竇志宇，張博文，吳燕英

（長(zhǎng)春理工大學(xué)化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，長(zhǎng)春 130022）

共價(jià)修飾法制備新型多巴胺傳感器

竇志宇，張博文，吳燕英

（長(zhǎng)春理工大學(xué)化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，長(zhǎng)春 130022）

在實(shí)驗(yàn)中將4arm-PEG-NH2和羥基苯基鐵卟啉共價(jià)修飾到玻碳電極上，成功地制備了一種新型DA傳感器。由于Fe（OH）4P和4arm-PEG-NH2的協(xié)同效應(yīng)，使得該傳感器對(duì)多巴胺的電催化活性得到明顯的提高，氧化過(guò)電位也得到了降低。在示差脈沖伏安法測(cè)定中（多巴胺的檢測(cè)范圍為0.2～125μmol L-1），計(jì)算獲得DA的檢出限為1.02×10-8M。

四臂-聚乙二醇-氨基復(fù)合物；5，10，15，20-四羥基苯基鐵卟啉；兩步共價(jià)修飾；多巴胺

做為單胺類神經(jīng)遞質(zhì)中的一種，多巴胺（DA）在調(diào)節(jié)荷爾蒙的分泌、中樞神經(jīng)系統(tǒng)及心血管系統(tǒng)的活動(dòng)等方面發(fā)揮了巨大的作用，它的濃度過(guò)高或過(guò)低都將直接或間接地引起一些疾病的發(fā)生［1-5］。所以多巴胺自被發(fā)現(xiàn)伊始，便在臨床應(yīng)用領(lǐng)域獲得了廣泛的關(guān)注，也因此有大量檢測(cè)多巴胺的方法在過(guò)去的幾十年中被相繼開發(fā)出來(lái)，比如熒光法［6］、化學(xué)發(fā)光法、離子色譜法［7］、毛細(xì)管電泳法等。相對(duì)比其他檢查手段而言，電化學(xué)方法以其較快的檢測(cè)速度，相對(duì)簡(jiǎn)單的制備過(guò)程，良好的重復(fù)性，低廉的制備成本等優(yōu)點(diǎn)，成為該領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)［8-10］。但同時(shí)也不能忽略一個(gè)事實(shí)，那就是多巴胺的電化學(xué)檢測(cè)非常容易受到其他生物活性分子的干擾，如抗壞血酸，尿酸，腎上腺素等等。從大量的研究結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，人們?cè)趪L試以電極修飾的方式來(lái)解決這些問(wèn)題，可以應(yīng)用的修飾材料包括金屬納米粒子［11，12］，導(dǎo)電聚合物涂覆的電極［13，14］，納米材料修飾的碳基質(zhì)［15］，金屬卟啉等等［16］。

在對(duì)亞硝酸鹽、揮發(fā)性有機(jī)物、一氧化碳和DA等生物和環(huán)境中重要分子的檢測(cè)方面，金屬卟啉作為電極修飾材料表現(xiàn)出了優(yōu)異的電催化性能［17-19］。但同時(shí)也看到，單獨(dú)以金屬卟啉作為電極修飾材料制備的多巴胺傳感器，仍會(huì)出現(xiàn)過(guò)電位較高的現(xiàn)象。而很多的研究結(jié)果證實(shí)，聚乙二醇單甲醚修飾的電極對(duì)提高DA的氧化還原活性、降低其氧化過(guò)電位起到了很好的促進(jìn)性的作用。四臂-聚乙二醇-氨基復(fù)合物（4arm-PEG-NH2）作為類似的非離子型表面活性劑，同樣可顯著降低在電化學(xué)反應(yīng)過(guò)程中電活性分子的過(guò)電位。

鑒于這兩類物質(zhì)對(duì)DA均具有良好的電化學(xué)催化活性，在實(shí)驗(yàn)中嘗試將4arm-PEG-NH2和羥基苯基鐵卟啉（Fe（OH）4P）共價(jià)修飾錨定到電極的表面獲得一種多巴胺傳感器，并對(duì)修飾電極的電催化性能進(jìn)行了系統(tǒng)的研究。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑和儀器

