藍蛋白包含一個蛋白和一個發(fā)色團,蛋白是由相對分子量分別在18 ku和20 ku的α和β亞基組成,其單體(αβ)分子共含有3個發(fā)色團,分別位于α亞基的Cys84和β亞基的Cys84,Cys155。α和β亞基通過分子間的各種相互作用力先形成單體(αβ),單體之間借助連接多肽的作用再聚合成(αβ)3和(αβ)6。藻藍蛋白的亞基主要以三聚體和六聚體形式存在,此外還有二聚體和比六聚體聚集度更高的聚集體[4]。藻藍蛋白作為天然色素蛋白在藥物和食品領域以及免疫學、細胞學等方面有重要應用。大量體外和體內(nèi)實驗發(fā)現(xiàn)其通過驅除自由基從而表現(xiàn)出抗炎活性[5-6],研究還發(fā)現(xiàn)其具有一定的抗癌活性。此外,藻藍蛋白具有較高的促紅細胞生成素活性,有刺激骨髓造血的功效。

目前,國內(nèi)外關于藻藍蛋白的研究主要集中在螺旋藻,其分離純化方法主要有以下幾種:硫酸銨鹽析與多次柱層析結合、等電點沉降法、十二烷基苯磺酸鈉處理與柱層析結合分離法、氯化鉀溶菌酶聯(lián)合處理法或凍融法、分段梯度鹽析與柱層析結合分離法、雙水相萃取與離子交換層析結合分離法等[7]。關于聚球藻7002藻藍蛋白提取分離純化研究相對匱乏,本文以實驗室培養(yǎng)得到的聚球藻7002藻粉為原料,對藻藍蛋白進行提取純化,尋找聚球藻7002藻藍蛋白的最優(yōu)提取工藝,以期為聚球藻7002開發(fā)利用提供科學指導。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

聚球藻7002干粉 聚球藻7002(Synechococcussp. PCC 7002)由北京大學生命科學學院趙進東院士惠贈。聚球藻7002培養(yǎng)于優(yōu)化后的Medium A中,并在培養(yǎng)基中添加1 g/L半乳糖,以照明日光燈做光源全光照于光生物反應器中培養(yǎng),培養(yǎng)8 d到達對數(shù)期后收集藻粉冷凍干燥儲存。

硫酸銨、氯化鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、氯化鉀、冰醋酸、丙烯酰胺、十二烷基硫酸鈉、羥基磷灰石 均購于國藥集團化學試劑有限公司,其他試劑 均為國產(chǎn)分析純。

TGL-20B型高速臺式離心機 上海安亭科學儀器廠;Power Wave XS2型酶標儀 Gene Company Limited;PHS-3C型精密pH計 上海雷磁儀器廠;JY92-2D 型超聲波細胞粉碎儀 上海安亭科學儀器廠;DK-420 型電熱水浴鍋 上海第二分析儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 聚球藻7002的培養(yǎng)及藻粉的獲取 挑取聚球藻7002接種于優(yōu)化好的 Medium A[8]液體培養(yǎng)基中,并添加1 g/L半乳糖,調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH7.5,裝瓶量30%,搖速 150 r/min,溫度32 ℃,光照強度光強100 μE/(m2·s),以照明日光燈做光源全光照培養(yǎng)至對數(shù)生長期后收集并冷凍干燥以獲取優(yōu)質(zhì)藻粉。

1.2.2 聚球藻7002蛋白質(zhì)總量測定 利用凱氏定氮法測定聚球藻7002中的總蛋白含量。

1.2.3 提取液中蛋白含量測定 通過實驗確定的最佳破碎方法對聚球藻7002藻粉進行破碎,離心獲取上清液即為提取液。采用福林酚法對提取液進行蛋白含量測定,按照試劑盒說明進行操作,設置三組平行實驗,以標準牛血清蛋白的質(zhì)量濃度(0、25、50、100、150、200、250 μg/mL)為橫坐標,OD640值為縱坐標繪制標準曲線,作為定量的依據(jù)。

1.2.4 細胞破碎方法

1.2.4.1 組織搗碎法破碎聚球藻7002 稱取一定質(zhì)量的聚球藻7002干粉,加入10 mmol/L pH7.0的磷酸鹽緩沖液使藻體溶液濃度達到2 mg/mL,在4 ℃條件下將組織搗碎機按轉10 s,停20 s,重復搗碎40次,取出藻體溶液在4 ℃下10000 r/min,離心15 min,取上清測定吸光值(A280、A620、A650)。

