楊瑞紅，趙成義，王新軍，馬亞麗

(1 新疆教育學(xué)院，烏魯木齊 830043；2 中國(guó)科學(xué)院新疆生態(tài)與地理研究所，烏魯木齊 830011；3 新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)，烏魯木齊 830052)

梭梭和檉柳土壤微生物多樣性初步分析①

楊瑞紅1,2,3，趙成義2*，王新軍3，馬亞麗1

(1 新疆教育學(xué)院，烏魯木齊 830043；2 中國(guó)科學(xué)院新疆生態(tài)與地理研究所，烏魯木齊 830011；3 新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)，烏魯木齊 830052)

直接從沙漠土壤中提取混合微生物DNA，利用Illuminamiseq測(cè)序平臺(tái)，對(duì)16S rDNA進(jìn)行測(cè)序和分析。結(jié)果表明：①荒漠植被土壤微生物數(shù)量很少，生物活性極弱，DNA提取難度大；②沙漠植被土壤細(xì)菌多樣性豐富，所有測(cè)得細(xì)菌分屬到 23個(gè)門(mén)和 316個(gè)屬，其中還存在一定數(shù)量的微生物新種，部分測(cè)得代表新屬和種的序列提交GenBank，獲得序列號(hào) (KT984242~KT984249)；③不同沙漠土壤樣品微生物群落有相似性，但也有較明顯的差異，其差異與土壤理化因子等因素有關(guān)：如土壤含水量與酸桿菌和變形菌的分布相關(guān)；相對(duì)于空地，梭梭和檉柳群落土壤獨(dú)有的迷蹤菌門(mén)(Elusimicrobia)與固氮菌密切相關(guān)；梭梭的土壤環(huán)境pH明顯高于檉柳土壤環(huán)境這決定了它們不同的優(yōu)勢(shì)種；土壤微生物生物量碳的大小不能反映微生物量的種類(lèi)多少，但可以反映微生物數(shù)量的多少。

梭梭；檉柳；DNA提??；土壤微生物多樣性；系統(tǒng)發(fā)育分析

自20世紀(jì)50年代以來(lái)，生物多樣性與生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定性的關(guān)系一直是生態(tài)學(xué)中重點(diǎn)討論的理論問(wèn)題之一。在荒漠生態(tài)系統(tǒng)中，關(guān)注重點(diǎn)多集中在地上生態(tài)系統(tǒng)；而對(duì)地下生態(tài)系統(tǒng)，尤其是對(duì)微生物多樣性與系統(tǒng)穩(wěn)定性關(guān)系的研究尚重視不夠。2000年，Nature在第406期推出以“Ecology Goes Underground”為題的封面文章[1]，標(biāo)志著地下生態(tài)系統(tǒng)開(kāi)始成為生物多樣性研究的關(guān)注點(diǎn)。事實(shí)上，植被退化導(dǎo)致根系代謝產(chǎn)物變化，直接影響土壤微生物生態(tài)環(huán)境，而土壤中微生物又維持著土壤與植被的養(yǎng)分平衡，有著重要的交互作用[2–3]，這種作用的互饋關(guān)系對(duì)整個(gè)荒漠生態(tài)系統(tǒng)功能有重要意義[4]。所以，對(duì)荒漠微生物學(xué)的研究是認(rèn)識(shí)流沙固定過(guò)程和沙地生態(tài)系統(tǒng)發(fā)育穩(wěn)定性的重要內(nèi)容之一[5]。但是荒漠植被土壤環(huán)境的極端性和大多數(shù)土壤微生物難以培養(yǎng)與過(guò)程土壤生物學(xué)機(jī)制認(rèn)識(shí)的薄弱已成為認(rèn)識(shí)固沙過(guò)程中土壤微生物和土壤養(yǎng)分循環(huán)的瓶頸，這種認(rèn)識(shí)的薄弱不僅表現(xiàn)在對(duì)特定荒漠生態(tài)系統(tǒng)研究積累的不足，而且表現(xiàn)在理論和方法上仍處于探索階段。國(guó)內(nèi)外開(kāi)展關(guān)于荒漠生態(tài)系統(tǒng)土壤微生物的研究集中在：土壤微生物量的變化、種類(lèi)的變化、動(dòng)態(tài)變化等過(guò)程[6–8]。隨著分子技術(shù)、電子顯微鏡和土壤樣品測(cè)定分析技術(shù)的發(fā)展，人們對(duì)土壤微生物組成和多樣性的認(rèn)識(shí)也更為深入，不斷開(kāi)展了荒漠土壤微生物分子實(shí)驗(yàn)的研究[9–10]。Chanal等[11]分析了非洲南突尼斯沙丘的微生物多樣性，盡管環(huán)境非常惡劣但是卻發(fā)現(xiàn)較高的微生物多樣性。Subramanya等[11]用實(shí)時(shí)定量PCR對(duì)比研究了印度荒漠中沙丘、干旱、半干旱等6種土樣的微生物多樣性，共得到1 240種微生物。從維諾格拉德斯基時(shí)代的純培養(yǎng)方法到現(xiàn)在免培養(yǎng)的分子生物學(xué)方法的高通量測(cè)序等技術(shù)的進(jìn)步為更加準(zhǔn)確地揭示土壤微生物多樣性組成提供了支撐。但目前，國(guó)內(nèi)外研究結(jié)論中關(guān)于荒漠生態(tài)系統(tǒng)土壤微生物特征有其地域的限制性[12]。

