劉 華，施婷婷，施志儀

（1.南寧富萊欣生物科技有限公司研發(fā)中心，廣西 南寧 530003；2.上海海洋大學生物技術研究中心，上海 200090）

牙鲆精氨酸酶基因片段的克隆及序列分析

劉 華1，施婷婷1，施志儀2

（1.南寧富萊欣生物科技有限公司研發(fā)中心，廣西 南寧 530003；2.上海海洋大學生物技術研究中心，上海 200090）

根據(jù)GenBank中虹鱒、大菱鲆、斑馬魚及其他生物的精氨酸酶基因序列設計并合成一對引物，并提取變態(tài)期牙鲆仔魚總RNA作為模板進行RT-PCR，得到一條cDNA片段。將產物連接到T載體中，轉化、擴增重組質粒。提取大腸桿菌中的重組質粒進行DNA測序。將DNA測序所得到的基因序列翻譯成蛋白序列和已知的大菱鲆、鯉魚、虹鱒、斑馬魚的精氨酸酶基因序列進行同源性分析。結果顯示，利用RTPCR的方法擴增出一條284 bp的目的基因片段，比對結果發(fā)現(xiàn)，其與大菱鲆、鯉魚、斑馬魚以及虹鱒精氨酸酶基因蛋白序列的同源性分別為96%、85%、84%和82%。對蛋白序列進行生物信息學分析發(fā)現(xiàn)，整個蛋白序列中無信號肽，無糖基化位點，無跨膜結構域，但含有一個典型的arginase結構。在N-端第38～44、57～64、71～76、89～94區(qū)段有β-折疊中心；第7～18、50～52、81～87區(qū)段可能形成α螺旋區(qū)域。Arg蛋白N端第37～45和第74～77區(qū)段為優(yōu)勢抗原表位區(qū)域。

牙鲆；精氨酸酶；克??；序列分析

精氨酸酶（Arginase）是在細菌、酵母、植物、無脊椎動物和脊椎動物中普遍存在的一種酶，該酶不僅參與機體尿素循環(huán)，還與機體病理過程密切相關。在植物和排氨動物中精氨酸酶位于線粒體中，而在排尿動物中精氨酸酶位于細胞質中。目前，精氨酸酶基因在香魚、虹鱒和鯉魚等少數(shù)硬骨魚類中被克隆和鑒定。健康香魚 Arg-II mRNA主要在肝、腦和單核/巨噬細胞中表達，感染鰻弧菌后，Arg-II mRNA表達顯著上調，Arg-II與香魚抗病原感染的免疫反應緊密相關［1］。肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）中Arg-1表達降低，Arg-1與HCC分化、轉移及復發(fā)呈顯著相關，提示Arg-1對HCC發(fā)生、進展發(fā)揮負性調控作用，Arg-1可作為評估患者預后的參考指標［2］。迄今為止，在蛋白質結構數(shù)據(jù)庫（Protein Data Bank，PDB）中還沒有關于魚類精氨酸酶晶體結構的報道。目前研究主要集中在精氨酸酶的酶學性質和催化機制。

目前，國內外尚未見有對牙鲆精氨酸酶的研究，因此我們對牙鲆精氨酸酶基因部分序列進行了克隆和表達研究，研究結果將為重組牙鲆精氨酸酶的表達提供可靠的基因材料，同時也為進一步研究該基因的結構和功能及與酶激活因子之間的作用方式奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試牙鲆仔魚，購自山東良種示范基地，運回實驗室海水暫養(yǎng)，水溫控制在21（±0.5）℃。取27日齡變態(tài)期牙鲆仔魚50條，分別去掉腸，液氮速凍，立即進行總RNA提取。

其他主要試驗材料包括TRIzol Reagent、Taq酶、RNasin、M-MLV逆轉錄酶、Oligo（dT）18 primer、pUcm-T Vector、DNA Marker；主要儀器設備包括冷凍離心機、PCR儀、移液槍、電泳儀。