1.2.4.2 不同超聲功率破碎聚球藻7002 按1.2.4.1制備藻體溶液,并等體積分裝在21個相同的離心管中,用超聲波破碎儀冰浴超聲藻體溶液,將功率分別設置為50、100、200、300、400、500、600 W,工作10 s,間歇5 s,超聲時間為20 min。4 ℃下10000 r/min離心15 min,取上清測定吸光值(A280、A620、A650)。

1.2.4.3 反復凍融法破碎聚球藻7002 按1.2.4.1制備藻體溶液,攪拌均勻后在-20 ℃冰箱中冷凍90 min,30 ℃的恒溫水浴鍋中溶解,反復凍融6次。4 ℃下10000 r/min離心15 min,取上清測定吸光值(A280、A620、A650)。

1.2.5 單因素實驗設計 通過單因素實驗,分別考察不同菌體濃度、凍融次數(shù)、解凍溫度對聚球藻7002藻藍蛋白純度和總蛋白提取率的影響。

1.2.5.1 菌體濃度對聚球藻7002藻藍蛋白純度和蛋白提取率的影響 固定凍融次數(shù)為6次,解凍溫度30 ℃,菌體濃度分別為0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5 mg/mL的條件下提取聚球藻7002藻藍蛋白。

1.2.5.2 凍融次數(shù)對聚球藻7002藻藍蛋白純度和蛋白提取率的影響 固定菌體濃度為2 mg/mL,解凍溫度為30 ℃,凍融次數(shù)分別為2、3、4、5、6、7、8次的條件下提取聚球藻7002藻藍蛋白。

1.2.5.3 解凍溫度對聚球藻7002藻藍蛋白純度和蛋白提取率的影響 固定菌體濃度為2 mg/mL,凍融次數(shù)為6次,解凍溫度分別為10、15、20、25、30、35、40、45、50 ℃的條件下提取聚球藻7002藻藍蛋白。

1.2.6 響應面實驗設計 本實驗采用Design Expert8.0軟件中的Box-behnken design(BBD)設計原理[9]設計響應面實驗。根據(jù)單因素實驗結果,選取菌體濃度、凍融次數(shù)、解凍溫度3個因素作為實驗因素,以藻藍蛋白純度和總蛋白質(zhì)提取率為響應值設計實驗,以期獲得最優(yōu)破碎條件[10],實驗因素及水平見表1。

表1 響應曲面分析因素與水平
Table 1 Factors and level of the response surface methodology

因素水平-101A菌體濃度(mg/mL)1537560B凍融次數(shù)(次)406080C解凍溫度(℃)250350450

1.2.7 硫酸銨鹽析法 實驗證明,硫酸銨分步鹽析法可以顯著提高藻藍蛋白純度[11],在響應面優(yōu)化后的細胞破碎條件下提取藻藍蛋白得到藍色上清液,將凍融所得藍色上清液采用10%～60%梯度飽和硫酸銨溶液進行鹽析,飽和硫酸銨溶液梯度設置如下:10%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%。4 ℃過夜,4 ℃下1000 r/min離心15 min收集沉淀并用低濃度磷酸鹽緩沖溶液溶解后測吸光度(A280、A620、A650)。

1.2.8 藻藍蛋白純化及電泳鑒定

1.2.8.1 HA柱層析純化聚球藻7002藻藍蛋白 將1.2.7中的溶解液在4 ℃進行超濾濃縮脫鹽后,采用經(jīng)10 mmol/L(pH7.0)磷酸鹽緩沖液預平衡的羥基磷灰石(HA)柱進行層析[12]。在洗脫過程中不斷增加磷酸緩沖液的離子強度(用10、20、50、100、200 mmol/L,pH7.0磷酸鹽緩沖液,并加0.1 mol/L NaCl洗脫),洗脫速度控制在0.7 mL/min,收集峰尖部分[13],立即進行光譜測定,再將620 nm處有特征吸收峰的藻藍蛋白洗脫液合并,最后超濾濃縮脫鹽。