為此，本研究選擇沙漠優(yōu)勢(shì)種群梭梭、檉柳土壤為研究對(duì)象，直接提取總DNA進(jìn)行高通量測(cè)序，對(duì)細(xì)菌多樣性進(jìn)行分析，較全面了解其群落組成和多樣性特點(diǎn)，為退化生態(tài)系統(tǒng)的恢復(fù)和重建提供土壤微生物學(xué)方面的理論數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況

本研究在古爾班通古特沙漠南緣進(jìn)行調(diào)查。該沙漠面積達(dá)4.88 萬(wàn)km2，為中國(guó)第二大沙漠。沙丘類(lèi)型呈固定、半固定、流動(dòng)狀態(tài)，以梁窩狀和樹(shù)枝狀沙壟為主，長(zhǎng)度0.1 ~ 10 km，沙丘大多南北走向，沙壟西坡緩而長(zhǎng)，東坡短且陡。研究區(qū)遠(yuǎn)離海洋，為溫帶干旱荒漠氣候，穩(wěn)定積雪日數(shù)100 ~ 160天，最大積雪深度多在20 cm以上，全年降水量?jī)H在70 ~ 150 mm之間，冬春兩季降水約占總量的30% ~ 45%。全年日照總數(shù)為2 600 ~ 3 100 h，≥10℃ 積溫3 267 ~ 3 661℃，潛在年蒸發(fā)量2 000 ~ 2 800 mm。年平均氣溫5 ~ 5.7℃，極端最低氣溫小于 –40℃，極端最高溫度 40℃以上。春夏季為風(fēng)季，最大風(fēng)速20 m/s，地下水13 m左右。該沙漠沙丘表面植被覆蓋度可達(dá) 15% ~ 50%，物種豐富度相對(duì)較高，灌木種類(lèi)多，藜科植物在多樣性組成中具有明顯的優(yōu)勢(shì)地位。沙漠中小半灌木、半喬木群落廣泛分布，代表植物有梭梭(Haloxylon ammnodendron)、檉柳(Tamarix ramosissima)、心葉駝絨藜(Ceretocarpus ewersmanniana)、琵琶柴(Reaumuria soongorica)、羽毛三芒草(Aristida pennata)、沙拐棗(Calligonum mongolicum)、角果藜(Ceratocarpus arenarius)等[13]。

1.2 樣品的采集及處理

2014年 10月在古爾班通古特沙漠南緣(44°22￠20.012N，87°55￠06.112E)15年以上生的梭梭、檉柳及丘間空地采集土樣，根據(jù)植被類(lèi)型、土層的不同，共選擇了3個(gè)具有代表性的樣地作為對(duì)照和處理(表 1)。隨機(jī)在樣方中四角及中部分別選取土壤樣，從地表向下分層0 ~ 20 cm和20 ~ 40 cm取土樣混勻分析。取土壤樣品密封帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行土壤理化性質(zhì)和分子生物實(shí)驗(yàn)分析。

表1 試驗(yàn)樣地基本狀況Tabble 1 Basic conditions of tested plots

1.3 主要試劑和儀器

土壤樣品的DNA用OMEGA的土壤DNA試劑盒提取。Tag DNA聚合酶和pGEM _T Easy Vector 載體購(gòu)自Promega公司；蛋白酶K購(gòu)自Merck公司；T4 DNA連接酶購(gòu)自TaKaRa公司；PCR引物由上海Genecore公司合成；其他試劑購(gòu)自Sigma等公司。

1.4 土壤樣品理化因子測(cè)定

土壤含水量測(cè)定采用105℃ 烘干比重法；土樣過(guò)0.25 mm篩，采用重鉻酸鉀氧化外加熱法和凱氏法測(cè)定土壤全碳和氮；采用蒸餾水浸提土壤測(cè)定pH；用交流測(cè)量法測(cè)定電導(dǎo)率。有效磷含量測(cè)定采用碳酸氫鈉浸提，鉬銻抗比色法測(cè)定；速效鉀含量用乙酸銨浸提火焰光度法測(cè)定。采用氯仿熏蒸法測(cè)定土壤微生物生物量碳。提取樣品設(shè)置3個(gè)重復(fù)，取其平均值。