1.2 試驗方法

1.2.1總RNA提取 根據(jù)TRizol試劑法抽提牙鲆仔魚總RNA，按其產品說明書進行操作提取。

1.2.2設計引物與反轉錄-聚合酶鏈反應 從 GenBank數(shù)據(jù)庫中查找虹鱒、大菱鲆、斑馬魚等生物的Arginase基因序列設計并合成聚合酶鏈反應5’端引物：5’-GGA AAC CTC CAC GGC CAG CC-3’（20 bp），3’端引物：5’-TCA AAG CTC AGG TGG AT-3’（17 bp）。依據(jù)試劑盒方法進行cDNA的合成和擴增。在0.2 mL EP中依次加入1 μL（1 μg/μL）總RNA、2 μL Oligo（dT）18 primer、20 U（0.5 μL）RNasin、2 μL dNTPs、4 μL 5×Reverse Transcriptase Buffer、10 U AMV逆轉錄酶、8.5 μL DEPC處理水，總體積20 μL。于室溫下放10 min再轉入42℃恒溫槽溫浴l h。在逆轉錄產物中吸取0.5 μL進行PCR，反應程序為94℃預變性1 min，再依據(jù)如下循環(huán)參數(shù)進行PCR反應：94℃ 45 s，51.1℃45 s，72℃ 45 s，35個循環(huán)后，72℃ 4 min。PCR反應結束后，吸取5 μL PCR產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳。

1.2.3牙鲆Arginase基因的克隆、鑒定和測序 Arginase基因片段通過電泳回收，吸取7 μL Arginase基因PCR純化產物，依次加入1 μL pUcm-T Vector、1 μL Ligation Buffer、1 μL T4 DNA連接酶，總體積10 μL。連接反應條件：16℃，12 h。吸取2 μL反應終產物轉化50 μL DH5α感受態(tài)細胞。已轉化的感受態(tài)細胞在LB瓊脂平板（含X-Gal）培養(yǎng)基上培養(yǎng)（37℃，20 h）。選取白色菌落接種于LB液體培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，PCR法、酶切法進一步鑒定篩選陽性菌落，陽性菌送上海生物工程有限公司測序。雙酶切體系為20 μL，分兩管酶切，內切酶EcoRⅠ、XhoⅠ/BamHⅠ各1.5 μL，10×Buffer 2 μL，抽提的pUcm-arg284質粒15 μL，離心混勻后，37℃酶切過夜。

1.2.4生物信息學分析 利用SWISS-PROT、PROSITE、EMBL等蛋白數(shù)據(jù)庫和DNAStar、Bioedit、ClustalX1.8、Mega2等軟件及在線網絡服務器分析牙鲆Arginase蛋白序列特征，并與GenBank中的物種序列進行同源性比較。

2 結果與分析

2.1 RT-PCR擴增結果

根據(jù)設計的目的基因上下游引物的活性溫度，以50～55℃為溫度梯度，以18S引物作陽性對照進行RT-PCR，將所得產物進行瓊脂糖電泳，結果顯示18S引物擴增出來的產物大小為315 bp，但其后500～750 bp區(qū)域有一條較弱的帶，而目的基因引物擴增出來的產物大小約為280 bp（圖1）。

圖1 RT-PCR產物電泳結果

2.2 牙鲆Arginase基因cDNA片段的陽性克隆鑒定

從轉化的DH5α進行菌液鑒定，見圖2；菌株提取質粒DNA，利用目的基因的引物進行PCR，擴增得到一條與設計的目的基因長度相同的DNA片段，可以確定目的基因已經插入T載體，得到陽性克?。▓D3）。EcoRⅠ、XhoⅠ/BamHⅠ雙酶切均能切除280 bp左右大小的片段，酶切鑒定見圖4，說明抽提的質粒含有插入目的片段。

圖2 LB菌液PCR鑒定結果

圖3 重組質粒PCR鑒定結果

圖4 重組子限制性內切酶酶切電泳結果

2.3 牙鲆Arginase基因cDNA片段測序結果

將提取的重組質粒送基因公司測序，以M13Primers為測序引物測序得到目的基因序列（284 bp）：

將核苷酸測序結果輸入EXPASY網站（http://www.expasy.org/tools/dna.html）進行翻譯，得到該基因的編碼氨基酸序列（94 aa）：-GNLHGQPVAFMLKELQDKMPAIPGFSWVKPFL SSRDLVYIGLRDVDPGERHILKNLGIQYFTMRDI DRLGIQRVMEVTLDHLMARKQRPIHLSF-