1.2.8.2 SDS-PAGE電泳 采用垂直板不連續(xù)電泳系統(tǒng),分離膠濃度為15%,濃縮膠濃度為5%。樣品在濃縮膠中電泳電壓為 80 V,進入分離膠后電壓為120 V,剝膠后,以0.1%考馬斯亮藍 R-250染色,用30%甲醇、10%乙酸的脫色液脫色。

1.2.9 藻藍蛋白分析方法及數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析 藻藍蛋白純度參照Herrera等[14]的方法。藻藍蛋白濃度以Soni[15]推薦的公式計算。如下所示:

式中:P為藻藍蛋白純度;[PC]為藻藍蛋白濃度;V為提取液體積(mL);k1為藻藍蛋白提取液稀釋倍數(shù);m為藻粉質(zhì)量;k2為藻粉蛋白質(zhì)含量。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

以上實驗均平行測定三次,利用Design-Expert 8.0和SPSS19.0對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。

2 結果與討論

2.1 蛋白質(zhì)標準曲線

測得蛋白質(zhì)標準曲線為:Y=0.0022X+0.0741,R2=0.9978。式中Y為OD640值,X為溶液中蛋白質(zhì)含量(μg/mL)。

圖1 蛋白質(zhì)標準曲線Fig.1 Calibration curve of the chlorella protein

2.2 組織搗碎法和凍融法的破碎效果

組織搗碎法和凍融法對藻藍蛋白純度和總蛋白提取率的影響如表2所示,從表中可以看出,組織搗碎法提取的藻藍蛋白提取率和純度較低,原因是聚球藻7002藻體微小,在組織搗碎過程中藻體不能完全均勻接觸組織搗碎機導致藻體細胞破碎率低下,蛋白質(zhì)提取率較低。組織搗碎過程中由于機械做工產(chǎn)熱使得藻體溫度升高,當溫度超過40 ℃[16],藻藍蛋白易變性使其純度降低,凍融法可以充分接觸藻體細胞且蛋白質(zhì)不易變性,綜上所述凍融法破碎藻體效果好于組織搗碎法。

表2 組織搗碎法和凍融法對藻藍蛋白純度和總蛋白提取率的影響
Table 2 The effect of Tissue-trituration method and thawing method to the purity and production of C-PC

方法C-PC純度蛋白提取率(%)組織搗碎法031±0051123±023凍融法042±0022445±012

2.3 超聲波破碎法效果

采用超聲波法對細胞進行破碎時,不同超聲功率對破碎效果的影響如圖2所示。

圖2 超聲破碎法對聚球藻7002藻藍蛋白的純度和蛋白提取率的影響Fig.2 The effect of ultrasonic method on the purity and production of C-PC注:不同小寫字母代表差異性顯著(p<0.05)。

由圖2可以看出隨著超聲波功率的增加,蛋白的溶出率增加,功率為400 W時,繼續(xù)提高超聲功率對破碎細胞的作用不大,蛋白質(zhì)提取增幅顯著下降(p<0.05);另一方面,隨著超聲波功率增加,破碎細胞液溫度也在增加,容易引起蛋白變性,造成藻藍蛋白純度下降。當功率達到400 W時,藻藍蛋白純度明顯下降(p<0.05)。

綜合表2和圖2可知,對于超聲功率而言,對細胞破碎具有一定的影響。超聲功率越大,它所產(chǎn)生的超聲波越強,對細胞的破壞性也越大。從結果看,也符合這一規(guī)律。隨著超聲功率的加強,提取液中藻藍蛋白的含量也有增加的趨勢;但超聲波的熱效應亦在不斷增強,可能會造成局部蛋白的變性[17]。凍融法既可以得到純度較高的藻藍蛋白,蛋白提取率也顯著高于組織搗碎法,比較而言凍融法細胞破碎和藻藍蛋白提取的綜合效果最好。