1.5 DNA的提取

參考國(guó)內(nèi)外相關(guān)報(bào)道[14]，結(jié)合沙漠土壤樣品本身的特殊性質(zhì)，我們建立了一套有效提取沙漠土壤樣品混合基因組DNA (也叫元基因組DNA) 的方法：取新鮮的室溫過(guò)篩后的土樣10 g，用50 ml 蒸餾水充分混合搖勻溶解，1 000 g 離心10 min，棄去沉淀，再用蒸餾水溶解，12 000 g 離心10 min棄去上清，用5 ml TE緩沖液懸浮沉淀。取上述處理的沙土樣品1 ml，加入DNA抽提液5 ml(Tris_HCl 100 mmol/L，EDTA 50 mmol/L，十二烷基肌氨酸2%)，用振蕩器充分混勻；加入50 mg/ml蛋白酶K 100 μl，液氮中速凍5 min， 然后65℃水浴溶解10 min，重復(fù)3次；再使用DNA試劑盒提取，最后以75% 乙醇洗滌2 ~ 3次，干燥，溶解于適量的TE緩沖液。

1.6 PCR擴(kuò)增、克隆、測(cè)序與多樣性分析

根據(jù)細(xì)菌V3+V4區(qū)設(shè)計(jì)引物，F(xiàn)：ARACTYCT ACGGRAGGCWG，R：GACTACNVGGGTATCTAA TCC，進(jìn)行PCR擴(kuò)增并對(duì)其產(chǎn)物進(jìn)行純化、定量和均一化形成測(cè)序文庫(kù)。對(duì)測(cè)得序列進(jìn)一步分析，通過(guò)OTU的豐度文件，挑選出各分類(lèi)學(xué)水平上豐度最高的 OTU 的序列作為該分類(lèi)學(xué)水平的代表序列，使用Mothur軟件進(jìn)行多序列比對(duì)產(chǎn)生距離矩陣，采用鄰接法(Neighbor-Joining)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。通過(guò)構(gòu)建物種的進(jìn)化樹(shù)，可以更深一步了解特定環(huán)境下物種的進(jìn)化關(guān)系。進(jìn)化樹(shù)中枝長(zhǎng)的長(zhǎng)短表示進(jìn)化距離的差異。系統(tǒng)關(guān)系越近的物種，在進(jìn)化樹(shù)中距離越近。

2 結(jié)果與分析

2.1 土樣性質(zhì)分析

土壤類(lèi)型為沙地，土壤基本情況見(jiàn)表2。從表中可以看出，土壤0 ~ 20、20 ~ 40 cm平均含水量和土壤平均有機(jī)碳含量、有機(jī)質(zhì)含量、有效氮含量、pH及平均電導(dǎo)率有明顯的差異。平均含水量0 ~ 20 cm土層低于20 ~ 40 cm土層；有機(jī)質(zhì)含量、有效磷、有效氮等0 ~ 20 cm土層明顯高于20 ~ 40 cm土層；梭梭土樣養(yǎng)分稍高于檉柳土樣，梭梭的土壤環(huán)境明顯比檉柳土壤環(huán)境偏堿性；地表0 ~ 20 cm土樣養(yǎng)分明顯高于20 ~ 40 cm土樣的養(yǎng)分；空地的養(yǎng)分明顯少于梭梭活株和檉柳的活株；土壤微生物生物量碳梭梭土樣最高，空間地的土樣最小。

表2 不同固沙植被土壤樣品養(yǎng)分平均含量情況Table 2 Soil physical and chemical properties under different sand-bingding vegetation

2.2 土樣微生物基因組DNA提取及16S rDNA的PCR

從0.5 ~ 10 g的土樣中提取DNA，發(fā)現(xiàn)提取DNA難度較大，不僅含量偏少，而且DNA質(zhì)量也不好。當(dāng)土壤樣品經(jīng)過(guò)冷凍處理后提取 DNA會(huì)出現(xiàn)降解(圖1A)，而常溫保存提取DNA效果較好(圖1B，1C)。對(duì) DNA提取后經(jīng)過(guò)電泳圖分析有無(wú)主帶和降解情況，測(cè)得OD260/280和OD260/230來(lái)判斷所有樣品檢測(cè)結(jié)果合格為止。以總DNA為模板和設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行一次PCR擴(kuò)增(圖1D)。利用AMPure XP磁珠對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化。然后定量和均一化形成測(cè)序文庫(kù)。

圖1 固沙植被土壤細(xì)菌總DNA和16S rDNA的PCR擴(kuò)增瓊脂糖凝膠電泳圖Fig. 1 Amplification of bacterial 16S rDNA and bacterial total DNA from sand-binding plant soil