應用NCBI網上的BLAST程序與GenBank、EMBL、DDBJ及PDB數(shù)據(jù)庫上的序列進行同源性比較，結果表明，所克隆的牙鲆精氨酸酶與同屬大菱鲆（Q71LX3，Scophthalmus maximus）同源性最高，其中與大菱鲆精氨酸酶基因的堿基序列及氨基酸序列的同源性分別為91%和96%；與鯽魚（Q4A4U9，Cyprinus carpio）、斑馬魚（Q6PH54，Danio rerio）、虹鱒（Q7T1U6，Oncorhynchus mykiss）堿基序列及推測的氨基酸序列同源性分別為78%/85%、84%/84%和80%/82% 。與人（P78540，Homo sapiens human）的氨基酸序列同源性為72%；與紅原雞（XP_421191，Gallus gallus）的為72%。

GenBank搜索表明該片段是未登錄的新基因，將所得到的目的基因的蛋白質序列在http://www.ncbi.nlm.nih.gov網站上進行BLAST分析，分析結果顯示目的基因與奧尼羅非魚、金頭鯛、底鳉、斑馬魚精氨酸酶基因蛋白序列的同源性分別為85%、83%、81%、71%，并且目的基因蛋白序列具有典型的Arginase特征結構（圖5），可以推斷所克隆的序列為牙鲆精氨酸酶基因。

圖5 Arginase特征結構

2.4 生物信息學分析

2.4.1Arginase結構特點剖析 運用Tmpred服務器剖析，沒有出現(xiàn)跨膜區(qū)域；經亮氨酸富集核輸出信號剖析，沒有發(fā)現(xiàn)亮氨酸富集核輸出信號；經信號肽剖析沒有信號肽出現(xiàn)；經糖基化位點剖析該蛋白沒有出現(xiàn)糖基化位點。

對牙鲆Arginase蛋白的內在擾亂區(qū)域進行分析（http://dis.embl.de/），結果顯示，該蛋白沒有Remark-465擾亂，但在N-端第42～50（LRDVDPGER）、56～66（LGIQY FTMRDI）和84～94（ARKQRPI HLSF）3個肽段內同時發(fā)現(xiàn)環(huán)熱環(huán)擾亂和一卷曲擾亂，這3個肽段區(qū)域很不穩(wěn)定（圖6）。

圖6 牙鲆Arginase蛋白內在擾亂區(qū)域分析

2.4.2Arginase二級結構分析結果 對牙鲆Arginase蛋白二級結構中的α螺旋、β折疊和轉角區(qū)域同時運用Chou-Fasman方法和Garnier-Robson方法分析，結果（圖7、圖8）發(fā)現(xiàn)，大部分區(qū)域重疊。α螺旋區(qū)域分析顯示，牙鲆Arginase蛋白在N-端第7～18、50～52、81～87這3個肽段內形成共同區(qū)域；β折疊區(qū)域所在區(qū)段分析顯示，牙鲆Arginase蛋白在N-端第38～44、57～64、71～76、89～94這4個肽段內形成共同區(qū)域；Coil卷曲所在區(qū)段分析顯示，牙鲆Arginase蛋白在N-端2～5、33～34、45～47這3個肽段內形成共同區(qū)域。柔性區(qū)域運用Karplus-Schulz方法進行分析發(fā)現(xiàn)，柔性區(qū)域位于N-端第5～7、14～18、30～36、43～50、64～68、85～89這6個肽段內。

2.4.3Arginase抗原表位預測結果 運用Kyte-Doohttle方案、Jameson-Wolf方案和Emini方案分別預測氨基酸親水性肽段（1～5，13～21，31～33，43～53，63～69，71～72，76～77，82～91）、抗原指數(shù)肽段（1～4，14～20，31～37，43～53，64～71，73～75，82～89）和表面可能性肽段（14～18，44～49，51～52，61～62，64～66，84～8），3個預測指數(shù)形成的共同區(qū)域均位于牙鲆Arginase蛋白N-端第14～18、44～49、51～52、64～66、84～88這5個肽段內（圖9）。疏水性殘基往往位于蛋白質分子的核心處，而親水性殘基則主要分布于蛋白質分子的表面，與水環(huán)境相互作用。抗原表位的選擇是制備合成肽的關鍵，在這些共同肽段內或附近區(qū)域很可能是抗原表位的優(yōu)勢區(qū)域。

圖7 牙鲆Arginase蛋白二級結構分析結果

圖8 牙鲆Arginase蛋白二級結構模型分析結果

使用EMBOSS軟件包中的ANTIGENIC程序預測Arginase抗原表位，結果如下（按打分排名從高到低依次排列）：22～45（IPGFSWVKPFLSS RDLVYIGLRDV）1.135，5～13（GQPVAFMLK） 1.108，74～82（VMEVTLDHL）1.088，53～61（LKNLGIQYF）1.065。