2.4 單因素實驗結果

2.4.1 菌體濃度對聚球藻7002藻藍蛋白純度和蛋白提取率的影響 凍融法破碎細胞的原理是藻體在凍結過程中,細胞內(nèi)外的液態(tài)水形成冰晶體,造成體積膨大,對藻體細胞壁和細胞膜產(chǎn)生破壞作用,使其通透性加大,內(nèi)容物流出。因此加水量對細胞壁膜有影響。菌體濃度對聚球藻7002藻藍蛋白純度和蛋白提取率的影響如圖3所示,可以看出菌體濃度對蛋白提取率有較大影響,對藻藍蛋白純度影響較小(p>0.05)。在菌體濃度較低時,蛋白提取率隨著菌體濃度增大而顯著提高(p<0.05),在菌體濃度達到2.5 mg/mL時,蛋白提取率達到最高,繼續(xù)增加菌體濃度,蛋白提取率反而顯著下降(p<0.05)。這是因為菌體濃度較小時,溶液的黏度較大,分子擴散速度低,提取率小,隨著菌體濃度提高,溶液中蛋白濃度降低,使更多的蛋白質(zhì)從藻體中釋放出來,提取率升高。當菌體濃度達到一定值后,蛋白質(zhì)提取率變化幅度很小,是因為此時溶液中蛋白質(zhì)濃度與藻體中蛋白質(zhì)濃度相當,使得藻體內(nèi)外蛋白質(zhì)的濃度差消失,蛋白質(zhì)的溶出趨于平衡[18],因此,提取率幾乎不再變化。隨著菌體濃度增大,聚球藻7002藻藍蛋白純度從0.42下降到0.36,這是因為菌體濃度的增大導致所需實驗操作時間加長容易引起蛋白質(zhì)可逆或不可逆變性,但蛋白純度變化不明顯(p>0.05),綜合考慮,菌體濃度以2.5 mg/mL為宜。

圖3 菌體濃度對聚球藻7002藻藍蛋白純度和蛋白提取率的影響Fig.3 The effect of concentration of bacteria on the purity and protein production of C-PC in Synechococcus sp.PCC 7002

2.4.2 凍融次數(shù)對聚球藻7002藻藍蛋白純度和蛋白提取率的影響 每次凍融易生成細小冰晶體的地方不一樣,即在細胞內(nèi)外形成冰晶的部位是不同的,這會對細胞不同部位的細胞壁和細胞膜產(chǎn)生破壞,因而多次凍融能使破碎效果提高。由圖4可知,增加凍融次數(shù)有助于藻藍蛋白的溶出,蛋白提取率隨著凍融次數(shù)的增加而增大,同時藻藍蛋白的純度也隨之提高。凍融4次后,蛋白提取率增加趨于平緩,增加幅度不顯著(p>0.05),凍融6次后,藻藍蛋白純度顯著下降(p<0.05),這是由于凍融反復時間長了,胞內(nèi)的蛋白酶分解了部分蛋白。綜合破碎效果和破碎時間及凍融成本,凍融循環(huán)次數(shù)以6次為宜。

圖4 凍融次數(shù)對聚對球藻7002藻藍蛋白純度和蛋白提取率的影響Fig.4 The effect of cycles of freezing and thawing on the purity and protein production of C-PC in Synechococcus sp.PCC 7002

2.4.3 解凍溫度對聚球藻7002藻藍蛋白純度和蛋白提取率的影響 由圖5可知,隨著融化溫度的增加,藻藍蛋白純度和蛋白提取率都在顯著升高(p<0.05),當溫度超過一定范圍后,藻藍蛋白純度和蛋白提取率出現(xiàn)明顯下降。分析其原因,反復凍融破壞了細胞膜的疏水鍵結構,增加了細胞膜的通透性,同時細胞內(nèi)的水反復結冰、融化,形成的冰晶越來越大,加劇了冰晶對細胞壁的破壞作用[19]。一定范圍內(nèi)的溫度升高能夠加速冰晶的溶脹速度,提高藻體細胞的破碎效果,但當溫度超過35 ℃時,藻藍蛋白純度和蛋白提取率出現(xiàn)明顯下降(p<0.05)。因此,解凍溫度為35 ℃為宜。

圖5 解凍溫度對聚球藻7002藻藍蛋白純度和蛋白提取率的影響Fig.5 The effect of thawing temperature on the purity and protein production of C-PC in Synechococcus sp.PCC 7002

2.5 響應面實驗

2.5.1 響應面實驗結果與分析 根據(jù)以上單因素實驗的結果,對菌體濃度(A)、凍融次數(shù)(B)、解凍溫度(C)三個因素進行Box-Behnken實驗設計,按照表1因素的水平編碼,實驗結果如表3所示。

表3 Box-Behnken 中心組合實驗設計方案與結果
Table 3 Box-Behnken central composite design matrix and corresponding experimental results