2.3 測(cè)序深度評(píng)估

對(duì)構(gòu)建的文庫(kù)進(jìn)行高通量測(cè)序(IlluminaMiSeq測(cè)序平臺(tái))得到原始圖像數(shù)據(jù)文件，經(jīng)堿基識(shí)別(Base Calling)分析轉(zhuǎn)化為原始測(cè)序序列(Sequenced Reads)，結(jié)果以 FASTQ(簡(jiǎn)稱為 fq)文件格式存儲(chǔ)，其中包含測(cè)序序列(reads)的序列信息以及其對(duì)應(yīng)的測(cè)序質(zhì)量信息。對(duì)原始測(cè)序序列進(jìn)行過(guò)濾，去除帶接頭(adapter)的reads和低質(zhì)量的reads得到高質(zhì)量的reads，再利用 Mothur(version 1.34.4，http://www.mothur.org/)軟件[15]，依據(jù) Needleman-wunsch算法將原始的雙端Reads拼接成一條序列即Raw Tags，進(jìn)行一系列的去冗余處理和優(yōu)化后所有樣品共得到Clean Tags條13 0429條序列。為了便于進(jìn)行物種多樣性分析將Clean Tags聚類(lèi)為OTU。利用Mothur軟件以平均鄰近聚類(lèi)算法(Average neighbor clustering algorithm)在 0.03(或 97% 的相似度)水平下對(duì) Clean Tags進(jìn)行OTU的聚類(lèi)，并統(tǒng)計(jì)獲得 OTU 的個(gè)數(shù)。依據(jù)每個(gè)OTU至少被測(cè)序到所有序列的 0.005% 次的原則，對(duì)獲得的OTU進(jìn)行過(guò)濾[16]，5個(gè)樣品最終共產(chǎn)生1 703個(gè)OTU(表3)。采用對(duì)測(cè)序序列進(jìn)行隨機(jī)抽樣的方法，以抽到的序列數(shù)與它們所能代表OTU的數(shù)目構(gòu)建曲線(圖2)，即稀釋性曲線[17]，它可以用來(lái)比較測(cè)序數(shù)量不同的樣本物種的豐富度。稀釋性曲線圖中，當(dāng)曲線趨向平坦時(shí)，說(shuō)明測(cè)序數(shù)量合理，更多的數(shù)據(jù)量對(duì)于發(fā)現(xiàn)新的OTU貢獻(xiàn)很小，反之則表明繼續(xù)測(cè)序還可能產(chǎn)生較多新的 OTU。因此，通過(guò)作稀釋性曲線，可以對(duì)測(cè)序深度進(jìn)行評(píng)估。從圖4可以看出克隆數(shù)幾乎可以較全面地反映微生物的多樣性。覆蓋度 (Coverage C) 64.5% 從理論上講能反映環(huán)境中超過(guò)一半的微生物。

表3 樣品OTU和序列測(cè)定統(tǒng)計(jì)Table 3 The statistics of OTU and sequencing

圖2 固沙植被土壤細(xì)菌16S rRNA基因克隆文庫(kù)Rarefaction曲線Fig. 2 Rarefaction curves of 16S rRNAgene in clone library of soil bacteria under different sand-binding vegetation

表4 固沙植被土壤細(xì)菌門(mén)水平豐度統(tǒng)計(jì)Table 4 Statistics of Phylum_community (%)

2.4 細(xì)菌多樣性分析

通過(guò)Mothur軟件，將OTU中包含的51% 以上的Clean Tags都注釋為同一物種，達(dá)不到51% 的標(biāo)準(zhǔn)，則在上一個(gè)物種分類(lèi)等級(jí)再進(jìn)行OTU對(duì)應(yīng)物種分析，把序列相似性大于99% 的歸結(jié)為同一個(gè)細(xì)菌的序列。結(jié)合每個(gè)OTU內(nèi)所含的Clean Tags和物種組成信息，可得到各分類(lèi)學(xué)水平上每個(gè)物種的相對(duì)豐度(表4為門(mén)水平上的豐度)。發(fā)現(xiàn)測(cè)得序列可代表23個(gè)門(mén)，74個(gè)綱，131個(gè)目，218個(gè)科，316個(gè)屬細(xì)菌。其中在屬水平上，有148個(gè)為已知的屬，178個(gè)為無(wú)類(lèi)別(unclassified)的屬；科水平上，121個(gè)為已知的科，97個(gè)為無(wú)類(lèi)別的科；目水平上，95個(gè)為已知的目，36個(gè)為無(wú)類(lèi)別的目；綱水平上，67個(gè)為已知綱，7個(gè)為無(wú)類(lèi)別的綱；門(mén)水平上，22個(gè)已知門(mén)，未知的門(mén)有25種OTU。得到主要細(xì)菌類(lèi)群有(表4)：綠彎菌門(mén)(Chloroflexi)、藍(lán)藻門(mén)(Cyanobacteria)、變形菌門(mén)(Proteobacteria)、厚壁菌門(mén)(Firmicutes)、放線菌門(mén)(Actinobacteria)、擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes)、芽單胞菌門(mén)(Gemmatimonadetes)、酸桿菌門(mén)(Acidobacteria)、衣原體門(mén)(Chlamydiae)、綠細(xì)菌門(mén)(Chlorobi)、迷蹤菌門(mén)(Elusimicrobia)、纖維桿菌門(mén)(Fibrobacteres)、硝化螺旋菌門(mén)(Nitrospirae)、浮霉菌門(mén)(Planctomycetes)、螺旋體門(mén)(Spirochaetes)、棲熱菌門(mén)(Thermi)等。從表4可以看出，總的來(lái)說(shuō)，放線菌門(mén)為優(yōu)勢(shì)菌群占所測(cè)的菌類(lèi) 36.58%；其次是變形菌門(mén)約占所測(cè)的菌類(lèi)25.05%，擬桿菌門(mén)約占總數(shù)的 16.56%，其余各門(mén)所占的比例較少。從土壤層和植被上看，不同土樣各門(mén)類(lèi)也有所不同，在檉柳土壤中優(yōu)勢(shì)菌群依次為：擬桿菌門(mén)、放線菌門(mén)、變形菌門(mén)，在梭梭植被土壤中優(yōu)勢(shì)菌群依次為：放線菌門(mén)、變形菌門(mén)、綠彎菌門(mén)。在空地里土壤中優(yōu)勢(shì)菌群依次為：放線菌門(mén)、變形菌門(mén)、綠彎菌門(mén)，這與梭梭土樣比較接近。

