凌俊，江河，胡玉婷，段國慶

（安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水產(chǎn)研究所，安徽 合肥 230031）

三種體色黃鱔群體遺傳多樣性分析

凌俊，江河，胡玉婷，段國慶

（安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水產(chǎn)研究所，安徽 合肥 230031）

利用線粒體Cyt b基因部分序列測序技術(shù)研究3種體色黃鱔Monopterus albus群體（深黃斑鱔、青黃斑鱔、青斑鱔）的遺傳多樣性與遺傳差異。結(jié)果顯示：三個群體黃鱔共有變異位點53個，單倍型36個；平均單倍型多樣性分別為0.9153、0.7517、0.9457；平均核苷酸多樣性分別為0.00426、0.00211、0.00601。群體間遺傳分化指數(shù)（Fst）較?。?.00282～0.04970），分子方差分析（AMOVA）中僅有2.10%的變異來自群體間，表明三種不同體色黃鱔群體間未有明顯遺傳分化。群體遺傳距離的聚類分析結(jié)果顯示：深黃斑鱔與青黃斑鱔群體間親緣關(guān)系最近，深黃斑鱔與青斑鱔親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。

黃鱔；體色；細(xì)胞色素b；遺傳多樣性

黃鱔Monopterus albus是我國重要的名優(yōu)經(jīng)濟(jì)水產(chǎn)動物之一。長江中下游是中國黃鱔重要產(chǎn)出地，資源豐富。黃鱔營穴居生活，個體遷移范圍較小，由于地理隔離、遺傳及環(huán)境因素的影響，形成了不同體色的地方黃鱔品系，外觀、生長性能、營養(yǎng)成分等差異很大[1-10]。江淮流域常見三種體色黃鱔，即深黃斑鱔：背部體色深黃，全身布滿不規(guī)則褐黑色大斑點，排列成線，腹部花紋較淺；青黃斑鱔：背部體色淺黃，全身分布著不規(guī)則的褐黑色細(xì)密的小斑點，腹部花紋較淺；青斑鱔：體表泥灰色，背部體表花紋不明顯，腹部布滿花紋且顏色較深。三種體色黃鱔的繁殖力、生長性能、營養(yǎng)成分均有差異[5-7,10]。但有關(guān)不同體色黃鱔種質(zhì)遺傳結(jié)構(gòu)的研究還較少，這三種體色黃鱔的遺傳多樣性差異尚不明確。

同其他脊椎動物類似，魚類線粒體DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）具有分子小、結(jié)構(gòu)簡單、進(jìn)化呈中性、演化速度快、母系遺傳、無重組、方便檢測，及不同區(qū)域進(jìn)化速率不同等特點，被廣泛應(yīng)用于魚類分類學(xué)、群體遺傳學(xué)、生物地理學(xué)等研究中。作為線粒體DNA中研究最為充分的基因，線粒體細(xì)胞色素b基因（Cytochrome b,Cyt b）具有恒定和較適中的進(jìn)化速率，DNA序列易擴(kuò)增，適于鑒別魚類種間或群體間的遺傳信息[11-13]。

為了有效地保護(hù)黃鱔野生資源及選育優(yōu)良的黃鱔新品系，本文通過研究安徽常見的三種體色黃鱔的遺傳多樣性和遺傳差異，以期為保護(hù)和合理利用黃鱔種質(zhì)資源、豐富其生物多樣性提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

2013年5～10月在安徽懷寧縣（屬長江水系）分別采深黃斑鱔28尾、青黃斑鱔30尾、青斑鱔24尾，以A、B、C代表（圖1）。取黃鱔肌肉組織于無水酒精中保存?zhèn)溆谩?/p>

圖1 三種體色黃鱔Fig.1 The ricefield eel M.albus with three body colors

1.2 方法

提取基因組DNA：用天根生化科技（北京海）有限公司生產(chǎn)的試劑盒提取黃鱔群體基因組DNA，經(jīng)0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