4arm-PEG-NH2和多巴胺（98%）購(gòu)于Aladdin試劑公司；抗壞血酸、磷酸鹽、無(wú)水乙醇、氯化鉀、氫氧化鈉均為分析純；DMF（99%）購(gòu)于薩思化學(xué)技術(shù)有限公司；另外，5，10，15，20-四羥基苯基鐵卟啉利用文獻(xiàn)方法制備［20］。

用CHI660D型電化學(xué)工作站（上海辰華）測(cè)試電化學(xué)，采用三電極體系，以修飾電極（GCE）或裸玻碳電極做為工作電極，飽和甘汞電極做為參比電極，對(duì)電極為鉑絲；采用PBS緩沖溶液（pH=7，濃度為0.2M）做為測(cè)試溶液；使用KQ-100DE型數(shù)控超聲波清洗器對(duì)樣品超聲清洗。

1.2 實(shí)驗(yàn)過(guò)程

修飾之前，需要依次用1.0μm，0.3μm和0.05μm的α-氧化鋁粉末對(duì)裸GCE電極進(jìn)行打磨拋光，然后再分別利用三次蒸餾水、乙醇和三次蒸餾水對(duì)電極超聲處理各2分鐘，最后氮?dú)獯蹈?。為了活化該修飾電極，還需將其放到pH=7.0的PBS溶液中進(jìn)行循環(huán)伏安掃描（電位范圍-0.2V～+0.2V，掃速為10mV s-1），待循環(huán)伏安曲線穩(wěn)定即可停止活化。把該活化電極放到20mL溶解了40mg Fe（OH）4P的DMF溶液中，以0.1M的四丁基高氯酸銨（TBAP）做為支持電解質(zhì)進(jìn)行循環(huán)伏安掃描（掃速20mV s-1，電位區(qū)間-1.2V～+1.6V）。繼續(xù)將該活化電極放到溶有20mL 50mg 4arm-PEG-NH2和48mg LiClO4的緩沖溶液（pH=7）中，循環(huán)伏安掃描15圈（電位區(qū)間為0～+1.0V，掃速為20mV s-1）。將修飾電極用三次蒸餾水沖洗，氮?dú)獯蹈?，在紅外燈下烘10分鐘。

2 結(jié)果與討論

2.1 Fe（OH）4P/4arm-PEG-NH2在GCE上的電化學(xué)修飾

實(shí)驗(yàn)中是先后兩步把羥基苯基鐵卟啉（Fe（OH）4P）和四臂-聚乙二醇-氨基聚合物（4arm-PEG-NH2）依次錨定到玻碳電極上的。通過(guò)循環(huán)伏安掃描（掃描電位區(qū)間在-0.2～+0.2V）的方式活化玻碳電極，活化完成后在玻碳電極的表面將富集大量的碳正離子。然后通過(guò)親核取代反應(yīng)，將羥基苯基鐵卟啉結(jié)構(gòu)上的羥基與活化電極表面的碳正離子共價(jià)結(jié)合；最后仍然通過(guò)親核取代反應(yīng)，使四臂-聚乙二醇-氨基聚合物結(jié)構(gòu)中的氨基與電極表面剩余的碳正離子共價(jià)鍵合，修飾過(guò)程如圖1所示。

圖1 循環(huán)伏安圖

2.2 修飾電極催化氧化DA

圖2為分別通過(guò)裸電極（電極a）、活化電極（電極b）、羥基苯基鐵卟啉（Fe（OH）4P）修飾電極（電極c）、四臂-聚乙二醇-氨基聚合物（4arm-PEG-NH2）修飾電極（電極d）以及Fe（OH）4P/4arm-PEG-NH2共修飾電極（電極e）檢測(cè)20μM DA緩沖溶液得到的系列循環(huán)伏安曲線。不難發(fā)現(xiàn)，DA對(duì)裸電極（a）幾乎沒(méi)有任何響應(yīng)；從電極b的檢測(cè)曲線中可以看出，峰電位差變小（ΔEp=177mV），電流響應(yīng)仍然不強(qiáng)；雖然可以從單獨(dú)修飾Fe（OH）4P的電極（c）的檢測(cè)曲線中觀察到一對(duì)明顯的氧化還原峰，但卻出現(xiàn)非常大的背景電流；四臂-聚乙二醇修飾的電極（d），峰形變尖，電流響應(yīng)明顯增大；而電極e較之于裸電極，氧化峰與還原峰電位差明顯變?。ép= 19mV），峰電流明顯增強(qiáng)。有力地證明了羥基苯基鐵卟啉和四臂-聚乙二醇-氨基聚合物復(fù)合物薄膜加快了電子轉(zhuǎn)移速率，提升了電化學(xué)氧化DA反應(yīng)的可逆性。

