蔡彬新，周逢芳，林則圣

（寧德師范學(xué)院生物系，福建 寧德 352100）

復(fù)合酶法制備海參內(nèi)臟ACE抑制肽工藝研究

蔡彬新，周逢芳，林則圣

（寧德師范學(xué)院生物系，福建 寧德 352100）

采取復(fù)合酶法探討海參內(nèi)臟中ACE抑制肽的制備工藝，研究溫度、時(shí)間、pH值、料液比、酶量5個(gè)因素對(duì)ACE抑制率和水解度的影響。通過單因素和正交試驗(yàn)，得到海參內(nèi)臟ACE抑制肽制備最佳工藝組合為A2B2C3D2，即反應(yīng)時(shí)間為5 h、溫度50℃、酶量2%、pH值為7.5，此條件下海參內(nèi)臟多肽ACE抑制率可達(dá)到55.4% 。

海參；ACE抑制肽；水解度；正交試驗(yàn)

海參（sea cucumber，Ludwigothurea grisea）為海參綱無脊椎棘皮動(dòng)物［1］，具有良好的藥用價(jià)值。近幾年，在海參中發(fā)現(xiàn)許多重要的生理活性物質(zhì)，如多肽、皂苷、膠原蛋白等［2-3］，研究發(fā)現(xiàn)，海參多肽具有很好的降血壓效果［4-5］。內(nèi)臟作為海參的一部分，在鮮海參加工過程中常被丟棄，如果能從中提取活性物質(zhì)再利用，不僅可避免因環(huán)境污染，而且能提高海洋生物開發(fā)利用的附加值。

為使海參內(nèi)臟加工副產(chǎn)物實(shí)現(xiàn)資源化高附加值利用，本研究選用海參內(nèi)臟作為原料，采用復(fù)合蛋白酶水解方法制備海參內(nèi)臟ACE抑制肽，通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)相結(jié)合的方法，對(duì)復(fù)合蛋白酶水解條件進(jìn)行優(yōu)化。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試海參購(gòu)于寧德霞浦海參養(yǎng)殖場(chǎng)；中性蛋白酶（酶活力6萬U/g）、風(fēng)味蛋白酶（20萬U/g）購(gòu)于北京索萊寶科技有限公司；血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（ACE）、馬尿酰組氨酰亮氨酸（HHL）購(gòu)于Sigma公司；其他化學(xué)試劑均為AR試劑，購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)有限公司。

儀器：MC電子天平（奧豪斯公司），UV2550紫外光分光光度計(jì)（日本島津），PB-10PH計(jì)（上海般特公司），高速冷凍離心機(jī)（sigma公司），1200高效液相色譜儀（安捷倫公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1海參內(nèi)臟ACE抑制肽制備工藝 將海參內(nèi)臟洗凈，組織絞碎，取一定量攪碎物，加入2倍體積蒸餾水及適量的復(fù)合蛋白酶（中性蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶，1∶1），調(diào)節(jié)pH值，在一定溫度下，保溫水解一定時(shí)間。水解完沸水浴滅酶10 min 后，于4℃、12 000 r/min 離心15 min，取上清液，獲得海參酶解液，測(cè)定其水解度和ACE抑制率。

1.2.2單因素試驗(yàn) （1）pH值：固定料液比1∶2、水解溫度50℃、水解時(shí)間5 h、加酶量2%，探討初始pH值6、6.5、7、7.5、8等5個(gè)不同水平對(duì)海參內(nèi)臟ACE抑制率和水解度的影響。

（2）溫度：固定料液比1∶2、pH值7、水解時(shí)間5 h、加酶量2%，探討反應(yīng)溫度為45、50、55、60、65℃等5個(gè)不同水平對(duì)海參內(nèi)臟ACE抑制率和水解度的影響。

（3）酶量：固定料液比1∶2、水解溫度50℃、pH值7、水解時(shí)間5 h，探討加酶量1%、1.5%、2%、2.5%、3%等5個(gè)不同水平對(duì)海參內(nèi)臟ACE抑制率和水解度的影響。