將測(cè)序中代表主要細(xì)菌類(lèi)群的 OTUs 的 16S rRNA基因序列與數(shù)據(jù)庫(kù)中具有最高相似性的菌株或克隆的序列經(jīng)比對(duì)分析后構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化發(fā)育樹(shù)(圖3)。由圖3可以看出不同門(mén)細(xì)菌之間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。第一優(yōu)勢(shì)菌放線菌門(mén)(Actinobacteria)分布在 74個(gè)明確分類(lèi)地位的屬中，除了優(yōu)勢(shì)菌鏈霉菌(Streptomyces)外，還發(fā)現(xiàn)了擬諾卡氏菌屬(Nocardiopsis)、擬無(wú)枝酸菌屬(Amycolatopsis)、疣孢菌屬(Verrucosispore)、喜冷桿菌屬(Cryobacterium)、異壁放線菌屬(Actinoalloteichus)、假諾卡氏菌屬(Pseudonocardia)、普氏菌屬(Prauserella)、鏈單孢菌屬(Streptomonospora)、貧養(yǎng)桿菌屬(Modestobacter)、放線產(chǎn)孢菌屬(Actinomycetospora)、芽生球菌屬(Blastococcus)等稀有放線菌屬，還有29種在屬水平上未歸類(lèi)無(wú)明確分類(lèi)地位的屬，4個(gè)在科水平上未歸類(lèi)，2個(gè)在目水平上未歸類(lèi)，1個(gè)在綱水平上未歸類(lèi)。擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes)分布在23個(gè)屬中，有黃桿菌屬(Flavobacterium)、擬桿菌屬(Bacteroides)、地桿菌屬(Pedobacter)、噬纖維菌目的嗜寒嗜堿的Rhodonellum屬等已確定分類(lèi)地位的屬，還有20種在屬水平上未歸類(lèi)。第二優(yōu)勢(shì)菌變形菌門(mén)(Proteobacteria)里除了優(yōu)勢(shì)菌α-變形細(xì)菌生絲微菌屬(Hyphomicrobium)外，還發(fā)現(xiàn)了不動(dòng)桿菌(Acinetobacter)、蛭弧菌屬(Bdellovibrio)、脫硫弧菌屬(Desulfovibrio)、亞硝化球菌屬(Nitrosococcus)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、腸桿菌屬(Enterobacter)、厭氧螺菌屬(Anaerobiospirillum)、代爾夫特菌屬(Delftia)等共110個(gè)屬，其中52個(gè)在屬水平上未歸類(lèi)的潛在新屬；有63個(gè)科，其中有20個(gè)在科水平上未歸類(lèi)；有35個(gè)目類(lèi)，其中有5個(gè)在目水平上未歸類(lèi)；3個(gè)明確分類(lèi)的綱，有一個(gè)在綱水平上未歸類(lèi)。厚壁菌門(mén)(Firmicutes)中包括15個(gè)明確分類(lèi)地位的屬，如梭狀芽孢桿菌綱(Clostridia)的芽孢桿菌屬(Bacillus)、類(lèi)芽孢桿菌屬(Paenibacillus)、桿菌屬(Lysinibacillus)、顫螺旋菌屬(Oscillospira)等，還有另外2個(gè)在屬水平上無(wú)歸類(lèi)的屬。綠彎菌門(mén)(Chloroflexi)中有厭氧繩菌綱(Anaerolineae)、熱微菌綱(Thermomicrobia)、綠彎菌綱(Chloroflexi)、爬管菌目(Herpetosiphonales)等明確分類(lèi)地位的綱和目，而大部分都是在科和屬水平上未歸類(lèi)的(unclassified)、無(wú)明確分類(lèi)地位的共23個(gè)。綠菌門(mén)(Chlorobi)、衣原體門(mén)(Chlamydiae)、藍(lán)藻門(mén)(Cyanobacteria)等包含 OTU數(shù)量極少就不再羅列。本研究分析獲得的菌類(lèi)大部分都屬于好氣性細(xì)菌，極個(gè)別是厭氧性細(xì)菌，說(shuō)明好氣細(xì)菌的數(shù)量多于厭氧細(xì)菌的數(shù)量，但也有可能是厭氧細(xì)菌的DNA相對(duì)好氣細(xì)菌DNA比較難獲得導(dǎo)致的。獲得OTU中有與多種來(lái)源各環(huán)境如土壤、沙漠、火山、湖泊、海洋等的非培養(yǎng)菌類(lèi)和分離獲得菌株有極高的相似性。例如有與來(lái)源于鹽堿土和鹽湖純化分離的中度嗜鹽菌株(NR_044397) 相似性為 98%；有與從沙漠公園里分離得到的噬纖維細(xì)菌科的Pontibacter屬的Pontibacter solisp.新種同源性達(dá)到99%[18]。在未歸類(lèi)(unclassified)的 OTU中其相似序列大部分為非培養(yǎng)菌類(lèi)。這些序列尚難確定其分類(lèi)地位，可能是代表新屬和種的序列，說(shuō)明固沙植被土壤存在一定數(shù)量的潛在微生物新種。這表明沙漠土壤中蘊(yùn)含著豐富的未培養(yǎng)微生物資源，可以為開(kāi)發(fā)和利用極端環(huán)境微生物資源提供參考。

