李龍飛，李宇琛，吳天興，夏良友，曹杰，王 雙，卜仕金*

(1.揚州大學獸醫(yī)學院，江蘇揚州 225009；2.江蘇省動物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇揚州 225009)

托芬那酸注射液在犬體內(nèi)的生物等效性研究

李龍飛1,2，李宇琛1,2，吳天興1,2，夏良友1,2，曹杰1,2，王 雙1,2，卜仕金1,2*

(1.揚州大學獸醫(yī)學院，江蘇揚州 225009；2.江蘇省動物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇揚州 225009)

為研究國產(chǎn)和進口托芬那酸注射液在犬體內(nèi)的藥代動力學和生物等效性，采用雙處理、雙周期隨機交叉試驗設(shè)計，將20頭健康比格犬隨機分成2組，按 0.1 mL/kg 體重肌肉分別單劑量注射受試制劑和參比制劑，采用高效液相色譜法測定血漿中托芬那酸的濃度，利用 WinNonlin6.3軟件計算主要藥動學參數(shù)，并評價兩種制劑的生物等效性。結(jié)果顯示，受試制劑和參比制劑的Tmax分別為(0.2±0.1)h和(0.3±0.2)h; Cmax分別為(5.12±1.55) μg/mL和(5.38±2.04) μg/mL;AUC0-t分別為(12.1±2.97) μg·h·mL-1和(12.28±3.24) μg·h·mL-1;AUC0-∞分別為(13.38±3.10)μg·h·mL-1和(13.85±3.40) μg·h·mL-1。托芬那酸注射液受試制劑和參比制劑的AUC0-t、AUC0-∞、Cmax、Tmax均無顯著性差異(P>0.05)。雙單側(cè)t檢驗結(jié)果顯示兩種制劑生物等效，臨床上可相互替代。該試驗為獸醫(yī)臨床給藥方案的制定以及合理用藥提供參考。

托芬那酸注射液；藥代動力學；生物等效性；高效液相色譜

托芬那酸是由丹麥GEA公司開發(fā)的一種應用廣泛的非甾體抗炎藥品(NSAID)，具有較強的抗炎作用，副作用小[1]。目前，托芬那酸在國外已上市，主要用于治療關(guān)節(jié)炎和偏頭疼，也被廣泛應用于痛風、滑囊炎和痛經(jīng)等疾病的治療。托芬那酸還可作為寵物藥用于狗、貓緩解骨關(guān)節(jié)相關(guān)的炎癥和疼痛，還可用于犬、牛等家畜上呼吸道疾病的輔助治療。托芬那酸在動物機體內(nèi)完全作為托芬那酸的甘氨酸及葡萄糖醛酸結(jié)合物形式通過尿液排泄(90%)，沒有嚴重的特異性的毒性反應[2]，在獸醫(yī)臨床上具有非常廣闊的市場前景。目前，對于托芬那酸血藥濃度測定方法國內(nèi)報道的很少。鑒于其藥物作用范圍廣，毒性反應小，具有一定的應用價值。國內(nèi)青島農(nóng)業(yè)大學現(xiàn)成功仿制了該產(chǎn)品，為此按照生物等效性試驗相關(guān)規(guī)范要求，以犬為研究對象，按照農(nóng)業(yè)部頒發(fā)的《獸藥藥物動力學試驗規(guī)范(試行)》的試驗要求，在建立一種簡單、快速、準確的犬血漿中托芬那酸的含量的測定方法同時，通過對國產(chǎn)托芬那酸注射液在犬體內(nèi)的藥代動力學特征研究，并與國外原創(chuàng)托芬那酸注射液進行比較及生物等效性分析，以便為國產(chǎn)托芬那酸注射的研制提供重要參考依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器 高效液相色譜儀：Agilent1260型高效液相色譜儀，Agilent公司；色譜柱：ZORBAX Eclipse Plus-C18(250×4.6mm，5μm)，Agilent公司；UPH-11-20T型優(yōu)普超純水制造系統(tǒng)：成都超純科技有限公司；RE-52旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：上海亞榮生化儀器廠；N-EVAPTM112型干浴氮吹儀:美Organo-mation公司;KS-250D超聲儀：寧波科生儀器廠；WH-1微型漩渦混合儀：上海滬西分析儀器廠有限公司；TGL-16C型高速離心機：上海安亭科學儀器廠。WH-1微型漩渦混合儀：上海滬西分析儀器廠有限公司；TGL-16C型高速離心機：上海安亭科學儀器廠；可調(diào)微量移液器：1～10 μL、20～200 μL、100～1000 μL，熱電(上海)儀器有限公司。指形管(5 mL及1.5 mL)，揚子化工玻璃儀器有限公司。