（4）料液比：水解溫度50℃、pH值7、水解時(shí)間5h、加酶量2%，探討料液比1∶1、1∶2、1∶3、1∶4和1∶5等5個(gè)不同水平對(duì)海參內(nèi)臟ACE抑制率和水解度的影響。

（5）反應(yīng)時(shí)間：固定料液比1∶2、水解溫度50℃、pH值7、加酶量2%，探討反應(yīng)時(shí)間3、4、5、6、7 h 等5個(gè)不同水平對(duì)海參內(nèi)臟ACE抑制率和水解度的影響。

1.2.3正交試驗(yàn) 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，設(shè)計(jì)L9（34）正交試驗(yàn)，以水解時(shí)間（A）、溫度（B）、酶濃度（C）、pH（D）4個(gè)因素進(jìn)行試驗(yàn)，各因素水平見表1。

表1 L9（34）正交試驗(yàn)因素水平

1.3 測(cè)定項(xiàng)目及方法

原料中的總氮含量：采用凱氏定氮法（GB／T 5009.5.2010） 測(cè)定。

氨基氮量測(cè)定：分別用茚三酮法［6］和甲醛滴定法［7］測(cè)定水解度，比較分析兩種方法的測(cè)定結(jié)果，選擇一種合適的方法進(jìn)行海參內(nèi)臟水解液氨基氮量的測(cè)定。

式中，A為原料中總氮量，B為水解液中的α-氨基氮量。

水解液ACE抑制率測(cè)定：根據(jù)Cushman方法［8］改進(jìn)，取2.0 mg/mL刺參酶解液40 μL，加入25 mU/mL ACE溶液20 μL，于37℃下保溫5 min后加入HHL溶液50 μL開始反應(yīng)，反應(yīng)60 min后加入1.0 mol/L HCl 200 μL中止反應(yīng)，得到反應(yīng)液，利用HPLC進(jìn)行分析測(cè)定；同時(shí)用pH 8.3的硼酸緩沖液40 μL替代刺參酶解液制備反應(yīng)液，作空白對(duì)照。色譜檢測(cè)條件：色譜柱Zorbax SB-C18分析柱（4.6×250 mm，填料粒徑5 μm）；柱溫：25℃；流動(dòng)相∶乙睛-水（25∶75，V/V，各含0.1%三氟乙酸）；流速：1 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：228 nm；進(jìn)樣量：10 μL。

式中，M為空白對(duì)照中馬尿酸的峰面積，N為樣品中馬尿酸的峰面積。

2 結(jié)果與分析

2.1 水解度測(cè)定方法

茚三酮法和甲醛滴定法測(cè)定海參內(nèi)臟蛋白水解度分別為25.1%和24.2%，說明采用茚三酮法和甲醛滴定法測(cè)定海參蛋白水解度差別不大，故兩種方法都可用于測(cè)定其水解度。由于茚三酮法所用的顯色劑穩(wěn)定性較差，導(dǎo)致比色時(shí)讀數(shù)不穩(wěn)定，且采用單一的甘氨酸作標(biāo)準(zhǔn)，不同的氨基酸對(duì)茚三酮的顯色程度都有一定的偏差，因此本試驗(yàn)選擇甲醛滴定法測(cè)定水解度。

2.2 海參內(nèi)臟ACE抑制肽制備單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1反應(yīng)溫度對(duì)水解度和ACE抑制率的影響 由圖1可知，隨反應(yīng)溫度的升高，海參內(nèi)臟蛋白水解度呈先上升后下降的趨勢(shì)，溫度為50℃時(shí)水解度最高，為26.5%，55～60℃水解度下降較快；同時(shí)，ACE抑制率也呈先上升后下降的趨勢(shì)，溫度為50℃時(shí)，ACE抑制率最高、為48.6%。這可能是由于溫度較低時(shí)，升溫能加快反應(yīng)速度，而溫度過高則會(huì)破壞酶結(jié)構(gòu)，反而降低酶解效率。因此選擇50℃作為水解海參內(nèi)臟多肽的最佳溫度。

