宋 順，黃東梅，徐碧玉，金志強，孫 威，許桂鶯，李敬陽，許 奕，

（1.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院海口實驗站，海南 ?？?570102；

2.海南省香蕉遺傳改良重點實驗室，海南 ?？?570102；

3.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院熱帶生物技術研究所/農(nóng)業(yè)部熱帶作物生物學與遺傳資源利用重點實驗室，海南 ?？?571101）

非生物脅迫對水通道蛋白啟動子活性的調(diào)節(jié)作用

宋 順1，2，黃東梅1，2，徐碧玉3，金志強1，2，孫 威1，2，許桂鶯1，2，李敬陽1，2，許 奕1，2，3

（1.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院?？趯嶒炚荆Ｄ??？?570102；

2.海南省香蕉遺傳改良重點實驗室，海南 海口 570102；

3.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院熱帶生物技術研究所/農(nóng)業(yè)部熱帶作物生物學與遺傳資源利用重點實驗室，海南 ?？?571101）

前期通過染色體步移法克隆得到巴西蕉水通道蛋白基因MaPIP1-2上游841 bp的啟動子序列，分析其啟動子序列含有響應干旱和高鹽等非生物脅迫的順式作用元件。為了進一步研究該啟動子的功能，成功構建MaPIP1-2基因啟動子的植物表達載體，并且轉(zhuǎn)化擬南芥，在MaPIP1-2：：GUS 轉(zhuǎn)基因擬南芥中發(fā)現(xiàn)，MaPIP1-2啟動子活性受到干旱和高鹽的誘導表達，隨著濃度增加，其啟動活性增強。

水通道蛋白；啟動子；逆境；GUS

香蕉是熱帶、亞熱帶地區(qū)最重要的經(jīng)濟作物之一，被聯(lián)合國糧農(nóng)組織（FAO）定位為發(fā)展中國家僅次于水稻、小麥、玉米之后的第四大糧食作物。香蕉前期植株較小，根系淺生，易受旱。在栽培生產(chǎn)中，香蕉耗水量大，缺水會導致香蕉變小、果實數(shù)量減少和營養(yǎng)器官生長發(fā)育不良，從而造成減產(chǎn)［1］。因此，提高香蕉抗旱能力對于香蕉生產(chǎn)至關重要。研究相關的功能基因來提高香蕉抵御干旱及非生物脅迫的能力是一個重要途徑。

水通道蛋白（aquaporins，AQPs）具有轉(zhuǎn)運水和其他小分子（如甘油、尿素）的功能，在植物適應逆境脅迫方面起重要作用［2］。有關報道顯示，植物能夠通過調(diào)節(jié)AQP的表達響應多種非生物逆境的脅迫，AQP的活性直接受磷酸化調(diào)控，其受非生物脅迫［3］、ABA和乙烯等植物激素［3-5］、H2O2［6］等一系列的刺激影響。在200 mmol/L NaCl的處理下，大麥 HvPIP2能夠調(diào)節(jié)水分的流失，在非洲爪蟾卵母細胞中表現(xiàn)出了較強的水轉(zhuǎn)運活性［3］，外源ABA能夠提高太陽花和玉米根部的導水率［7］。對玉米中“冷忍耐型”和“冷敏感型”的AQP功能進行研究表明，“冷忍耐型”的AQP活性更高，是由于氧化作用減少了對膜的損害［6］。在植物中過量表達一些AQP家族基因能夠提高轉(zhuǎn)基因植物對干旱脅迫的耐受性［8-11］。例如，過表達TaAQP7提高了轉(zhuǎn)基因煙草對干旱脅迫的耐受性［11］。在擬南芥中轉(zhuǎn)化大麥TaTIP2;2提高了轉(zhuǎn)基因擬南芥對干旱脅迫的耐受性［12］。

