馬秋冉，張璐，戴青，楊星，于曉輝

(中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081)

柱前衍生化-高效液相色譜法檢測(cè)疫苗中游離甲醛含量

馬秋冉，張璐，戴青，楊星，于曉輝*

(中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081)

建立了測(cè)定疫苗中游離甲醛含量的柱前衍生化-高效液相色譜法。采用2,4-二硝基苯肼衍生疫苗中游離甲醛，乙腈︰水(65︰35)為流動(dòng)相，流速為1.0 mL/min，色譜柱為Waters Atlantis T3柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，檢測(cè)波長(zhǎng)為365 nm。在此方法下，3個(gè)不同甲醛濃度樣品回收率為98.28%～105.24%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為 2.3%。本方法檢測(cè)限為0.4 mg/L，定量限為1.6 mg/L。游離甲醛濃度在0.0040～1.1930 mg/mL范圍內(nèi)，與甲醛衍生物峰面積呈良好的線性關(guān)系(r2=0.9991)。結(jié)果表明，該方法分離度高，專屬性強(qiáng)，操作簡(jiǎn)單且不易受疫苗基質(zhì)和顏色影響，可用于測(cè)定疫苗中游離甲醛含量。

高效液相色譜；柱前衍生化；甲醛；疫苗

甲醛是一種原生質(zhì)毒物，對(duì)人的神經(jīng)系統(tǒng)、肺、肝臟均有損害，對(duì)皮膚和黏膜有強(qiáng)烈的刺激作用，還是可疑致癌物[1]。在疫苗中常添加甲醛以達(dá)到滅活、防腐的目的[2]，《中國(guó)獸藥典》對(duì)獸用疫苗游離甲醛含量有明確規(guī)定[3]。目前常采用乙酰丙酮分光光度法、亞硫酸品紅比色法檢測(cè)疫苗中游離甲醛含量。乙酰丙酮分光光度法在應(yīng)用過(guò)程中，抗干擾性差，靈敏度稍低[4]；而亞硫酸品紅比色法，在游離甲醛含量較低時(shí)對(duì)其難以進(jìn)行準(zhǔn)確測(cè)定，并且顯色劑和甲醛標(biāo)準(zhǔn)溶液放置時(shí)間長(zhǎng)短會(huì)對(duì)測(cè)定結(jié)果產(chǎn)生較大影響[5]。因此，本實(shí)驗(yàn)就建立柱前衍生化-高效液相色譜法檢測(cè)疫苗中游離甲醛進(jìn)行了研究，并進(jìn)行了方法學(xué)驗(yàn)證，以期為測(cè)定疫苗中游離甲醛含量提供新方法。

1 材料

1.1 儀器 Waters e2695高效液相色譜儀(配二極管陣列檢測(cè)器PDA2998)；色譜工作站處理軟件Empower 2；Waters Atlantis?T3柱：4.6 mm×250 mm，5 μm；微孔濾膜0.45 μm；分析天平：感量0.01 mg；恒溫水浴鍋；移液器：2～20 μL，Brand公司。

1.2 試劑與試液 甲醛溶液標(biāo)準(zhǔn)品(含量37.0%，批號(hào)：141127，天津化學(xué)藥品廠)；2,4-二硝基苯肼(2,4-DNPH，批號(hào)：20141110，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)溶液：3.0 g/L，稱取2,4-DNPH約300 mg溶于100 mL乙腈中；中性紅試液：稱取中性紅(批號(hào)：20150325，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)適量，加水制成濃度為0.1%的中性紅溶液；酚紅試液：稱取酚紅適量(批號(hào)：F20110616，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，加1 mol/L氫氧化鈉制成濃度為0.01%的酚紅溶液；乙腈為色譜純；水為純化水；氫氧化鈉為分析純；雞新城疫疫苗(批號(hào)：2015003)；小鵝瘟精制蛋黃抗體(批號(hào)：20141001、20141003)；豬圓環(huán)病毒2型滅活疫苗(DBN-SX07株)(批號(hào)：201503003、2015003-1)；豬支原體肺炎滅活疫苗(批號(hào)：2015003-2)。

2 方法與結(jié)果

2.1 樣品測(cè)定

2.1.1 樣品溶液制備 量取疫苗溶液5.0 mL，置50 mL量瓶中，加20%吐溫-乙醇溶液10 mL，分?jǐn)?shù)次洗滌吸管，洗液并入50 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，強(qiáng)烈振搖，靜置，分取下層清液備用，如下層清液不澄清，需經(jīng)過(guò)濾，棄去初濾液，取續(xù)濾液，濾液即為樣品溶液。2.1.2 對(duì)照品溶液制備 按照所需濃度，精密量取甲醛溶液標(biāo)準(zhǔn)品適量，加水進(jìn)行稀釋，搖勻；精密量取5 mL，置50 mL量瓶中，加20%吐溫-乙醇溶液10 mL，再加水稀釋至刻度，搖勻，即得對(duì)照品溶液。