圖9 牙鲆Arginase抗原表位預測結果

用ProPred預測能與大多數(shù)MHCⅡ類等位結合的肽段（圖10），預測到較好的結合肽分別是：69～77（38/51）、37～45（32/51）、63～68（25/51），括號內數(shù)字表示可結合的MHCⅡ類等位基因數(shù)/進行結合預測的全部MHCⅡ類等位基因數(shù)。

在MHCⅡ類結合肽和抗原表位的預測結果中發(fā)現(xiàn)，牙鲆Arginase蛋白37～45和74～77均出現(xiàn)在兩次預測的結果中，表明它們可能既是抗原表位又是MHC結合肽。

2.4.4系統(tǒng)進化樹的構建及同源性比較 利用GenBank數(shù)據(jù)庫、SWISS-PROT數(shù)據(jù)庫和EMBL數(shù)據(jù)庫，搜索到以下14種生物的Arginase蛋白序列：大菱鲆（Q71LX3，Scophthalmus maximus）、虹鱒（Q7T1U6，Oncorhynchus mykiss）、斑馬魚（Q6PH54，Daniorerio）、鯉魚（Q4A4U9，Cyprinus carpio）、牛蛙（AAA68073，Rana catesbeiana）、紅原雞（XP_421191，Gallus gallus）、兔（Q4VK78，Oryctolagus cuniculus）、羊（Q30DW3，Ovis aries）、褐家鼠（O08701，Rattus norvegicus）、馬（Q6DTK8，Equus caballus）、小家鼠（Q8R1Q7，Mus musculus）、牛（Q58DL1，Bos taurus）、狗（XP_537488，Canis familiaris）、人（P78540，Homo sapiens human）。用ClustalX1.8進行序列比對，再用Mega2構建系統(tǒng)進化樹。從構建的系統(tǒng)進化樹（圖11）中可看出，牙鲆精氨酸酶與大菱鲆、虹鱒、斑馬魚及鯉魚的同源性高，與兩棲類牛蛙同源性較低，而與哺乳類的人、馬等同源性最低。

圖10 牙鲆Arginase MHCⅡ類等位結合的肽段

圖11 不同動物精氨酸酶基因構建的系統(tǒng)進化樹

3 討論

在玉米中，精氨酸酶是氮素循環(huán)中催化精氨酸生成鳥氨酸和尿素的重要酶，可促進氮素的再利用，提高氮素的利用效率［3］。在人體中，精氨酸是肝癌細胞繁殖必需的酵素，而精氨酸酶是一種天然酵素，具有分解精氨酸的功能，有助于抑制癌細胞生長，精氨酸酶1在食管癌患者外周血中的高表達與MDSCs水平和食管癌的發(fā)生、發(fā)展有著密切關系［4］。目前，國外實驗室利用cDNA克隆技術已經獲得了大菱鲆［5］、虹鱒［6］、斑馬魚［7］、羅氏沼蝦［8］等多種魚蝦類的精氨酸酶部分序列或全長序列。現(xiàn)有的研究資料表明，多數(shù)魚類精氨酸酶的分布有組織特異性，一般在肝臟中精氨酸酶含量最高。在大菱鲆中30日齡前精氨酸酶基因表達水平一直很低，30日齡后隨日齡增加其表達量逐步上升，至47日齡（標志其底棲生活的開始）達最高峰，隨后表達量逐步下降，57日齡后再次上升至較低水平，比較精氨酸酶基因與甲狀腺激素受體TRα的表達模式，Oriane等［5］發(fā)現(xiàn)當TRα表達水平降低時，精氨酸酶基因表達水平開始升高，證實在大菱鲆胚胎后發(fā)育期間精氨酸酶基因和甲狀腺激素受體TRα的表達模式呈負相關。

本試驗用設計的引物和提取的變態(tài)期牙鲆仔魚總RNA進行RT-PCR，獲得了一條284 bp DNA片段并測序。同源性分析顯示目的基因與大菱鲆精氨酸酶基因的堿基序列及氨基酸序列的同源性較高，分別為91%和96%；與鯽魚（Q4A4U9，Cyprinus carpio）、斑馬魚（Q6PH54，Danio rerio）、虹鱒（Q7T1U6，Oncorhynchus mykiss）堿基序列及推測的氨基酸序列同源性分別為78%/85%、84%/84%和80%/82%。與人（P78540，Homo sapiens human）的氨基酸序列同源性為72%。證明本試驗所得到的目的基因片段是目前尚未見報道的牙鲆精氨酸酶基因核苷酸序列的一部分。本研究為重組牙鲆精氨酸酶基因的表達提供了可靠的基因材料，同時也為進一步研究該基因的結構和功能奠定了基礎。

［1］ 丁斐斐，李長紅，陳炯，等.香魚精氨酸酶II 基因的cDNA 克隆及其表達與鰻弧菌感染的相關性［J］.生物技術通報，2016，32（2）：109-115.