1.2 藥品與試劑 托芬那酸注射液受試品：規(guī)格為50 mL：2 g，生產(chǎn)批號：20141221，青島農(nóng)業(yè)大學提供，生產(chǎn)企業(yè)為施維雅(青島)生物制藥有限公司。托芬那酸注射液參比品：規(guī)格為30 mL：1.2 g，生產(chǎn)批號：6A1689D，有效期至2018年1月10日，生產(chǎn)商為法國威隆隆制藥股份有限公司。托芬那酸標準品：含量100%，批號：BP 907-F67029，貨號Y0000154，由青島農(nóng)業(yè)大學郝智慧教授饋贈。甲醇、乙腈，均為色譜純，美國TEDIA公司；醋酸，醋酸鈉，均為色譜純，德國CNW公司；超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 試驗動物 20頭1～2歲內(nèi)的健康比格犬，平均體重為8.87±0.84 kg，公母各半。受試犬購自揚州四方實驗動物科技有限公司，符合國家實驗動物標準普通級實驗動物微生物學、寄生蟲學等等級要求，且在試驗前1 d經(jīng)獸醫(yī)檢查確認是處于良好的健康狀況下，試驗前1個月內(nèi)未用過相關(guān)藥物治療。試驗犬于實驗前在新環(huán)境經(jīng)過至少1周的適應期。給藥前禁食過夜12 h，2 h后恢復正常飲食。飼料為不添加任何藥物的全價飼料。

2.2 實驗設(shè)計與給藥方案 20頭體重較一致的犬隨機分為2組，每組犬公母各半，采用交叉實驗設(shè)計。第一階段1～10號犬單劑量(0.1 mL/kg bw)肌內(nèi)注射托芬那酸受試品注射液，11～20號犬單劑量(0.1 mL/kg bw)肌內(nèi)注射托芬那酸參比品注射液；第二階段1～10號犬單劑量(0.1 mL/kg bw)肌內(nèi)注射托芬那酸參比品注射液，11～20號犬單劑量(0.1mL/kg bw)肌內(nèi)注射托芬那酸受試品注射液。兩階段給藥間隔期為2周。

2.3 血樣采集 犬站立保定后經(jīng)前肢靜脈采血。給藥前采空白血，記為0 min。肌內(nèi)注射給藥后分別于5、10、15、30、45 min和1、2、3、4、8、12、24、36、48 h采血。每次采血量約4 mL。血樣采集后置于用肝素浸潤并烘干的離心管內(nèi)，4500 r/min離心10 min，分離血漿后于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.4 色譜條件 色譜柱：ZORBAX Eclipse Plus C18(250×4.6 mm，5 μm)；流動相為甲醇：乙腈：0.05 mol/L醋酸鈉(pH 4.6)=36.5∶36.5∶27，流速1 mL/min；柱溫35 ℃；進樣量20 μL；紫外檢測波長：λ=290 nm[3-4]。

2.5 方法學實驗 對托芬那酸標準品進行精密度、回收率和穩(wěn)定性試驗，考察方法的合理性。

2.6 血漿樣品處理 將冷凍保存的犬血漿室溫下自然解凍，搖勻后精密移取200 μL血漿置于5 mL離心管中，加入2 mL乙腈去蛋白，混合渦旋3 min。超聲10 min，4 ℃ 12000 r/min離心10 min，取上清于45 ℃氮氣吹干。加入200 μL流動相溶解氮氣吹干后殘渣，混合渦旋3 min，12000 r/min離心10 min，取上清25 μL進樣供HPLC分析。分別測出托芬那酸的峰面積。每批生物樣品測定時建立新的標準曲線，并將每批生物樣品測定結(jié)果(峰面積)采用新建立的標準曲線計算出托芬那酸的含量。每批生物樣品測定時隨行測定高、中、低三個濃度的質(zhì)控樣品。質(zhì)控樣品測定結(jié)果的偏差小于20%。

