李建廠，孫維梅，賈秀紅，唐慎華，李曉花

(濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，山東濱州256603)

轉(zhuǎn)染CDX2-siRNA并加入人參皂苷Rh2培養(yǎng)的K562細胞增殖抑制率、凋亡率變化

李建廠，孫維梅，賈秀紅，唐慎華，李曉花

(濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，山東濱州256603)

目的 觀察轉(zhuǎn)染尾型同源盒基因(CDX2)siRNA并加入人參皂苷Rh2培養(yǎng)的人慢性粒細胞白血病細胞株K562細胞增殖抑制率、凋亡率變化。方法 將對數(shù)生長期的人慢性粒細胞白血病K562細胞，分為實驗組和對照組，實驗組包括A、B、C組,A組不轉(zhuǎn)染，B、C組分別轉(zhuǎn)染CDX2-siRNA和陰性對照序列(CDX2-siRNA-NC)，然后實驗組均加入60 μmol/L的人參皂苷Rh2培養(yǎng)。對照組K562細胞常規(guī)培養(yǎng)。培養(yǎng)6、12、24、36、48 h采用MTT法測算各實驗組細胞增殖抑制率；培養(yǎng)48 h采用Annexin Ⅴ-FITC/PI雙染法和流式細胞術(shù)測算各實驗組細胞凋亡率。培養(yǎng)48 h時采用實時熒光定量PCR法檢測各實驗組細胞CDX2、Ph標記染色體或(和)BCR/ABL基因重排(BCR-ABL融合基因)mRNA，采用Western blotting法檢測各組細胞CDX2、BCR-ABL融合蛋白。結(jié)果 培養(yǎng)6、12、24、36、48 h時B組細胞增殖抑制率均高于A、C組(P均<0.05)。培養(yǎng)48 h時A、B、C組的細胞凋亡率分別為26.50%±0.72%、73.20%±1.06%、32.00%±1.34%,B組細胞凋亡率均高于A、C組。培養(yǎng)48 h時，B組細胞CDX2、BCR-ABL融合基因mRNA及蛋白相對表達量均低于A、C組，P均<0.05。結(jié)論 轉(zhuǎn)染CDX2-siRNA并加入人參皂苷Rh2培養(yǎng)的人慢性粒細胞白血病細胞株K562細胞增殖抑制率、凋亡率升高，這可能是轉(zhuǎn)染CDX2-siRNA降低K562細胞CDX2表達，然后降低BCR-ABL融合基因表達導(dǎo)致的。

基因系尾型同源盒基因白血病；人慢性粒細胞白血??；人參皂苷；細胞增殖；細胞凋亡；Ph標記染色體或(和)BCR/ABL基因

人參為五加科人參屬植物[1]，是一種具有重要藥用價值的中草藥，人參皂苷Rh2是一種原人參二醇型單糖鏈皂苷單體化合物，具有抑制細胞增殖、誘導(dǎo)細胞凋亡、逆轉(zhuǎn)細胞多藥耐藥性等抗腫瘤生物活性[2]，可抑制胃癌[3]、膠質(zhì)瘤[4]、白血病[5]等腫瘤細胞的增殖,但是效果不明顯[6]?；蛳滴残屯春谢?CDX2)是是一種在早期胚胎發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用的調(diào)節(jié)因子，與白血病的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)歸關(guān)系密切[7]。通過轉(zhuǎn)染CDX2-siRNA沉默人慢性粒細胞白血病細胞株K562細胞CDX2基因表達，然后再用人參皂苷Rh2培養(yǎng)是否會增加K562細胞增殖抑制率和凋亡率尚不明確。2014年10月～2015年5月，我們觀察了轉(zhuǎn)染CDX2-siRNA加入人參皂苷Rh2培養(yǎng)的K562細胞增殖抑制率和凋亡率變化，并探討其可能機制?，F(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 材料與方法