3 討論

土壤植被可改變土壤結(jié)構(gòu)與環(huán)境，不同植物與土壤微生物的互饋效應(yīng)有所不同。所以，固沙植被土壤與空地土壤微生物有明顯的差異。從表 4 可以看出空地沒(méi)有而梭梭和檉柳群落獨(dú)有的細(xì)菌門(mén)為衣原體門(mén)(Chlamydiae)和迷蹤菌門(mén)(Elusimicrobia)。文獻(xiàn)報(bào)道迷蹤菌門(mén)(Elusimicrobia)與固氮菌密切相關(guān)且大部分屬于厭氧細(xì)菌[19]，所以在表層和空地里沒(méi)有獲得該門(mén)的DNA序列。圖4縱坐標(biāo)代表相對(duì)豐度，橫坐標(biāo)代表梭梭土樣、檉柳土樣和空地土樣，用不同的顏色代表不同科和綱?？梢钥闯鏊笏蟆f柳和空地樣品的物種和豐度有明顯的差異。梭梭的土壤環(huán)境pH明顯高于檉柳土壤環(huán)境，導(dǎo)致其優(yōu)勢(shì)菌群有所不同。有研究[20]證明放線菌具有喜熱耐堿的特性，喜歡在偏堿性環(huán)境中生長(zhǎng)，因而在堿性較強(qiáng)的梭梭土壤中放線菌數(shù)量占優(yōu)勢(shì)，而在接近中性的檉柳土壤中擬桿菌占優(yōu)勢(shì)。

圖3 物種系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)——OTU 在屬分類(lèi)學(xué)水平上的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)(圖中每個(gè)葉節(jié)點(diǎn)對(duì)應(yīng)一個(gè) OTU)Fig. 3 Phylogenetic tree of bacterial 16S rRNA gene clone library from soil under sand-binding vegetation

不僅不同植被的土壤樣品有差異，即使是同種植被土樣不同土層其樣品也有明顯的差異。在門(mén)和科的水平上對(duì)樣品和樣品所含菌種類(lèi)進(jìn)行聚類(lèi)，對(duì)聚類(lèi)后的各樣品中不同OTU代表的門(mén)和科所含序列的豐度作出heatmap(圖5)。用顏色變化來(lái)反映菌群的豐度信息，可以直觀地將菌群豐度值用定義的顏色深淺表示出來(lái)，顏色越深表示相對(duì)豐度越高，顏色越淺豐度越低。從圖5可以看出在天然荒漠不同灌叢沙土和不同土壤層的土樣土壤微生物的組成整體變化具有很大的相似性，都可以分為5大枝，有一定的共性。在不同土樣的群落結(jié)構(gòu)中，變形菌門(mén)(Proteobacteria)、擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes)、厚壁菌門(mén)(Firmicutes)、放線菌門(mén)(Actinobacteria)的序列總和占全部序列的大部分，這些微生物在其他相關(guān)研究的土壤中也曾被報(bào)道為優(yōu)勢(shì)菌群[21–22]。這表明盡管取樣地點(diǎn)與研究目的不同，但是處于相同生境中微生物類(lèi)群具有相似性。