2.7 數(shù)據(jù)分析 將實測血藥濃度-時間數(shù)據(jù)采用WINNONLIN 6.3藥動學分析軟件計算藥代動力學

參數(shù)，藥動學參數(shù)根據(jù)中國藥科大學的楊勁老師編的《人體生物利用度數(shù)據(jù)處理通用程序，BAPP》軟件進行生物等效性檢驗。釆用SPSS統(tǒng)計學軟件對參數(shù)Cmax與AUC0-τ(已進行對數(shù)處理)進行多因素方差分析，對受試品和參比品進行生物學等效性比較。

2.8 方法學實驗結(jié)果

2.8.1 標準曲線 托芬那酸的血漿藥物濃度在0.05～10.0 μg/mL范圍內(nèi)，血漿藥物濃度與峰面積比值呈良好的線性關(guān)系(R2=0.999)。以峰面積為橫坐標，血藥濃度為縱坐標，典型的標準曲線方程為：y=63.65x+0.6054(圖1)。

圖1 托芬那酸標準曲線圖

2.8.2 精密度和回收率 血漿中托芬那酸HPLC測定方法的結(jié)果表明，空白血漿添加樣品在0.05～10.0 μg/mL范圍內(nèi)，批內(nèi)和批間系數(shù)分別小于11%和6%，精密度良好；空白血漿中托芬那酸添加濃度在0.05、1和10 μg/mL時的回收率均在85%以上，回收率穩(wěn)定(表1)。

表1 血漿中空白添加托芬那酸相對回收率(%)(n=5)及精密度

注：SD-標準偏差，RSD-相對標準偏差，n-平行數(shù)

2.8.3 穩(wěn)定性試驗 對于犬血漿中的托芬那酸而言，于-20 ℃條件下凍存時能夠保持穩(wěn)定1個月，在3個凍融循環(huán)之后仍可保持穩(wěn)定，于室溫條件(約22 ℃)下儲存時可保持穩(wěn)定達4 h。2.9 犬單劑量肌內(nèi)注射托芬那酸受試品與參比品的實測血藥濃度及動力學特征 犬單劑量(0.1 mL/kg bw)肌內(nèi)注射托芬那酸受試品和參比品注射液后，不同時間測得的受試品和參比品對應的平均血藥濃度-時間曲線見圖2。血藥濃度時間數(shù)據(jù)采用WINNONLIN 6.3版藥代參數(shù)計算軟件進行非房室模型分析計算藥動學參數(shù)，結(jié)果見表2。

圖2 犬單劑量肌內(nèi)注射(4 mg/kg bw)托芬那酸受試品與參比品平均血藥濃度-時間曲線圖

參數(shù)受試品(x-±s)參比品(x-±s)Tmax(h)0．2±0．10．3±0．2Cmax(μg·h·mL-1)5．12±1．555．38±2．04T1/2(h)13．53±6．1914．52±5．75AUC0-τ(μg·h·mL-1)12．1±2．9712．28±3．24AUC0-∞(μg·h·mL-1)13．38±3．1013．85±3．40MRT(h)13．43±6．7613．58±6．31F101．7%±25．8%103．2±20．7%