干旱和鹽等非生物脅迫極大影響了植物的生長發(fā)育和新陳代謝［13-14］。而植物本身具有自身能夠響應存在多種對這些脅迫的適應機制，這些響應機制能夠幫助植物在非生物脅迫中迅速產(chǎn)生反應得以生存。植物對干旱和高鹽脅迫的應答主要是通過對脅迫信號的感知和對脅迫信號的轉(zhuǎn)導，從而作出應答反應而降低脅迫所導致的傷害。

目前，調(diào)控該基因響應干旱和鹽等非生物脅迫的機制仍未有相關報道。前期通過染色體步移法克隆出香蕉MaPIP1-2啟動子，并對該啟動子序列進行初步預測，本試驗將該啟動子構建植物表達載體，進一步通過農(nóng)桿菌介導法轉(zhuǎn)化擬南芥，研究不同誘導條件下GUS蛋白的活性差異，為進一步研究MaPIP1-2基因在香蕉抗逆途徑中的功能奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

擬南芥野生型種子為中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院熱帶生物技術研究所保存并提供。

大腸桿菌感受態(tài)DH5α和農(nóng)桿菌EHA105購自天根公司；植物表達載體Pcambia1304為本實驗室保存。

DNA Marker、Ex Taq II、pMD18-T購自TakaRa 公司，5-溴-4-氯-3-吲哚-β-葡萄糖苷酸（X-Gluc）和茉莉酸甲酯（MeJA）為Sigma 公司產(chǎn)品，質(zhì)粒提取試劑盒購自Omega Bio-Tek公司，其他化學藥品為分析純。

1.2 試驗方法

1.2.1GUS融合瞬時表達載體的構建 選用Pcambia 1304植物表達載體構建試用于啟動子瞬時表達的GUS表達基因融合載體，以NcoI和SpeI酶切pMD18- T/ MaPIP1-2重組質(zhì)粒和Pcambia 1304空載體，分別回收啟動子片段和線性載體，連接，轉(zhuǎn)化DH5α后進行菌液PCR及酶切檢測，重組質(zhì)粒命名為MaPIP1-2：：GUS。

1.2.2轉(zhuǎn)化擬南芥及其篩選鑒定 將構建好的重組質(zhì)粒MaPIP1-2：：GUS轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌菌株EHA105中，PCR鑒定后保存。將已轉(zhuǎn)化有pCAMBIA1304-MaAQP1的農(nóng)桿菌，加到含有Kan和Rif抗生素的LB培養(yǎng)基中，28℃振蕩10 h，加入擬南芥轉(zhuǎn)基因浸潤液（1/2MS，50 g/L Sucrose）中，將擬南芥倒置浸染到菌液中，采用花序浸染法進行轉(zhuǎn)化。將轉(zhuǎn)化后的擬南芥于濕度較大的暗培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，后移至23℃、光照12 h條件下生長。待其收獲種子后，將晾干的種子以75%乙醇+0.02% Triton X100溶液浸泡10 min，移除乙醇溶液，重復2～3次，將種子吹打到無菌濾紙上，風干；將晾干的種子撒播在選擇培養(yǎng)基（1/2MS，1.5% Sucrose，0.7% Agra，25 μg/mL hygromycin B）上；4℃黑暗處理3 d后轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)房中，在23℃條件下生長，10 d后選擇能正常生長的幼苗移栽到花缽中，篩選到T3純合系后進行PCR檢測，保存轉(zhuǎn)基因擬南芥種子用于后續(xù)試驗。

1.2.3非生物脅迫 將轉(zhuǎn)基因擬南芥種子進行以下處理：（1）播撒在0、50、100、150 mmol/L NaCl 的MS培養(yǎng)基上進行高鹽處理，15 d后觀察形態(tài)及GUS測定。（2）播撒在0、100、200、300 mmol/L 甘露醇的MS培養(yǎng)基上進行模擬干旱處理，15 d后觀察形態(tài)及GUS測定。