實驗號ABC藻藍蛋白純度蛋白提取率(%)110-10.37±0.01116.81±0.622-1010.31±0.02321.43±0.213-1100.42±0.01520.52±0.3240000.45±0.03123.33±0.3550110.29±0.02818.73±0.466-1010.37±0.00622.57±0.24701-10.35±0.01219.46±0.3981-100.34±0.02819.79±0.6390000.43±0.02624.11±0.52100000.40±0.00523.56±0.19110-1-10.29±0.01819.32±0.22120-110.24±0.01418.27±0.43130000.45±0.00724.16±0.51141010.35±0.00322.37±0.16150000.42±0.05124.18±0.4216-1-100.37±0.02718.71±0.56171100.39±0.01920.75±0.33

2.5.2 回歸模型的建立及其顯著性檢驗 利用Design Expert8.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進行多元二次回歸擬合,得到的回歸方程模型為:藻藍蛋白純度=0.44+0.054A+0.025B-13.88C-0.22AB+0.032AC-3.79BC+0.046A2-0.054B2-0.084C2;蛋白提取率(%)=18.95-13.34A+0.17B+4.30C-0.35AB+5.49AC+0.08BC-9.02A2-2.89B2-2.03C2。藻藍蛋白純度和蛋白提取率的回歸方程及偏回歸系數(shù)方差分析結果分別見表4和表5。

由表4、表5可以看出,兩個方程的p值<0.01,失擬項均大于0.05,說明這兩個模型的回歸方程顯著,失擬項不顯著,方程模型可用。R2分別為0.9462、0.9108,說明方程的線性關系良好,能較好地反映各因素與響應值變化的關系,可用于聚球藻7002藻藍蛋白純度和蛋白提取率的理論預測。藻藍蛋白純度回歸方程中B、C、B2、C2對藻藍蛋白純度影響顯著。

蛋白提取率回歸方程中C、AC、B2、C2對蛋白提取率影響顯著。通過響應面的數(shù)字最優(yōu)組合分析得到細胞破碎的最佳條件為:菌體濃度3.53 mg/mL,凍融次數(shù)6次,解凍溫度37 ℃。預測值分別為:藻藍蛋白純度0.44,蛋白提取率為24.62%。

表4 藻藍蛋白純度回歸方程的方差分析
Table 4 Analysis of variance in regression of the purity of C-PC

2.5.3 響應面分析及驗證 兩因素之間的交互作用見圖6、圖7。響應面等高線的形狀反映出交互效應的強弱,橢圓形表示兩因素交互作用顯著[20-21]。由圖6可知,菌體濃度和解凍溫度的交互作用對蛋白純度有一定影響。由圖7可知,菌體濃度和解凍溫度的交互作用對藻藍蛋白得率提取率有著顯著影響,固定菌體濃度時,隨著解凍溫度的升高,藻藍蛋白的得率先升高后降低,固定解凍溫度時,隨著菌體濃度的升高,藻藍蛋白得率先升高后降低。

圖6 菌體濃度和解凍溫度對藻藍蛋白純度的交互作用Fig.6 The interactive effects of the concentration of bacteria and the thawing temperature on the purity of C-PC

圖7 菌體濃度和解凍溫度對蛋白提取率的交互作用Fig.7 The interactive effects of the concentration of bacteria and the thawing temperature on the protein production

表5 蛋白提取率回歸方程的方差分析
Table 5 Analysis of variance in regression of the production of protein

項目自由度平方和均方F值p顯著性回歸模型98233915103600028??A115415417402281B111511513002914C162266275000290?AB17168E-0067168E-0068119E-00609978AC115931593180500038??BC100260026002908696A2115415417502275B2135093509397400004??C2117421742197400030??殘差7618088失擬項3556185119601182純誤差4062015總和168851

注:**極顯著(p<0.01),* 表示顯著(p<0.05)。

按最優(yōu)組合方案中的提取條件進行驗證實驗重復3次,取平均值,測得藻藍蛋白純度0.47,蛋白提取率為25.17%,相對誤差分別為0.03%和0.55%。進一步驗證了數(shù)學回歸模型的準確性。