T1/2為消除半衰期；Tmax為達峰時間；Cmax為峰濃度；AUC為藥時曲線下面積；MRT為平均滯留時間；s為標準差

2.10 托芬那酸注射液受試品和參比品的生物等效性結(jié)果 采用中國藥科大學的楊勁老師編的《人體生物利用度數(shù)據(jù)處理通用程序，BAPP》軟件進行生物等效性檢驗。釆用SPSS統(tǒng)計學軟件對參數(shù)Cmax與AUC0-τ(已進行對數(shù)處理)進行多因素方差分析，每個參數(shù)在產(chǎn)品間、周期間以及個體間的差異均不顯著(P>0.05)，無統(tǒng)計學意義；對達峰時間(未進行對數(shù)處理)應用非參數(shù)檢驗后，結(jié)果顯示(表3)兩組數(shù)據(jù)差異不顯著(P>0.05)，說明兩種產(chǎn)品在犬體內(nèi)的達峰時間存在生物等效。受試產(chǎn)品參數(shù)AUC0-τ的對數(shù)平均值和參比產(chǎn)品參數(shù)AUC0-τ的對數(shù)平均值的比值是99.4%，90%置信區(qū)間為90.12%～108.31%，介于參比產(chǎn)品80%～125%之間；受試產(chǎn)品參數(shù)Cmax的對數(shù)平均值和參比產(chǎn)品參數(shù)Cmax的對數(shù)平均值的比值是97.1%，90%置信區(qū)間為81.61%～115.34%，介于參比產(chǎn)品70%～143%之間。綜上結(jié)果表明，國產(chǎn)托芬那酸注射液與法國威隆制藥公司生產(chǎn)的托芬那酸注射液在犬體內(nèi)存在生物等效。

表3 犬單劑量注射托芬那酸注射液受試品與參比品生物等效性分析

3 討論與小結(jié)

肌內(nèi)注射受試產(chǎn)品和參比產(chǎn)品托芬那酸注射液后，受試產(chǎn)品與參比產(chǎn)品的主要藥物動力學參數(shù):藥-時曲線下面積AUC0-τ、AUC0-∞、Cmax、Tmax數(shù)值接近，無顯著性差異。符合生物等效的硬性要求。相對于參比品，受試產(chǎn)品的相對生物利用度F為(101.7±25.8)%。

釆用SPSS統(tǒng)計學軟件對參數(shù)Cmax與AUC0-τ(已進行對數(shù)處理)進行多因素方差分析，每個參數(shù)在產(chǎn)品間、周期間以及個體間的差異均不顯著(P>0.05),無統(tǒng)計學意義;(未進行對數(shù)處理)應用非參數(shù)檢驗后,結(jié)果顯示兩組數(shù)據(jù)差異不顯著(P>0.05),說明兩種產(chǎn)品在犬體內(nèi)的達峰時間存在生物等效。依據(jù)制劑生物等效性評價標準[5]：供試制劑和參比制劑的AUC對數(shù)比值的90%可信限在80%～125%置信區(qū)內(nèi)；供試制劑和參比制劑的Cmax對數(shù)比值的90%可信限在70%～143%置信區(qū)內(nèi)；供試制劑和參比制劑的AUC、Cmax的雙向單側(cè)t檢驗均得到P<0.05的結(jié)果，t1≥t1-α(υ)與t2≥t1-α(υ)同時成立；Tmax經(jīng)非參數(shù)法檢驗無差異，則供試品與參比制劑具有生物等效性。依據(jù)上述制劑生物等效性評價標準檢驗，表明受試品制劑和參比品制劑為生物等效制劑。

托芬那酸注射液因具有較好的解熱鎮(zhèn)痛、抗炎的臨床效果[6]，在國外被廣泛用于治療關(guān)節(jié)炎和偏頭疼，并用于寵物犬、貓的骨關(guān)節(jié)相關(guān)的炎癥和疼痛。目前，已有托芬那酸在狗、牛、羊、大鼠、犬、人體內(nèi)的藥代動力學研究報道[7-11]。在國內(nèi)臨床應用較少，并且相關(guān)文獻報道較缺乏。國外相關(guān)研究報道[12]，托芬那酸在犬體內(nèi)的吸收較快，皮下注射4 mg/kg 2 h內(nèi)達到平均最大血藥濃度Cmax4 μg/mL(皮下注射)和3 μg/mL(肌肉注射)。本試驗中，單劑量肌內(nèi)注射(4 mg/kg bw)托芬那酸注射液參比品后，參比品的平均消除半衰期(t1/2)為(14.52±5.75)h，AUC為(12.28±3.24)μg·h/mL，Tmax為(0.3±0.2) h，Cmax為(5.38±2.04)μg/mL。單劑量肌內(nèi)注射托芬那酸受試品后，平均t1/2為(13.53±6.20) h，AUC為(12.10±2.97)μg·h/mL，Tmax為(0.2±0.1) h，Cmax為(5.12±1.55) μg/mL，相對于參比品的平均相對生物利用度為(101.7±25.8)%。藥動學研究結(jié)果表明，托芬那酸注射液肌內(nèi)注射給藥托芬那酸自注射部位吸收迅速，受試產(chǎn)品和參比產(chǎn)品15 min時均達到最大血藥濃度；體內(nèi)消除較緩慢，24 h均能檢測到血液中的藥物濃度,達到了長效的目的。