圖4 樣品科和綱水平上的物種豐度Fig. 4 Abundances of sample Family and Class levels

圖5 樣品門(mén)和科水平物種Heatmap圖Fig. 5 Heatmap of sample Family and Class levels

但由于環(huán)境因子的差異，沙土覆蓋植被和土壤深淺的變化的過(guò)程中，各種微生物受到了不同程度的影響。每種細(xì)菌的豐度有明顯的差異。圖5中如：放線菌門(mén) (Actinobacteria)的相對(duì)含量從6.72% (BL) 上升至 57%；未分類(lèi)門(mén)的含量也變化明顯不同，其中，M05樣品中的未分類(lèi)門(mén)含量最多。到了種水平物種分析，通過(guò)對(duì)5種樣品的OTU進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)制得Van圖(圖6)，可以看出5個(gè)樣品即具有相同的物種又具有自己特有的物種， 5個(gè)樣品有215種相同的物種，每個(gè)樣品又具有自己特有的物種，其中，M01、M05、M03具有60種以上自己獨(dú)有的物種。

圖6 樣品OTU Van 圖Fig. 6 Sample OTU Van map

自然界中可以影響土壤微生物群落多樣性的因素很多，如植被類(lèi)型、土壤結(jié)構(gòu)、化學(xué)組成、氣候變化等[23–25]。郝金娥[26]以退化草地土壤微生物為研究對(duì)象，得出微生物生物量碳與細(xì)菌和微生物總數(shù)量相關(guān)性極顯著。本研究表明土微生物生物量碳土壤表層(0 ~ 20 cm)高于下層(20 ~ 40 cm)，這與前人[27]研究結(jié)果一致，即微生物生物量碳最大值都出現(xiàn)在0 ~ 10 cm土層，土壤微生物具有一定的垂直分布規(guī)律，因?yàn)? ~ 10 cm 土層植被根系發(fā)達(dá)、土壤透氣性較高，這一土層為微生物提供了生長(zhǎng)空間與絕大部分的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，相比較深的土層，這一土層微生物大量繁殖，活性最高。然而隨著土壤層次的加深，植物根系分布減少、土壤透氣性降低，這都不利于微生物通過(guò)吸收植物營(yíng)養(yǎng)或固定大氣中的 CO2來(lái)維持其生命活動(dòng)所需。而從本研究結(jié)果可以看出土壤表層微生物總量較高，但微生物種類(lèi)不一定最大，這個(gè)結(jié)論有待進(jìn)一步研究。有結(jié)果表明沙漠土壤植被水分情況的變化可導(dǎo)致土壤和沉積物中含氧量的變化，進(jìn)而影響微生物的群落組成[28]。也有研究表明水分含量對(duì)于決定濕地微生物群落結(jié)構(gòu)十分重要[29]，我們的研究結(jié)果與此一致。本研究測(cè)得表層土壤水分低于深層土壤，獲得的OTU數(shù)量也是表層土壤低于深層土壤，說(shuō)明在土壤表層微生物的種類(lèi)略多于深層(20 ~ 40 cm)土壤。在對(duì)濕地土壤細(xì)菌多樣性的研究中[30]，得出土壤含水量的增加減少了酸桿菌的分布，而增加了變形菌的分布，我們的研究結(jié)果中也可以看出相似的趨勢(shì)。

本研究測(cè)得序列經(jīng)過(guò)與已發(fā)表的序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)除了與已經(jīng)有明確分類(lèi)地位且可以培養(yǎng)的細(xì)菌具有很近的同源關(guān)系，還與一些未培養(yǎng)細(xì)菌和沒(méi)有分類(lèi)地位的菌同源關(guān)系很近。分析得到豐富的細(xì)菌多樣性與通過(guò)傳統(tǒng)培養(yǎng)細(xì)菌法在沙漠土壤中分離得到種類(lèi)數(shù)量較多的微生物具有相似性[31–32]，得到的菌類(lèi)數(shù)量涵蓋了 Ajar在印度的北喜馬拉雅山脈西部寒冷的沙漠土壤里收集獲得的全部代表種類(lèi)(4個(gè)門(mén)31個(gè)屬82個(gè)種的232個(gè)分離菌)[33]。通過(guò)分類(lèi)分析獲得的種類(lèi)大部分屬好氣性細(xì)菌，群落結(jié)構(gòu)具有普遍性，即與目前已經(jīng)獲得的土壤微生物群落結(jié)構(gòu)相似，但又有其獨(dú)特的菌類(lèi)，比如棲熱菌門(mén)(Thermi)。在黃河三角洲土壤微生物群落結(jié)構(gòu)對(duì)鹽生植被演替的響應(yīng)研究時(shí)，邢平平[34]將異常球菌–棲熱菌門(mén)(Thermi)的出現(xiàn)作為土壤環(huán)境惡化的標(biāo)志類(lèi)群，說(shuō)明此門(mén)細(xì)菌是適應(yīng)土壤缺水和營(yíng)養(yǎng)而產(chǎn)生的菌類(lèi)，它普遍存在于沙漠土壤和貧瘠的土壤中。