2.6 硫酸銨鹽析法

鹽析現(xiàn)象的發(fā)生是由于高濃度的鹽結合了大量的水,降低了水的活度,并且脫去蛋白質(zhì)分子表面的水化層,加強了蛋白質(zhì)分子間的直接作用。鹽析法是常用的沉淀蛋白質(zhì)的方法,其具有不易導致蛋白質(zhì)變性的優(yōu)勢[22]。如圖8所示,藻藍蛋白純度和得率隨著硫酸銨飽和度的升高呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢。在飽和度為45%以下時,總蛋白鹽析隨鹽飽和濃度增加的效果明顯。飽和度45%～55%時,蛋白析出效果穩(wěn)定。而當飽和度超過55%時,蛋白得率以及純度略有下降,原因是在較高的鹽濃度下,蛋白質(zhì)分子表面的水化層被硫酸銨脫去,加強了蛋白質(zhì)分子之間的直接作用,引起了部分變性。在硫酸銨飽和度為55%時純度顯著提高至0.79(p<0.05),藻藍蛋白得率顯著提高到0.62%(p<0.05)。由圖可知,藻藍蛋白提取液經(jīng)過一步鹽析后純度提高了一倍。因此,硫酸銨鹽析時以55%的飽和度為宜。

圖8 硫酸銨飽和度對藻藍蛋白純度和得率的影響Fig.8 The effect of ammonium sulfate saturation to the purity and production of C-PC

2.7 藻藍蛋白純化及電泳鑒定

2.7.1 HA柱層析純化聚球藻7002藻藍蛋白 如圖9所示,一定濃度的藻藍蛋白經(jīng)過羥基磷灰石層析柱后,出現(xiàn)5個峰。峰1為穿過組分,為粗藻藍蛋白提取液中的雜質(zhì)蛋白、核酸等雜質(zhì),目標蛋白組分主要集中在峰2、峰3,因為經(jīng)過分光光度計檢測在620 nm有最大吸收峰且其純度為A620/A280=3.79,峰4和峰5的洗脫組分經(jīng)過收集后檢測其A620/A280=2.18。所以目標蛋白主要集中在峰2和峰3。將提取得到的藻膽蛋白經(jīng)過收HA柱層析后,得到了藥品純級別的藻藍蛋白[23]。羥基磷灰石(HAP)是一種磷酸鈣晶體,具有好的生物相容性[24]。羥基磷灰石吸附技術對于蛋白質(zhì),酶,核酸等生物大分子的分離和純化具有良好的選擇性。使用該技術往往能呈現(xiàn)良好的分離性能。而且它價格低廉,用它作為色譜填充料,可作為制備色譜,具有易于放大的優(yōu)勢。

圖9 藻藍蛋白經(jīng)HA柱的層析峰圖Fig.9 HA elution profile of C-PC

2.7.2 SDS-PAGE電泳 如圖10所示,SDS-PAGE蛋白電泳顯示兩條帶,在11 ku和22 ku間,是藻藍蛋白的α、β亞基,與文獻報導的α亞基的分子量13～20 ku,β亞基的分子量14～24 ku相一致[25],且與藻藍蛋白標準品條帶接近,這證明了純化后的蛋白質(zhì)是藻藍蛋白。由電泳圖也可清晰看到,純化后的藻藍蛋白有兩個明顯的條帶,而電泳級別的藻藍蛋白一般只有一個條帶,所以本次純化的藻藍蛋白純度達到藥品級但尚未達到電泳純級別[27]。

圖10 聚球藻7002藻藍蛋白SDS-PAGE電泳結果Fig.10 SDS-PAGE of the purified phycocyanin from Synechococcus sp.PCC 7002注:1為純化后的聚球藻7002藻藍蛋白;2為藻藍蛋白標準品;3為marker。

3 結論

聚球藻在生長過程中會產(chǎn)生多種活性物質(zhì)[26],藻藍蛋白是其中重要的活性物質(zhì),藻藍蛋白的提取方法很多,本文討論了組織搗碎法、反復凍融法、超聲波破碎法。實驗結果表明,超聲波破碎法雖然可以顯著提高藻藍蛋白的提取率,但超聲中產(chǎn)生的高溫易使藻藍蛋白變性從而降低藻藍蛋白純度。組織搗碎法雖然操作簡便但其破碎聚球藻7002效果差,藻藍蛋白提取率較低。反復凍融法通過細胞內(nèi)冰粒的形成和剩余細胞液鹽濃度的增高引起溶脹,使細胞壁、細胞膜破碎,藻膽體內(nèi)的藻藍蛋白溶出,不僅保證了藻藍蛋白在低溫下有較好的穩(wěn)定性,使其純度達到了0.42,提取率達到了24.45%,且其操作簡便,生產(chǎn)成本較低,可以規(guī)?；糯笊a(chǎn)。