圖1 反應(yīng)溫度對(duì)水解度和ACE抑制率的影響

2.2.2反應(yīng)時(shí)間對(duì)水解度和ACE抑制率的影響 由圖2可知，隨反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)海參水解度先上升后平緩，而ACE抑制率4～6 h范圍內(nèi)呈上升趨勢(shì)，6～8 h開始下降。水解度的變化趨勢(shì)可能是由于在6 h前，酶量較多，海參蛋白酶解快，但反應(yīng)6 h后酶已經(jīng)用完，也可能是海參蛋白已酶解到一定程度使酶與其結(jié)合的機(jī)率降低，從而導(dǎo)致酶解速度降低；ACE抑制率早期上升趨勢(shì)主要是因?yàn)殡S著水解度增加，多肽量增多導(dǎo)致抑制率增大，而5 h后抑制率降低，可能是過度水解生成了ACE抑制活性較低的小分子多肽。綜合考慮反應(yīng)溫度對(duì)水解度和ACE抑制率的影響，選擇5 h作為水解海參多肽的最佳酶解時(shí)間。

圖2 反應(yīng)時(shí)間對(duì)水解度和ACE抑制率的影響

2.2.3初始pH值對(duì)水解度和ACE抑制率的影響 由圖3可知，當(dāng)初始pH值較低時(shí)，水解度和ACE抑制率都先升高后降低，但總體變化幅度較小。原因可能是雖然每種酶都有最適pH值，由中性蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶組成的復(fù)合酶其最適pH值范圍較廣，在6.5～7.5間都適合，對(duì)水解效果影響小。

圖3 pH值對(duì)水解度和ACE抑制率的影響

2.2.4酶量對(duì)水解度和ACE抑制率的影響 由圖4可知，隨著酶量的增加水解度也增加，當(dāng)加酶量達(dá)2.5%左右時(shí)，趨于平衡。ACE抑制率在不同的酶與底物濃度下差異顯著，在酶量1%～1.5%的范圍內(nèi)，ACE抑制率顯著增大；隨后減小，酶量2%～2.5%間ACE抑制率顯著減小，而后趨于平緩。原因可能是初期底物多、酶量少時(shí)，酶反應(yīng)次數(shù)多，多數(shù)大分子蛋白在較短時(shí)間內(nèi)被降解成小分子肽，而當(dāng)酶量過高時(shí)，受底物數(shù)量的限制，水解度不再增加。對(duì)于抑制率的現(xiàn)象可能是初期隨著酶解產(chǎn)生有活性的多肽，但隨著酶用量的增大，造成過度水解生成了ACE抑制活性較低的小分子多肽。綜合考慮反應(yīng)溫度對(duì)水解度和ACE抑制率的影響，選擇2%酶量作為水解海參多肽的最佳酶量。

圖4 酶量對(duì)水解度和ACE抑制率的影響

2.2.5料液比對(duì)水解度和ACE抑制率的影響 由圖5可知，隨著料水比的增加，水解度和ACE抑制率呈遞增趨勢(shì)，到料液比1∶2時(shí)開始下降。原因可能是反應(yīng)中水增加，降低了底物與酶的濃度，造成底物與酶結(jié)合機(jī)會(huì)的降低，從而降低酶解效率。ACE抑制率隨著水解度的降低，多肽量減少使抑制率降低，因此選擇1∶2作為試驗(yàn)水解海參內(nèi)臟多肽的最佳料液比。

圖5 料液比對(duì)水解度和ACE抑制率的影響

2.3 海參內(nèi)臟ACE抑制肽制備工藝的優(yōu)化

海參內(nèi)臟ACE抑制肽單因素分析結(jié)果表明，水解度和ACE抑制率變化并不一一對(duì)應(yīng)，但由于制備ACE抑制率效果好的海參內(nèi)臟多肽是本試驗(yàn)的主要目的，因此選擇ACE抑制率作為指標(biāo)，進(jìn)行4因素（A 時(shí)間、B 溫度、C pH值、D酶濃度）3水平L9（34）正交試驗(yàn)，結(jié)果見表2。從表2可以看出，影響ACE抑制率強(qiáng)度的各因素依次為水解時(shí)間＞溫度＞酶濃度＞pH，最優(yōu)組合為A2B2C3D2，即反應(yīng)時(shí)間為5 h、溫度50℃、pH值為7.5、酶量2%。