本次實驗嚴格遵守藥動學實驗要求規(guī)范展開，根據(jù)生物等效性分析標準，采用常用的雙單側(cè)t檢驗和95%可信區(qū)間統(tǒng)計分析方法來評價和判斷藥物間的生物等效性；結(jié)果符合國內(nèi)仿制藥生物等效要求。通過對國產(chǎn)托芬那酸注射液肌內(nèi)注射給藥在犬的藥動學特征研究，不僅對指導臨床合理用藥、新藥評價、個體化給藥及預測藥物在犬體內(nèi)的消除動態(tài)、蓄積特性和殘留消除規(guī)律等具有重要的參考價值；同時藥動學研究成果還可用于指導優(yōu)選給藥方案、新藥設(shè)計、改進藥物劑型，對提供高效、長效、低毒、低副作用的藥物制劑具有重要指導意義；為國產(chǎn)托芬那酸注射液的研制以及上市提供重要參考依據(jù)。

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(編輯：侯向輝)

Bioequivalence of Tolfenamic Acid Injection in Dogs

LI Long-fei1,2，LI Yu-chen1,2，WU Tian-xing1,2，XIA Liang-you1,2，CAO Jie1,2，WANG Shuang1,2，BU Shi-jin1,2*

(1.VeterinaryMedicineCollege,YangzhouUnivercity,Yangzhou，Jiangsu225009,China;2.JiangsuCo-innovationCenterforPreventionandControlofImportantAnimalInfectiousDiseasesandZoonoses,Yangzhou，Jiangsu225009,China)

To evaluate the pharmacokinetics and bioequivalence of tolfenamic acid injection in dogs，in arandomized two-way self-crossover study, 20 healthy dogs were randomly divided into two groups, and were given respectively a single dose of test or reference preparations by intramuscular injection(0.1mL/kg). Plasma concentrations of tolfenamic acid were measured by HPLC. The pharmacokinetic parameters were calculated by WinNonlin6.3 software, and the bioequivalence were evaluated. The main pharmacokinetic parameters of the test and reference preparations were asfollows: Tmaxwere(0.2±0.1) h, (0.3±0.2) h; Cmaxwere (5.12±1.55) μg/mL, (5.38±2.04) μg/mL;AUC0-twere(12.1±2.97) μg·h·mL-1,(12.28±3.24) μg·h·mL-1; AUC0-∞were (13.38±3.10)μg·h·mL-1, (13.85±3.40) μg·h·mL-1. The pharmacokinetic parameters (AUC0-t, AUC0-∞, Cmax, Tmax) showed no significant difference between test and reference preparations of tolfenamic acid suspension injections(P>0.05). The test and reference formulations are bioequivalent after two one-sidet-test. Two kinds of injection can replace each otherclinically．This study will provide theoretical basis formaking of veterinary clinical dosage regimen and clinical rational administration.

tolfenamic acid injection; pharmacokinetic;bioequivalence；HPLC

1.江蘇高校優(yōu)勢學科建設(shè)工程資助項目(PAPD)；2.揚州大學"新世紀人才工程"資助

李龍飛，碩士研究生，從事獸醫(yī)藥理，藥物代謝與藥物殘留分析研究。

卜仕金。E-mail：pushijin@aliyun.com

2016-07-11

A

1002-1280 (2016) 08-0053-05

S859.796