PCR擴(kuò)增與測序：所用引物為本實驗室根據(jù)GenBank中黃鱔線粒體基因組全序列（NO.：NC003192）用Primer 5.0軟件設(shè)計。上游引物Cf：GAAGCAACACCAACTGATCCC；下游引物Cr：CAATTTTCGACTTACAAGGCC用于擴(kuò)增與測序。PCR反應(yīng)體系：10×Buffer（100mmol/L Tris-HCl（pH8.3），500mmol/L KCl和 15mmol/L MgCl2）5μL，dNTP（10mmol/L）4.0μL，引物（10mmol/L）各2μL，模板DNA（50ng/μL）2μL，Taq DNA酶（5U/μL）0.3μL，加滅菌蒸餾水34.7μL使反應(yīng)體系達(dá)50μL。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5min；94℃變性35s，52℃退火45s，72℃延伸1min，35個循環(huán)；72℃延伸7min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測后，送生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行純化及測序。

數(shù)據(jù)處理：利用Clustal X[14]和Seaview軟件[15]校對和拼接序列；利用DNAsp 5.0[16]統(tǒng)計多態(tài)位點數(shù)、單倍型數(shù)、單倍型多樣性（Hd）與核苷酸多樣性（Pi）；利用MEGA 4.0[17]計算序列堿基組成與變異率、群體內(nèi)和群體間遺傳距離，構(gòu)建群體間系統(tǒng)進(jìn)化樹（NJ-tree）；利用Network軟件（http://www.fluxusengineering.com/）制作單倍型進(jìn)化網(wǎng)絡(luò)圖；利用Arlequin 3.5[18]計算遺傳分化指數(shù)（F-statistics，F(xiàn)st）和分子方差分析（Analysis of molecular variance，AMOVA）。

2 結(jié)果與分析

2.1 序列多態(tài)分析

在黃鱔3個不同體色群體的82個樣品中，經(jīng)測序共獲得82條長度為1 087bp的線粒體Cyt b基因同源序列，所有序列均無插入、缺失；檢測到變異位點53個（變異率4.88%），其中簡約信息位點35個，單突變位點18個。序列堿基變化中轉(zhuǎn)換與顛換比率為17.38，符合魚類線粒體核苷酸的替換中轉(zhuǎn)換遠(yuǎn)多于顛換的規(guī)律。序列的平均堿基組成T、C、A、G依次為 29.8%、32.6%、24.4%和 13.2%；（A+T）含量54.2%明顯高于（G+C）的含量45.8%，顯示了較強(qiáng)的反G偏好，即G含量較低，尤其密碼子第2位（13.5%）和第3位（3.3%）最為明顯；而第1位的堿基組成相近（T：28.4%；C：25.3%；A：23.7%和G：22.5%），這與脊椎動物線粒體DNA堿基組成的特點相一致。

2.2 單倍型和遺傳多樣性

在3個不同體色黃鱔群體的82個樣品中，共檢測到36種單倍型（表1），單倍型間序列變異率為0.09%～1.38%。所有單倍型序列的GenBank序列登錄號依次為KX155507～KX155542。3個群體僅有1個共有單倍型（Hap1），占全部樣品的34.15%；兩兩群體間共有單倍型10個，占全部樣品的31.71%；其余25個單倍型為各群體所特有，占全部樣品的34.15%。單倍型簡約進(jìn)化網(wǎng)絡(luò)圖（圖2）顯示：三體色黃鱔群體的單倍型在各群體間幾乎隨機(jī)分布，沒有明顯差異。

表1 單倍型在不同體色黃鱔群體中的分布Tab.1 Haplotype distributions of ricefield eel M.albus populations with 3 types of body color

由表2可知，三種體色黃鱔群體的單倍型多樣性均較高（0.7517～0.9457），而核苷酸多樣性則較低（0.00211～0.00601）；C群體單倍型多樣性（Hd）和核苷酸多樣性（Pi）均最高（Hd：0.9457，Pi：0.00601）；B群體單倍型多樣性和核苷酸多樣性均最低（Hd：0.7517，Pi：0.00211）。