1.2.4組織化學染色與GUS蛋白定量分析 GUS蛋白的組織染色法參照 Jefferson 法（Jefferson，1987）。將脅迫處理后 的 葡 萄 葉片 放 置 于 GUS 染色〔10 mmol/L Na2EDTA，100 mmol/L NaH2PO4，0.5 mmol/L K4Fe（CN）6·3H2O，0.1% Triton X-100 和 0.5 mg/L X-Gluc〕中，在 37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 24 h 后使用 70%乙醇脫色。GUS蛋白熒光定量方法參照Jefferson法（Jdfferson，1988），GUS 活性定量結(jié)果通過每毫克蛋白每分鐘產(chǎn)生 4-methylumbelliferon（4-MU）的量來確定。GUS活性測定試驗3次重復。

2 結(jié)果與分析

2.1 GUS表達載體的構建

為了進一步研究MaPIP1-2啟動子在不同非生物脅迫下的GUS表達活性，構建了MaPIP1-2：：GUS融合表達載體。在上游引物AP1和下游引物SP3分別加入NcoI和SpeI內(nèi)切酶，將pMD18- T/ MaPIP1-2和Pcambia 1304載體同時用NcoI和SpeI內(nèi)切酶進行酶切后，回收目的片段后連接轉(zhuǎn)化，PCR以及雙酶切鑒定如圖1所示，結(jié)果表明PCR產(chǎn)物和酶切條帶均為841 bp。

圖1 MaPIP1-2啟動子載體構建的PCR 及NcoI和SpeI雙酶切鑒定結(jié)果

2.2 不同非生物脅迫對轉(zhuǎn)基因擬南芥GUS表達的影響

將構建好的MaPIP1-2：：GUS融合表達載體轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌EHA105中，使用化學組織染色和GUS蛋白定量方法驗證MaPIP1-2啟動子對干旱和高鹽脅迫的誘導響應。結(jié)果顯示，隨著鹽濃度的增加，轉(zhuǎn)基因株系的根系變短，且主根顏色加深（圖2A）；當甘露醇濃度為100 mmol/L時，其根部下端明顯加深，而當濃度為200 mmol/L時，其除了根部下端加深外，靠近葉片下端也明顯加深，當濃度增加為300 mmol/L時，該轉(zhuǎn)基因植株根系明顯縮短，且整個根系都加深（圖2B）?？梢?，隨著甘露醇濃度以及鹽濃度的增加，轉(zhuǎn)化MaPIP1-2啟動子的擬南芥植株GUS染色加深，表達增強，說明其受到干旱和高鹽脅迫的響應。

圖2 干旱和鹽脅迫對MaPIP1-2啟動子活性的影響 （GUS染色測定）

2.3 不同非生物脅迫對MaPIP1-2啟動子GUS酶活性的影響

利用 GUS 蛋白定量方法進一步分析啟動子活性。結(jié)果（圖3）顯示，隨著NaCl濃度的增加，MaPIP1-2啟動子GUS活性也遞增，當NaCl濃度為150 mmol/L時，其GUS酶活性為對照的1.85倍。經(jīng)100 mmol/L甘露醇處理后，MaPIP1-2啟動子的GUS活性約是對照的1.35倍，隨著濃度增加，GUS活性遞增，當甘露醇濃度達到300 mmol/L時，其GUS活性為對照的2.08倍。

圖3 不同濃度NaCl和甘露醇處理下MaPIP1-2啟動子GUS蛋白活性

3 結(jié)論與討論

啟動子是基因表達調(diào)控的關鍵順式作用元件，也是基因工程表達載體的一個重要元件。對啟動子結(jié)構和功能的闡釋，有助于基因表達的時空控制。選擇恰當方法克隆序列未知的啟動子有著非常重要的意義和廣闊的應用前景。