1.1 細胞、材料及試劑 人慢性粒細胞白血病細胞株K562由濱州醫(yī)學(xué)院腫瘤與分子生物學(xué)重點實驗室保存，接種于含10%胎牛血清、青鏈霉素濃度為1%的RPMI1640培養(yǎng)基中，置于37.0 ℃、5%CO2、飽和濕度的無菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，1～2 d傳代1次。RPMI1640、胎牛血清購自美國Hyclone公司；人參皂苷單體Rh2購自南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司(純度98%)；細胞總RNA提取試劑盒、RT-PCR試劑盒購自日本TaKaRa公司；CDX2、Ph標記染色體或(和)BLL/ABL基因(BCR-ABL)、β-actin上下游引物交由上海生物工程公司設(shè)計合成；CDX2 一抗、GAPDH一抗購自武漢博奧森公司，BCR-ABL一抗購自Abcam 公司，二抗購自杭州賢至公司，SDS-PAGE凝膠配置試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；MTT購自美國Sigma公司；細胞凋亡試劑盒購自南京凱基公司。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。CDX2-siRNA及陰性對照序列(CDX2-siRNA-NC)均由上海吉瑪制藥有限技術(shù)公司合成。

1.2 K562細胞分組、轉(zhuǎn)染及人參皂苷Rh2應(yīng)用方法 取對數(shù)生長期K562細胞，0.8×106/孔接種于6孔板，分為A、B、C組3個實驗組，每組6個復(fù)孔。A組不轉(zhuǎn)染，B、C組分別轉(zhuǎn)染CDX2-siRNA和陰性對照序列(CDX2-siRNA-NC)，然后三組均用60 μmol/L的人參皂苷Rh2培養(yǎng)。另設(shè)空白對照組，為常規(guī)培養(yǎng)的K562細胞。 繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3 各實驗組細胞CDX2 mRNA及蛋白檢測 ①采用RT-PCR法檢測培養(yǎng)48 h時各組CDX2 mRNA。所有操作均嚴格按照試劑盒說明書進行CDX2上游引物為5′-GAACCTGTGCGAGTGGATG-3′，下游引物為5′-GGATGGTGATGTAGCGACTG-3′，擴增片段長度150 bp；內(nèi)參β-actin上游引物為5′-CTCCATCCTGGCCTCGCTGT-3′，下游引物為5′- GCTGTCACCTTCACCGTTCC-3′，擴增片段長度150 bp。反應(yīng)條件：95 ℃、30 s預(yù)變性，95 ℃、5 s，60 ℃、15 s，45個循環(huán)。采用2-ΔΔCT法計算各組CDX2 mRNA的相對表達量。②采用Western blotting法檢測培養(yǎng)48 h時各組細胞CDX2 蛋白。裂解細胞， BCA法測定蛋白濃度， 8% SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜至PVDF膜，7%脫脂奶粉室溫封閉2.5 h，TBST洗凈，加入兔抗人CDX2單抗(1∶500)、兔抗人GAPDH單抗(1∶1 000)，4 ℃搖床封閉過夜；TBST清洗4次，每次15 min，加入辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG(1∶5 000)室溫搖床封閉2 h，TBST清洗4次，每次10 min，經(jīng)ECL發(fā)光顯色系統(tǒng)拍照顯影；以GAPDH為內(nèi)參，各實驗組細胞CDX2的相對表達量以目的條帶和GAPDH條帶灰度值之比表示。實驗重復(fù)3次，取平均值。

1.4 各實驗組細胞增殖抑制率測算 采用MTT法。分別于培養(yǎng)6、12、24、36、48 h取各實驗組和空白對照組細胞，0.8×104/孔接種于96孔板，每組6個復(fù)孔。PBS沖洗后，每孔加入20 μL 5 mg/mL MTT,繼續(xù)孵育4 h，4 ℃下1 000 r/min離心10 min，棄上清，每孔加入150 mL DMSO，室溫避光震蕩5 min，采用分光光度計測定各孔490 nm處光密度(OD)值。實驗組細胞增殖抑制率=(空白對照組OD值-實驗組OD值)/空白對照組OD值×100%。