2.3 群體遺傳距離和分化

基于K-2P遺傳距離模型計算黃鱔群體內(nèi)、群體間平均遺傳距離（表3），并以此遺傳距離構(gòu)建群體間系統(tǒng)進(jìn)化樹（NJ-tree）（圖3）。A與C群體間遺傳距離最大（0.005453），A與B群體間最?。?.003234）；部分群體間遺傳距離小于群體內(nèi)遺傳距離，如C群體內(nèi)遺傳距離（0.006062）大于各群體間遺傳距離，A群體內(nèi)遺傳距離大于A、B群體間遺傳距離。群體內(nèi)遺傳距離反映該群體的遺傳多樣性，而群體間遺傳距離反映其遺傳組成的分化程度，這顯示群體內(nèi)存在較高遺傳多樣性，但這種遺傳多樣性在不同群體間還未積累到較大區(qū)別。聚類圖顯示（圖3）：A和B群體先聚在一起，再與C群體聚為一支。

圖2 三體色群體黃鱔單倍型進(jìn)化網(wǎng)絡(luò)圖Fig.2 Statistical parsimony network of ricefield eel M.albus populations with 3 types of body color based on mtDNA Cyt b gene

表2 黃鱔各體色群體的遺傳多樣性參數(shù)Tab.2 The genetic diversity parameters of ricefield eel populations with 3 types of body color

不同體色黃鱔群體間遺傳分化結(jié)果見表4和表5。兩兩群體間Fst值均小于0.05；分子方差分析（AMOVA）結(jié)果顯示：僅有2.10%的遺傳變異來自群體間，而群體內(nèi)遺傳變異占比高達(dá)97.9%，這表明不同體色黃鱔群體間未有明顯遺傳分化。

表3 三體色黃鱔群體內(nèi)（對角線）和群體間（對角線下）的遺傳距離Tab.3 Pairedgeneticdistances（belowdiagonal）and genetic distance within（diagonal）population of ricefield eel M.albuspopulationswith3typesofbodycolor

圖3 基于線粒體Cyt b基因的三體色黃鱔群體間系統(tǒng)聚類樹Fig.3 NJ-tree of ricefield eel M.albus populations with 3 types of body color based on Cyt b gene

表4 基于Cyt b基因的黃鱔3群體間Fst值Tab.4 F-Statistics from genetic distance of ricefield eel M.albus populations with 3 types of body color based on Cyt b

表5 黃鱔所有樣本的Cyt b序列的分子方差分析Tab.5 AMOVA of Cyt b gene in samples of ricefield eel M.albus

3 討論

3.1 不同體色黃鱔群體遺傳多樣性

遺傳多樣性或基因多樣性是生物多樣性的重要組成部分，是生物適應(yīng)環(huán)境與進(jìn)化的遺傳基礎(chǔ)，與物種或群體的環(huán)境適應(yīng)能力呈正相關(guān),是評價生物對環(huán)境適應(yīng)和進(jìn)化潛力的重要依據(jù)。線粒體Cyt b基因序列是檢測魚類群體間遺傳多樣性的重要分子標(biāo)記，通常以核苷酸多樣性（Pi）和單倍型多樣性（Hd）為衡量指標(biāo)。三種體色黃鱔群體中，C群體（青斑鱔）單倍型多樣性和核苷酸多樣性均最高（Hd：0.9457，Pi：0.00601），A群體（深黃斑鱔）次之（Hd：0.9153，Pi：0.00426），而B群體（青黃斑鱔）最低（Hd：0.7517，Pi：0.00211），表明三種體色黃鱔在線粒體Cyt b基因上的遺傳多樣性尚處于較高水平，存在較強(qiáng)的資源恢復(fù)潛能。但三種體色黃鱔之間遺傳多樣性的高低與已有的一些研究結(jié)果有差異。劉良國等[4]對洞庭湖區(qū)A、B、C三群體共15個黃鱔個體進(jìn)行隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)B群體的遺傳多樣性最高，C群體最低。周先文[19]對兩種體色黃鱔的RAPD研究表明，黃色黃鱔群體遺傳多樣性大于灰色，這可能與實驗采樣頻次有關(guān)。青黃斑鱔（B群體）在野外最常見，一次采樣樣品即足夠，可能來源于親緣關(guān)系較近的小群體；而深黃斑鱔、青斑鱔（C群體）野外不常見，需多次采樣，來源較為分散，多樣性更為豐富。自然界中深黃斑鱔數(shù)量較少，但其繁殖力[6]、生長速度[7]等均較高，具有較高的養(yǎng)殖價值，可為黃鱔優(yōu)良品系的選育提供種質(zhì)材料，因此要重視保護(hù)野生深黃斑鱔群體。