2.1.3 衍生化反應(yīng) 量取樣品溶液/對(duì)照品溶液0.25 mL，置10 mL量瓶中，加3.75 mL水、1.5 mL 2,4-DNPH溶液，再加乙腈稀釋至刻度，搖勻置60 ℃水浴20 min后，待溶液冷卻至室溫，濾過(guò)，濾液供HPLC測(cè)定。

以保留時(shí)間定性，外標(biāo)法定量，同時(shí)做空白試驗(yàn)，計(jì)算疫苗中游離甲醛含量。

2.2 色譜條件 流動(dòng)相：乙腈︰水(65︰35)；流速1.0 mL/min；柱溫：25 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：365 nm；進(jìn)樣量為10 μL。

2.3 專屬性考察 將中性紅試液，酚紅試液、甲醛陰性對(duì)照溶液(水溶液)、甲醛溶液標(biāo)準(zhǔn)品，按2.1.3項(xiàng)下方法進(jìn)行衍生化后，按2.2項(xiàng)下方法進(jìn)行測(cè)定，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖1-圖4。結(jié)果顯示，按2.2項(xiàng)下的色譜條件，出峰順序依次為2,4-DNPH、甲醛衍生物，且兩者分離度大于1.5。甲醛陰性對(duì)照溶液、酚紅試液及中性紅試液色譜圖中，在甲醛衍生物位置不出峰。結(jié)果表明該色譜分離條件能夠有效分離2,4-DNPH及甲醛衍生物，且中性紅、酚紅對(duì)測(cè)定結(jié)果無(wú)影響，具有較好的專屬性。

2.4 線性關(guān)系考察 取甲醛溶液標(biāo)準(zhǔn)品適量，配制濃度為4.9710 mg/mL的甲醛對(duì)照品儲(chǔ)備液。分別精密量取甲醛對(duì)照品儲(chǔ)備液6.0、5.0、4.0、2.0、0.5、0.2、0.02 mL置25 mL量瓶中加水稀釋至刻度，配制濃度分別為1.1930、0.9942、0.7954、0.3977、0.0994、0.0398、0.0040 mg/mL的甲醛對(duì)照品溶液。將不同濃度的甲醛對(duì)照品溶液按2.1.3項(xiàng)下衍生化后，按2.2項(xiàng)下方法進(jìn)行測(cè)定。以甲醛衍生物吸收峰峰面積為縱坐標(biāo)(y)，進(jìn)樣濃度(x，mg/mL)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖5)，計(jì)算回收方程為y=8×106+6x+85972，r2=0.9991。試驗(yàn)表明，游離甲醛在0.0040～1.1930 mg/mL濃度范圍內(nèi)與甲醛衍生物吸收峰峰面積線性關(guān)系良好。

圖1 甲醛溶液標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖

圖2 甲醛陰性對(duì)照溶液色譜圖

圖3 0.01%酚紅溶液色譜圖

圖4 0.1%中性紅溶液色譜圖

圖5 柱前衍生化-高效液相色譜法測(cè)游離甲醛含量線性關(guān)系

2.5 準(zhǔn)確度考察 取甲醛溶液標(biāo)準(zhǔn)品適量，配制濃度為5.0685 mg/mL的甲醛對(duì)照品儲(chǔ)備液。分別量取9份5 mL雞新城疫疫苗供試品溶液，置50 mL量瓶中，加20%吐溫-乙醇溶液10 mL，分?jǐn)?shù)次洗滌吸管，洗液并入50 mL量瓶中，分別加入0.64、0.80、0.96 mL甲醛對(duì)照品儲(chǔ)備液，每個(gè)濃度3份，加水稀釋至刻度，強(qiáng)烈振搖，靜置，分取下層清液備用，如下層清液不澄清，需經(jīng)過(guò)濾，棄去初濾液，取續(xù)濾液。得到甲醛濃度分別為0.0649、0.0811、0.0973 mg/mL的樣品溶液。按2.1.1項(xiàng)下方法，平行制備2份雞新城疫疫苗樣品溶液，作為空白樣品溶液。將上述11份樣品溶液，按2.1.3項(xiàng)下方法衍生化后，按2.2項(xiàng)下方法進(jìn)行測(cè)定，每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定2次，計(jì)算加樣回收率、平均回收率及RSD值。試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。