1.5 各實驗組凋亡細胞檢測 采用Annexin Ⅴ-FITC/PI雙染法和流式細胞術(shù)。取培養(yǎng)48 h時各組細胞，4×105/孔接種于6孔板，每組6個復(fù)孔。800 r/min離心5 min，收集各組細胞，PBS洗3遍，吸棄上清，加入500 μL 1×Binding Buffer重懸細胞，加入5 μL Annexin Ⅴ-FITC 混勻，加入5 μL Propidium Iodide 混勻,室溫避光反應(yīng)15 min，采用流式細胞儀檢測各組細胞凋亡情況，計算細胞凋亡率。實驗重復(fù)3次，取平均值。

1.6 各實驗組細胞BCR-ABL融合基因mRNA及蛋白檢測 ①采用RT-PCR法檢測培養(yǎng)48 h時各組BCR-ABL融合基因mRNA。BCR-ABL融合基因上游引物為：5′-CTTCTCCCTGGCATCCGTGGA-3′，下游引物為5′-TGCAACGAAAAGGTTGGGGT-3′，擴增片段長度155 bp。其余同“1.3”。②采用Western Blotting法檢測培養(yǎng)48 h時各組細胞BCR-ABL融合蛋白。裂解細胞， BCA法測定蛋白濃度， 8% SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜至PVDF膜，7%脫脂奶粉室溫封閉2.5 h，TBST洗凈，加入兔抗人CDX2單抗(1∶500)、BCR-ABL單抗(1∶1 000)、兔抗人GAPDH單抗(1∶1 000)，4 ℃搖床封閉過夜；TBST清洗4次，每次15 min，加入辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG(1∶5 000)室溫搖床封閉2 h，TBST清洗4次，每次10 min，經(jīng)ECL發(fā)光顯色系統(tǒng)拍照顯影；以GAPDH為內(nèi)參，各實驗組細胞CDX2、BCR-ABL蛋白的相對表達量以目的條帶和GAPDH條帶灰度值之比表示。實驗重復(fù)3次，取平均值。

2 結(jié)果

2.1 各實驗組細胞CDX2表達比較 培養(yǎng)48 h各組細胞CDX2 mRNA及蛋白相對表達量見表1。B組細胞CDX2 mRNA及蛋白相對表達量均低于A、C組，P均<0.05；A、C組細胞CDX2 mRNA及蛋白相對表達量相比P均>0.05。

2.2 各實驗組細胞增殖抑制率比較 培養(yǎng)6、12、24、36、48 h各組細胞增殖抑制率比較見表2。培養(yǎng)6、12、24、36、48 h時B組細胞增殖抑制率均高于A、C組，P均<0.05；A、C組細胞增殖抑制率相比P>0.05。

表1 不同時點各實驗組細胞增殖抑制率比較±s)

注：與A、C組比較，＊P<0.05。

2.3 各實驗組細胞凋亡率比較 培養(yǎng)48 h時A、B、C組的細胞凋亡率分別為26.50%±0.72%、73.20%±1.06%、32.00%±1.34%,B組細胞凋亡率均高于A、C組，P均<0.05;A、C組細胞凋亡率相比P>0.05。

2.4 各實驗組細胞BCR-ABL mRNA及蛋白相對表達量比較 培養(yǎng)48 h各實驗組細胞BCR-ABL mRNA及蛋白相對表達量見表2。B組細胞BCR-ABL mRNA及蛋白相對表達量均低于A、C組，P均<0.05；A、C組細胞BCR-ABL融合基因mRNA及蛋白相對表達量相比，P均>0.05。

表2 各實驗組細胞CDX2、BCR-ABL mRNA及蛋白相對表達量比較±s)