3.2 三種體色黃鱔群體遺傳分化

群體遺傳結(jié)構(gòu)是指遺傳多樣性在種內(nèi)不同群體間的分布，即遺傳分化。通常認(rèn)為，衡量群體間遺傳分化程度的遺傳分化指數(shù)Fst為0～0.05時無分化，0.05～0.15時中度分化，0.15～0.25時高度分化[20]。本研究中A、B、C任意兩群體間Fst值均小于0.05，而分子方差分析顯示，僅有2.10%的遺傳變異來自不同體色黃鱔群體間。這充分說明，基于線粒體細(xì)胞色素b基因部分序列的三種體色黃鱔群體間沒有明顯遺傳分化，這與三種體色黃鱔生活區(qū)域相同有關(guān)，基于K-2P遺傳距離模型計算的群體內(nèi)、群體間平均遺傳距離也顯示了群體間遺傳多樣性還未積累較大區(qū)別。但基于群體遺傳距離的聚類分析結(jié)果顯示：深黃斑鱔（A）與青黃斑鱔（B）群體間親緣關(guān)系最近，深黃斑鱔（A）與青黃斑鱔（C）親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。這與劉良國等[4]基于RAPD的研究結(jié)果相一致，也與三種體色黃鱔群體繁殖力[6]、生長速度[7]和營養(yǎng)成分[10]等生物學(xué)指標(biāo)的差異類似。這表明三種體色黃鱔遺傳差異不顯著，但不同群體間親緣關(guān)系、生物學(xué)特性等具有一致的規(guī)律，這可能是所選分子標(biāo)記不同所致。線粒體Cyt b僅涉及母性遺傳，難以全面反應(yīng)群體間的遺傳差異，對于不同體色黃鱔的遺傳多樣性和親緣關(guān)系需要更深層次的研究，特別是加強(qiáng)核DNA水平上的研究。

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Genetic Diversity Analysis of Three Populations of Ricefield Eel Monopterus albus with Different Body Colors

LING Jun,JIANG He,HU Yu-ting,DUAN Guo-qing
（Fishery Research Institute,Anhui Academy of Agricultural Sciences,Hefei 230031,China）

The genetic diversity in three populations of ricefield eel Monopterus albus with deep yellow spot（A）,green yellow spot（B）,and green colors（C）was investigated using mitochondrial Cyt b gene.53 mutations of nucleotide acids and 36 haplotypes were observed in 82 samples,with average haplotype diversity of 0.9153 in population A,0.7517 in population B,and 0.9457 in population C,and nucleotide diversity of 0.00426 in population A,0.00211 in population B,and 0.00601 in population C.The molecular variance（AMOVA）revealed that there was no significant genetic differentiation among the populations,with genetic differentiation index（Fst）of 0.00282～0.04970.The cluster analysis based on genetic distance among populations indicated that population A and population B had the closest phylogenetic relationship,and population A and population C showed the farthest phylogenetic relationship.

Monopterus albus;color;cytochrome b;genetic diversity

S917

A

1005-3832（2016）04-0006-05

2016-03-14

農(nóng)業(yè)部行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項（201003076）；安徽省農(nóng)科院黃鱔創(chuàng)新團(tuán)隊（12c0501）；安徽省科技攻關(guān)項目（12010302056）.

凌俊，男，碩士，助理研究員.E-mail:fisherlling@163.com

江河，男，正高級工程師.E-mail:hfjianghe@sohu.com