在單因素實驗的基礎上,應用響應面法優(yōu)化了反復凍融法的最佳破壁條件。聚球藻7002反復凍融的最佳破壁條件為:菌體濃度3.53 mg/mL、凍融次數(shù)6次、解凍溫度37 ℃,在此條件下提取聚球藻7002藻藍蛋白可使藻藍蛋白純度達到0.47,提取率達到25.17%,相對誤差分別為0.03%和0.55%。建立了兩個分別以聚球藻7002藻藍蛋白純度和蛋白提取率為目標值,以菌體濃度、凍融次數(shù)、溶解溫度為因子的數(shù)學模型,在本實驗范圍內(nèi)能夠較為準確地預測聚球藻7002藻藍蛋白的純度和蛋白提取率。

本文通過硫酸銨一步鹽析法確定了最佳硫酸銨飽和度為55%,通過硫酸銨鹽析后藻藍蛋白純度提高了1倍,將藻藍蛋白粗提液經(jīng)過羥基磷灰石柱層析后得到了純度為3.79的藥品級(食品級>0.7,藥品級>3.0和試劑級>4.0)[25]藻藍蛋白。樣品經(jīng)過SDS-PAGE電泳顯示的兩個清晰條帶進一步驗證了其為藻藍蛋白。硫酸銨一步鹽析法結合羥基磷灰石層析法簡化了藻藍蛋白繁雜的純化步驟。其成本低、耗能低、操作較簡便,具有可以規(guī)模放大化的優(yōu)勢。

[1]Zahira Yaakob,Ehsan Ali,Afifi Zainal,et al.An overview:biomolecules from microalgae for animal feed and aquaculture[J]. Journal of Biological Research,2014,21(6):1-10.

[2]Johnson P W.Chroococcoid cyanobact eria in the sea:A ubiquitous and diverse phototrophic biomass.[J].Limnol Oceanogr,1979,24(5):928.

[3]馬英,焦念志.聚球藻(Synechococcus)分子生態(tài)學研究進展[J].自然科學進展,2004,14(9):967-972.

[4]章申峰. C-藻藍蛋白及其亞基的分離純化和體外抗腫瘤研究[D].杭州:浙江大學,2005.

[5]程超,薛峰,汪興平.藻膽蛋白提取純化及生理活性研究進展[J].食品科學,2012,33(9):251-259.

[6]張?zhí)苽?李天才.藻膽蛋白質(zhì)的提取純化與生物活性研究進展[J].生物技術通報.2010(01):9-13.

[7]徐長波,王巍杰.螺旋藻藻藍蛋白的分離純化研究進展[J].山東化工,2009,38(1):32-35.

[8]Casteholz RW. Culturing methods for cyanobacteria[J]. Methods of Enzymology,1988,167:68-93.

[9]Ferreira S L,Bruns RE,Ferreira H S,et al. Box-Behnkendesign:An alternative for the optimization of analytical method[J].Analytica Chimica Acta,2007,597(2):179-186.

[10]Lizotte D J,GreinerR,Schuurmans D. An experimental methodology for response surface optimization methods[J].Journal of Global Optimization,2012,53(4):699-736.

[11]朱麗萍,嚴世敢,李雁冰，等.硫酸銨鹽析條件對多管藻R-藻紅蛋白和藻藍蛋白得率和純度的影響[J].科技導報,2010,28(4):37-41.

[12]邵明飛,趙楠,劉冰,等. 規(guī)模化制備藻藍蛋白工藝技術研究進展[J].食品與發(fā)酵工業(yè),2013(2):135-139.

[13]LI Bing,Zhang Xue-cheng,Gao Mei-hua,et al. New research on extraction and purification of phycocyanin from Spirulina platensis[J].Marine Sciences,2007,31(8):48-52.

[14]Herrera A,Boussiba S,Napoleone V,et.al.Recoveroy of C-phycocyanin from the cyanobacterium Spirulina maxima[J]. Journal of Applied Phycology,1989,1:325-331.