值得注意的是，由于脅迫帶來(lái)的選擇壓力可以促進(jìn)初始群落迅速進(jìn)化。本研究中樣本間的差異除了已知的菌屬外，還有很多不明確的菌屬未知種類(lèi)，說(shuō)明本土樣品微生物群落有很多潛在的新的未知微生物種類(lèi)，其功能特性還有待于進(jìn)一步開(kāi)發(fā)。由于研究的局限，很多迅速進(jìn)化的菌群還未得到認(rèn)知，所以極端環(huán)境帶來(lái)的迅速進(jìn)化可能是微生物群落的結(jié)構(gòu)和功能對(duì)特定脅迫尤其是長(zhǎng)期脅迫產(chǎn)生抵抗力和恢復(fù)力的重要機(jī)制[35]。這也可能是沙漠植被維持沙漠生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定性的重要機(jī)制之一。

4 結(jié)論與展望

通過(guò)本研究得到以下結(jié)論：①荒漠植被土壤微生物數(shù)量較一般土壤少，生物活性極弱，DNA提取難度大；②沙漠植被土壤細(xì)菌多樣性豐富，所有測(cè)得細(xì)菌分屬到23個(gè)門(mén)和316個(gè)屬，還存在一定數(shù)量的潛在微生物新種；③土壤理化因子等因素導(dǎo)致樣品分析結(jié)果有較明顯的差異，如土壤含水量與酸桿菌和變形菌的分布相關(guān)；相對(duì)于空地，梭梭和檉柳群落土壤獨(dú)有的迷蹤菌門(mén)(Elusimicrobia)與固氮菌密切相關(guān)；梭梭的土壤環(huán)境pH明顯高于檉柳土壤環(huán)境決定了它們不同的優(yōu)勢(shì)種；土壤微生物生物量碳的大小不能反映微生物生物量的種類(lèi)多少，但可以反映微生物數(shù)量的多少等。

本研究通過(guò)高通量測(cè)序針對(duì)固沙植物群落土壤微生物群落進(jìn)行了研究，其成果為植被恢復(fù)和荒漠化控制提供了寶貴的參考資料，但仍有一些問(wèn)題需要進(jìn)一步探討，如對(duì)于固沙植物群落深層土壤微生物的研究和微生物功能數(shù)量與土壤養(yǎng)分和植被的關(guān)系，如何使用更多手段和方法用來(lái)研究土壤微生物群落對(duì)環(huán)境脅迫的抵抗力和恢復(fù)力等，需要再進(jìn)一步研究。而且，特定的長(zhǎng)期脅迫的環(huán)境帶來(lái)的微生物迅速進(jìn)化下樣品含有大量未知菌群，這可能為認(rèn)識(shí)沙漠土壤生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定性另辟蹊徑。

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Phylogenetic Diversity Preliminary Analysis ofHaloxylon ammnodendronandTamarix ramosissimaSoil Bacteria

YANG Ruihong1,2,3, ZHAO Chengyi2*, WANG Xinjun3, MA Yali1
(1Xinjiang Education Institute,Urumqi840043,China; 2Xingjiang Institute of Ecology and Geography,Chinese Academy of Sciences,Urumqi830011,China; 3Xijiang Agriculture University,Urumqi830052,China)

Microbiological mixed DNA (genomic DNA) was directly extracted from soil in the Gurbantunggut desert. Using Illuminamiseq sequencing platform, diversity of community structure was analyzed from the bacterial 16S rDNA. The research showed that: 1) Because of the low quantity of microbe in desert vegetation soil and the low activity, there were many difficulties in the DNA extraction; 2) In total, measured sequences belonged to 23 phyla and 316 genera, among them, some sequences were uncultured groups that had an uncertain affiliation, which had been submitted to the GenBank PEMBL PDDBJ databases under accession numbers KT984242–KT984249. 3)There were some discrepancies between groups. The difference was affected by factors such as soil physical and chemical factors. The water content influenced the amount ofProteobacteriaandAcidobacteria. The uniqueElusimicrobiawas the soil of plantHaloxylon ammnodendronandTamarix ramosissima,which was closely related to the nitrogen fixing bacteria. The soil microbial biomass carbon could reflect the quantity of microorganism but not the types of microorganism.

Haloxylon ammnodendron;Tamarix ramosissima; DNA extraction; Microbiology diversity; Phylogenetic analysis

Q938

10.13758/j.cnki.tr.2016.06.009

國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃(973計(jì)劃)項(xiàng)目(2013CB429905)和國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(41301205、2014211B014)資助。

* 通訊作者(zcy@ms.xjb.ac.cn)

楊瑞紅(1980—), 女, 新疆人, 副教授, 博士研究生, 主要研究方向?yàn)榛哪寥郎鷳B(tài)與微生物學(xué)。E-mail: yangruihong99@163.com