表2 海參內(nèi)臟ACE抑制肽制備正交試驗(yàn)結(jié)果

為彌補(bǔ)極差分析方法缺陷，進(jìn)一步對(duì)正交試驗(yàn)進(jìn)行方差分析，判斷各因素對(duì)ACE抑制率的影響作用是否顯著，結(jié)果見表3。由表3可知，水解溫度、水解時(shí)間、酶濃度等因素對(duì)ACE抑制率影響作用顯著，pH值影響不顯著。

表3 正交試驗(yàn)方差分析結(jié)果

3 結(jié)論

多肽的制備方法有酶法、堿法等，酶解法條件溫和，肽的活性破壞小，水解過程中的環(huán)境污染小。酶法制備ACE抑制肽常用的酶有多種，不同酶對(duì)蛋白的切割位點(diǎn)不同，產(chǎn)生的多肽不同，即使同一種酶在不同條件下其酶解的能力也有很大區(qū)別。本試驗(yàn)選用復(fù)合酶酶解海參內(nèi)臟蛋白產(chǎn)生ACE活性肽，并對(duì)海參內(nèi)臟蛋白的水解條件進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果表明，影響ACE抑制率強(qiáng)度的各因素依次為水解時(shí)間＞溫度＞酶濃度＞pH，即水解溫度、水解時(shí)間和酶濃度對(duì)ACE抑制率影響作用顯著，pH值對(duì)其影響不顯著，最優(yōu)組合為A2B2C3D2，即反應(yīng)時(shí)間為5 h、溫度50℃、酶量2%、pH值為7.5，在此條件下ACE抑制率55.4%。

［1］ 廖玉麟.中國(guó)動(dòng)物志·棘皮動(dòng)物門海參綱［M］.北京：科學(xué)出版社，1997.

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［3］ 趙芹.海參膠原蛋白多肽抗氧化的研究［D］.青島：中國(guó)海洋大學(xué)，2008.

［4］ 趙元暉，李八方，曾名湧，等.一種低值海參蛋白酶解物降血壓活性的研究［J］.漁業(yè)現(xiàn)代化，2009，36（1）：56-59.

［5］ 朱小杰，曾名湧，馬桂蘭，等.海地瓜蛋白酶解物類蛋白反應(yīng)修飾及其對(duì)ACE活性的影響［J］.中國(guó)海洋藥物雜志，2011，30（6）：6-12.

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［7］ 楊文博，張英華.蛋白質(zhì)水解度的測(cè)定方法研究［J］.中國(guó)調(diào)味品，2014，39（3）：88-91.

［8］ Fitz Gerald R J，Meisel H.Milk protein-derived peptide inhibitors of Angiotmsin- converting enzyme［J］.BrJNutr，2000，84：33-37.

（責(zé)任編輯 鄒移光）

Preparation of ACE inhibitory peptides from sea cucumber viscera by complex enzyme

CAI Bin-xin，ZHOU Feng-fang，LIN Ze-sheng
（Department of Biology，Ningde Normal University，Ningde 352100，China）

The method of complex enzyme was used to prepare ACE inhibitory peptides from sea cucumber viscera， and five factors affecting peptides preparation，such as temperature，time，the ratio of solid toliquid， pH and amount of enzyme were studied.The optimal parameters for the preparation of ACE inhibitory peptides were determined through single factor experiment and orthogonal test as follows：temperature at 50℃ ，time for 5 h，pH 7.5 and amount enzyme of 2%.Under these conditions，ACE inhibitory rate was up to 55.4%.

sea cucumber；ACE inhibitory peptides；degree of hydrolysis（DH）；orthogonal test

TS254.9

A

1004-874X（2016）12-0085-05

10.16768/j.issn.1004-874X.2016.12.015

2016-08-10

福建省科技重點(diǎn)項(xiàng)目（2014N0016）；寧德市科技局項(xiàng)目（20130139）；寧德師范學(xué)院服務(wù)海西項(xiàng)目（2012H315）

蔡彬新（1983-），女，碩士，講師，E-mail：binxin3@sina.com;zhoufengfang123@163.com

蔡彬新，周逢芳，林則圣.復(fù)合酶法制備海參內(nèi)臟ACE抑制肽工藝研究［J］.廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，43（12）：85-89.