前期克隆得到水通道蛋白基因的啟動子序列并初步分析其順式作用元件，其中含有與非生物脅迫相關的如WUN-motif與傷害相關，TCA-element與鹽脅迫相關，這些均與該基因在響應外界非生物脅迫的功能相對應。轉(zhuǎn)錄調(diào)控是基因表達階段中最主要的調(diào)控方式，該過程是反式作用因子與靶基因上游相關順式作用元件進行結(jié)合，從而調(diào)節(jié)基因表達［15］。近年來的研究表明，許多植物基因的表達都受逆境脅迫的誘導，抗逆基因的表達又是依靠其上游啟動子的調(diào)控來實現(xiàn)的。啟動子是起始基因轉(zhuǎn)錄的一段 DNA 序列，是基因表達調(diào)控的關鍵點［16］。在本研究中，通過用NaCl和甘露醇處理轉(zhuǎn)化MaPIP1-2啟動子的擬南芥植株，發(fā)現(xiàn)該植株隨著處理濃度的增加，該啟動子的GUS活性也增加，說明其受到NaCl和甘露醇的誘導，而在該啟動子順式作用元件中也找到與脅迫相關的元件。

水通道蛋白基因?qū)τ谥参锏乃制胶馄鹬匾饔茫诟珊得{迫下該基因具有不同的表達模式［17］。在擬南芥中大部分的水通道蛋白基因受到干旱脅迫下調(diào)表達［18］，而其中的AtPIP1;4 的表達卻呈現(xiàn)上調(diào)趨勢［19］。在葡萄中，水分脅迫導致葡萄根中VvPIP1;1的表達上調(diào)近3倍［20］。水通道蛋白表達的下調(diào)可能是減少植物自身水分散失和維持葉片膨壓的一種方式，而該基因的上調(diào)可能會使外源的水分進入植物的器官或者細胞，避免外界干旱脅迫對植物造成的損傷［17，19］。本研究中MaPIP1-2在模擬干旱脅迫的甘露醇中表達上調(diào)，說明該基因在干旱脅迫下對保護植物自身避免損傷中發(fā)揮著一定作用。

本研究是在前期研究的基礎上，為了進一步研究該啟動子的功能，將該啟動子構建植物表達載體，并用不同的脅迫處理研究該啟動子的活性。研究結(jié)果將進一步對揭示MaPIP1-2啟動子的啟動機理和活性提供依據(jù)，后續(xù)工作將對該啟動子的啟動原理及與上游轉(zhuǎn)錄因子的相互結(jié)合作進一步深入研究。

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（責任編輯 崔建勛）

Regulation of abiotic stress on aquaporin promoter activity

SONG Shun1，2，HUANG Dong-mei1，2，XU Bi-yu3，JIN Zhi-qiang1，2，SUN Wei1，2，XU Gui-ying1，2，LI Jing-yang1，2，XU Yi1，2，3
（1.Haikou Experimental Station，Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences，Haikou 570102，China；
2.Hainan Key Laboratory of Banana Genetic Improvement，Haikou 570102，China；
3.Key Laboratory of Biology and Genetic Resources of Tropical Crops，Ministry of Agriculture/Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology，Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences，Haikou 571101，China）

A 841bp sequence of MaPIP1-2 promoter was isolated from banana （Musa acuminat L.AAA group cv.Brazilian） through chromosome walking PCR.PLACE analysis indicated that MaPIP1-2 promoter contatined abiotic stress-responsive elements，such as drought-responsive elements and salt-related cis-elements.To investigate the function of the promoter，the plant expression vector with MaPIP1-2 promoter was successfully constructed and transformed into Arabidopsis thaliana.In MaPIP1-2：：GUS-expressing Arabidopsis，the activity of MaPIP1-2 promoter was found to be associated with the drought and salt treatment.The activity of MaPIP1-2 promoter was enhanced with the increasing concentration of salt and mannitol.

aquaporin；promoter；stress；GUS

Q784

A

1004-874X（2016）12-0001-05

10.16768/j.issn.1004-874X.2016.12.001

2016-09-20

國家自然科學基金（31501371）

宋順（1984-），男，碩士，助理研究員，E-mail：sss1984006@163.com

許奕（1985-），女，碩士，助理研究員，E-mail：lukydog163@163.com

宋順，黃東梅，徐碧玉，等.非生物脅迫對水通道蛋白啟動子活性的調(diào)節(jié)作用［J］.廣東農(nóng)業(yè)科學，2016，43（12）：1-5.