2.6 檢測(cè)限、定量限考察 取甲醛溶液標(biāo)準(zhǔn)品適量，配制濃度為100 μg/mL的甲醛對(duì)照品儲(chǔ)備液。分別精密量取5.0、4.0、3.0、2.0、1.0、0.5 mL甲醛對(duì)照品儲(chǔ)備液置50 mL量瓶中加水稀釋至刻度，配制濃度為10、8、6、4、2、1 μg/mL的甲醛對(duì)照品溶液。按2.1.3項(xiàng)下方法衍生化后，按2.2項(xiàng)下方法進(jìn)行測(cè)定。測(cè)定結(jié)果顯示，濃度為1 μg/mL時(shí)，游離甲醛衍生物的信噪比(S/N)約等于3；濃度為4 μg/mL時(shí)，游離甲醛衍生物的信噪比(S/N)>10。確定本方法的檢出限為0.4 mg/L，定量限為1.6 mg/L。

表1 柱前衍生化-HPLC法檢測(cè)疫苗中游離甲醛含量準(zhǔn)確度試驗(yàn)數(shù)據(jù)

2.7 樣品測(cè)定 取5批獸用疫苗，按2.1項(xiàng)下測(cè)定方法進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算樣品中游離甲醛含量，結(jié)果見(jiàn)表2。5批獸用疫苗的游離甲醛含量均符合2010年版《中國(guó)獸藥典》規(guī)定，均不高于0.8 mg/mL。

表2 5批獸用疫苗游離甲醛含量的測(cè)定結(jié)果

3 討論與小結(jié)

3.1 衍生化反應(yīng)體系的優(yōu)化 紀(jì)宏等[5]曾采用稀鹽酸溶解2,4-DNPH，王連珠等[6-7]采用乙腈溶解,但陳笑梅等[8]發(fā)現(xiàn)甲醛與2,4-DNPH在弱酸緩沖溶液中反應(yīng)結(jié)果不穩(wěn)定，并有2,4-DNPH晶體析出。經(jīng)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)2,4-DNPH為3.0 g/L時(shí)，在稀鹽酸溶液中不能完全溶解，但易溶于乙腈，故本研究采用乙腈溶解2,4-DNPH。

3.2 2,4- DNPH用量的選擇 當(dāng)甲醛濃度為1 mg/mL時(shí)，甲醛衍生物峰面積隨2,4-DNPH加入量的增加而增加。當(dāng)加入量為1.5～2.5 mL時(shí)，甲醛衍生物吸收峰峰面積基本一致，說(shuō)明甲醛已反應(yīng)完全。本試驗(yàn)選用3 mg/mL 2,4-DNPH溶液1.5 mL進(jìn)行衍生化反應(yīng)。

3.3 小結(jié) 本實(shí)驗(yàn)建立了柱前衍生化-高效液相色譜法檢測(cè)疫苗中的游離甲醛含量，該方法分離效率高，選擇性好，操作簡(jiǎn)單且不易受疫苗中基質(zhì)和顏色影響，可用于疫苗中游離甲醛含量的測(cè)定。

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[3] 中國(guó)獸藥典委員會(huì). 中華人民共和國(guó)獸藥典 [M]. 三部. 北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2010: 附錄20.

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(編輯：李文平)

Determination of Free Formaldehyde Content in Vaccine by Pre-column Derivatization HPLC

MA Qiu-ran, ZHANG Lu, DAI Qing, YANG Xing, YU Xiao-hui*

(ChinaInstituteofVeterinaryDrugControl,Beijing100081,China)

Pre-column derivatization HPLC method was established in order to determine the free formaldehyde content in vaccine with 2,4-dinitrophenylhydrazine (DNPH) as the derivatization reagent. The Waters Atlantis T3 (4.6 mm×250 mm, 5 μm) was used in the analysis. The mobile phase was a mixture of acetonitrile and water with a ratio of 65 to 35 by volume. The flow rate was 1.0 mL/min. UV detection was made at the wavelength of 365 nm. The recovery of samples was in a range of 98.28%～105.24%, with relative standard deviation (RSD) of 2.3%. The detection limit was 0.4 mg/L and the quantitation limit was 1.6 mg/L. The free formaldehyde content in vaccine showed good liner relationship to the peak area within a content range of 0.0040～1.1930 mg/mL (r2=0.9991). This method is separable, specific, simple and not easy to be affected by vaccine’s ground substance and color, and might be used for determination of formaldehyde content in vaccine.

HPLC; pre-column derivatization; free formaldehyde; vaccine

馬秋冉，碩士，從事化學(xué)藥品檢驗(yàn)檢測(cè)工作。

于曉輝。E-mail：yuxiaohui@ivdc.org.cn

2016-06-20

A

1002-1280 (2016) 08-0020-04

R927.2