[15]SoniB,KalavadiaB,Trivedi U,et al.Extraetion,purification and characterization of phycocyanin form Oscillatoria quadripunctulata-Isolate from the rocky shores of Bet-Dwarka,Gujarat,India[J].Process Bioehemistry,2006,41:2017-2023.

[16]張以方,劉旭川,李琦華. 螺旋藻藻藍蛋白提取及穩(wěn)定性實驗[J]. 云南大學學報:自然科學版,1999,21(3):200-202.

[17]朱曉君,安辛欣,顧麗,等. 超聲輔助同時提取條斑紫菜多糖及藻膽蛋白工藝的優(yōu)化[J]. 食品科學,2008,29(5):241-244.

[18]李冰,張學成. 鈍頂螺旋藻藻藍蛋白提取純化新工藝[J]. 海洋科學,2007,31:48-52.

[19]張靜,韋玉春,王國祥,等.太湖藍藻水樣中藻藍蛋白提取方法比較[J].湖泊科學2013(02):283-288.

[20]Anjum M F,Tasadduq I,Al-Sultan K. Rsponse surface methodology:A neural network approach[J].European Journal of Operational Research,1997,101(1):65-73.

[21]Chen W,Wang W P,Zhang H S,et al. Optimization of ultrasonic-assisted extraction of water-soluble polysaccharides from Boletus edulis mycelia using response surface methodology[J].Carbohydrate Polymers,2012,87(1):614-619.

[22]袁道強,黃建華.生物化學實驗技術[M]. 北京:中國輕工業(yè)出版社,227-230.

[23]金怡雯,謝友坪. 螺旋藻藻藍蛋白萃取條件的響應曲面優(yōu)化[J]. 廈門大學學報:自然科學版,2014(4):593-597.

[24]孫彥. 生物分離工程[M]. 北京:化學工業(yè)出版社,2005:250.

[25]王廣策,鄧田,曾呈奎.藻膽蛋白的研究概括(Ⅰ)——藻膽蛋白的種類與組成[J].科學視野,2000,(24):22-25.

[26]趙小惠.聚球藻中活性化合物的分離及抗菌、抗氧化活性研究[D]. 煙臺:煙臺大學,2013(3):373-377.

[27]Patil G.Chethana S,Sridevi A.S,et.al.Method to obtain C-Phycocyanin of high Purity[J].Journal of Chromatography A,2006,1127:76-78.

Study on extraction and purification of C-phycocyanin inSynechococcussp.PCC 7002

LI Si-meng,GAO Feng-zheng,ZENG Ming-yong*

(College of Food Science and Engineering,Ocean University of China,Qingdao 266003,China)

In order to improve the purity and production of C-phycocyanin(C-PC)inSynechococcussp.PCC 7002,extraction and purification of C-phycocyanin inSynechococcussp.PCC 7002 was investigated. Tissue-trituration method,cycle of freezing and thawing method and ultrasonic method were applied and compared to the effection on the purity and production of C-phycocyanin. Response surface methodology(RSM)was used to optimize the best cell-disruption conditions. Futher purification was performed by means of ammonium sulphate precipitation and hydroxyapatite(HA)chromatography. The purified protein was examined through SDS-PAGE. The results showed that cycle of freezing and thawing method was the optimal cell-disruption method by the RSM experiment,the best cell-disruption conditions were that the concentration of bacteria was 3.53 mg/mL,the cycles of freezing and thawing was 6 times,the thawing temperature was 37 ℃,the best concentration of salting out was 55% ammonium sulfate,the purity of C-phycocyanin reached 3.79 through hydroxyapatite chromatography. The optimal method of extraction and purification of phycocyanin fromSynechococcussp.PCC 7002 was achieved.

Synechococcussp.PCC 7002;phycocyanin;cycle of freezing and thawing;response surface methodology;extraction and purification

2016-05-30

李思夢(1991-)，女，碩士研究生，研究方向：水產(chǎn)品高值化利用，E-mail：478367302@qq.com。

*通訊作者:曾名湧(1965-)，男，博士，教授，研究方向：水產(chǎn)品高值化利用，E-mail：mingyz@ouc.edu.cn。

高等學校博士學科點專項科研基金資助項目(20120132110022)；山東省科技發(fā)展計劃項目(2013GGE29003)。

TS254

A

1002-0306(2016)23-0096-08

10.13386/j.issn1002-0306.2016.23.010