注：與A、C組比較，＊P<0.05。

3 討論

CDX2是一種在早期胚胎發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用的調(diào)節(jié)因子，該基因與白血病的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)歸關(guān)系密切。Thoene 等[9]研究發(fā)現(xiàn)，CDX2異常表達于造血干細胞會成為作用強大的原癌基因，進一步導(dǎo)致細胞惡性增殖。Rawat等[10]通過對急性單核白血病發(fā)病機制的研究發(fā)現(xiàn)，CDX2在造血系統(tǒng)疾病中存在異常表達，可以促進髓母細胞自我更新和增殖，并且對下游HOX基因表達有一定的調(diào)節(jié)作用。此外，Saegusa 等[11]研究發(fā)現(xiàn)，CDX2能夠通過與β-連環(huán)蛋白聯(lián)合作用，共同參與誘導(dǎo)白血病的分化障礙。由此可知，CDX2能夠通過影響白血病細胞內(nèi)多種信號通路的表達，從而進一步影響腫瘤細胞的增殖、凋亡。

具有多向分化潛能的BCR-ABL融合基因是人慢性粒細胞白血病細胞K562細胞的分子遺傳學(xué)特征之一[8]。BCR-ABL融合蛋白能夠通過其過度活躍的酪氨酸激酶活性使多種目標蛋白磷酸化，進而激活多種信號通路，導(dǎo)致造血干祖細胞異常增殖，引起疾病發(fā)生[12，13]。已經(jīng)有研究證實，通過RNA技術(shù)沉默BCR-ABL基因表達后，可能明顯抑制白血病細胞增殖，并促進其凋亡[14]。

研究證實，Rh2對白血病細胞株KG1α具有明顯的增殖抑制作用，其作用機制可能與抑制Wnt/β-catenin/TCF4/CyclinD1 信號通路有關(guān)[15]。Choi等[16]則通過研究發(fā)現(xiàn)，Rh2能夠通過影響細胞抗凋亡/促凋亡蛋白的活性而發(fā)揮其促凋亡作用，且其促凋亡作用呈濃度依賴性。 本研究結(jié)果顯示，與A、C組相比，培養(yǎng)6、12、24、36、48 h時B組細胞增殖抑制率升高，細胞凋亡率升高，CDX2、BCR-ABL mRNA及蛋白相對表達量降低。提示通過轉(zhuǎn)染CDX2-siRNA沉默K562細胞CDX2基因表達，能夠明顯抑制K562細胞增殖，這可能是通過轉(zhuǎn)染CDX2-siRNA降低K562細胞CDX2和BCR-ABL表達，進而促進細胞凋亡導(dǎo)致的。BCR-ABL融合基因具有過高的酪氨酸激酶活性，是慢性髓細胞白血病發(fā)病的主要原因。本研究結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染CDX2-siRNA在沉默K562細胞CDX2基因表達的同時，也抑制BCR-ABL融合蛋白的表達低。因此由此推測，CDX2沉默表達引起細胞凋亡增加可能與下調(diào)BCR-ABL融合基因表達有關(guān)。已有研究發(fā)現(xiàn)在胃癌細胞中CDX2沉默表達會導(dǎo)致PTEN、Caspase-3 、Caspase-9 等細胞凋亡因子表達明顯上調(diào)；而Cappellini 等[17]和Sherbakova 等[18，19]分別通過研究發(fā)現(xiàn)Caspase-3、PTEN基因過表達可抑制細胞內(nèi)藥物外排過程，加強抗腫瘤藥物的效果。轉(zhuǎn)染CDX2-siRNA后K562細胞CDX2和BCR-ABL融合蛋白表達下降進而導(dǎo)致Rh2外排受抑，這可能是轉(zhuǎn)染CDX2-siRNA后K562細胞凋亡率和增殖抑制率升高的原因。

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2016-04-27)