［2］ 顧春燕，肖鋒，錢錚，等.精氨酸酶-1在肝細胞癌中的低表達及其臨床意義［J］.中國癌癥雜志，2014（6）：438-445.

［3］ 張佩，楊小艷，邸宏，等.玉米精氨酸酶基因過表達載體的構建與遺傳轉化分析［J］.玉米科學，2012（6）：66-71.

［4］ 高晶晶，王旭輝，段唐海，等.精氨酸酶1在食管癌患者外周血的表達及其臨床意義［J］.免疫學雜志，2012（11）：58-61.

［5］ Oriane M，Marilyne D，Gerard T，et al.Molecular cloning and developmental expression patterns of thyroid hormone receptors and T3 target genes in the turbot（Scophtalmus maximus）during post-embryonic development［J］.Gen.Comp.Endocrinol，2004，135：345-357.

［6］ Wright P A，Campbell A，Morgan R L，et al.Dogmas and controversies in the handling of nitrogenous wastes：Expression of arginase TypeⅠ and Ⅱ genes in rainbow trout：influence of fasting on liver enzyme activity and mRNA levels in juveniles［J］.The Journal of Experimental Biology，2004，207：2033-2042.

［7］ Song H D，Sun X J，Deng M，et al.Hematopoietic gene expression profile in zebrafish kidney marrow［J］.Proc.Natl.Acad.Sci.USA，2004（101）：16240-16245.

［8］ 田榮，許婷，潘曉藝，等.羅氏沼蝦幼體精氨酸激酶基因的cDNA克隆及其在雙順反子病毒感染后的表達特征［J］.水生生物學報，2016（5）：908-913.

（責任編輯 崔建勛）

Cloning and sequencing of gene fragments of Paralichthys olivaceus arginase

LIU Hua1，SHI Ting-ting1，SHI Zhi-yi2
（1.R&D Center of Nanning Fresh-life Bio-technology Co.，Ltd，Nanning 530003，China；2.Research Center of Biotechnology，Shanghai Fisheries University，Shanghai 200090，China）

A pair of primers was designed and synthesized according to the conservative nucleotide sequence（GenBank）of Scophthalmus maximus，Cyprinus carpio，Oncorhynchus mykiss，Danio rerio，et al.Total RNA from Paralichthys olivaceus was extracted by using TRIzol Reagent．With the designed primers，a gene fragment was obtained using RT-PCR method．The PCR products were purified and then cloned into pUcm-T vector followed by sequencing．The results showed that a 284 bp gene fragment was obtained.Contrasted with other species，the gene sequence obtained in this experiment showed 96%，85%，84% and 82% homology with S.maximus，C.carpio，D.rerio，O.mykiss，respectively.Through sequencing the gene fragment of Arg by bioinformatics technique，we found that Arg had no SignalP，no O-glycosylation sites，and no transmembrane（TM）region，but had a character structure of arginase.There was a center of β-sheet in the N-terminal N0.38-44，57-64，71-76，89-94.And the N-terminal No.7-18，50-52，81-87，may be the Alpha regions of Arg protein.The N-terminal No.37-45，74-77，were the predominant epitopes.

Paralichthys olivaceus；arginase；molecular cloning；sequence analysis

S917

A

1004-874X（2016）12-0108-07

10.16768/j.issn.1004-874X.2016.12.019

2016-08-22

國家自然科學基金（30271017）；國家高等教育博士項目科研基金（20040264001）

劉華（1977-），男，碩士，工程師，E-mail：luckyliuh@126.com

施志儀（1954-），男，博士，教授，E-mail：314481590@qq.com

劉華，施婷婷，施志儀.牙鲆精氨酸酶基因片段的克隆及序列分析［J］.廣東農業(yè)科學，2016，43（12）：108-114.