圖2 五種不同電極在DA緩沖溶液的循環(huán)伏安圖（20μM，pH=7，掃速50mV s-1）

2.3 掃速的影響

為了研究DA在修飾電極表面的電化學(xué)行為，在實(shí)驗(yàn)中固定了多巴胺濃度為20μM并改變掃描速度（從10mV s-1到500mV s-1），得到一系列循環(huán)伏安曲線，如圖3-5所示）。從圖可以看出，氧化和還原峰電流隨著掃速的增大也相應(yīng)變大，同時(shí)氧化峰電流發(fā)生正移，還原峰電流發(fā)生負(fù)移。另外，當(dāng)掃速較低時(shí)（10～180mV s-1），峰電流與掃速呈現(xiàn)出很好的線性關(guān)系；而在較高掃速（200～500mV s-1）時(shí)，峰電流和掃速的平方根呈現(xiàn)很好的線性關(guān)系。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明：在低掃速時(shí)DA的電化學(xué)反應(yīng)呈現(xiàn)出了受表面吸附控制的特點(diǎn)，而高掃速時(shí)修飾電極表面的DA反應(yīng)是受擴(kuò)散控制的。

圖3 共修飾電極在不同掃速下的循環(huán)伏安圖

圖4 Ipc和Ipa與掃速關(guān)系曲線圖

圖5 Ipc和Ipa與掃速平方根關(guān)系曲線圖

2.4 pH值的影響

為了進(jìn)一步探討Fe（OH）4P/4arm-PEG-NH2共修飾電極對(duì)多巴胺的電催化行為，還改變了酸堿條件（pH=3.0-9.0）對(duì)20μM的DA緩沖溶液進(jìn)行循環(huán)伏安掃描，得到一系列循環(huán)伏安曲線（如圖4）。從圖4中可以看出，多巴胺的氧化峰電位和還原峰電位隨pH值的增大而逐漸負(fù)移，所以推測(cè)在共修飾電極上有質(zhì)子參與到多巴胺的氧化還原反應(yīng)過(guò)程中。

圖6 不同pH值（3-9）的DA緩沖溶液在共修飾電極上的循環(huán)伏安曲線

同時(shí)也發(fā)現(xiàn)在pH值從3.0到9.0區(qū)間，Epa值與pH值表現(xiàn)出較好的線性關(guān)系（圖7B），斜率值為-59.51mV pH-1（接近理論值-59mV pH-1），可以推斷，F(xiàn)e（OH）4P/4arm-PEG-NH2共修飾電極對(duì)多巴胺的電催化氧化是等電子等質(zhì)子過(guò)程。同時(shí)，通過(guò)修飾電極所測(cè)得的多巴胺氧化峰電流值與pH值的關(guān)系曲線（圖7A）不難發(fā)現(xiàn)，在pH=5.0的緩沖溶液中DA的氧化峰電流最大。以此為依據(jù)選擇了效果最好的pH=5.0的溶液作為本實(shí)驗(yàn)的緩沖溶液。

2.5 干擾研究

正如前言所述，對(duì)多巴胺的檢測(cè)必須要排除體液中共存的AA等其它生命基質(zhì)的影響，所以在檢測(cè)多巴胺時(shí)研究了共修飾電極對(duì)其他物質(zhì)的抗干擾能力。選取了含AA（濃度為DA的25倍）和DA的混合溶液，對(duì)其進(jìn)行DPV檢測(cè)。從圖8可以看出，DA和AA氧化過(guò)電位未出現(xiàn)重疊，且兩峰差值為212mV。說(shuō)明即使在含有高濃度AA的情況下，F(xiàn)e（OH）4P/4arm-PEG-NH2共修飾電極仍對(duì)多巴胺表現(xiàn)出了很高的靈敏性、良好的選擇性。

圖7 DA隨pH變化關(guān)系圖

圖8 修飾電極在含有50μM DA和1000μM AA的pH 5.0的緩沖溶液中的循環(huán)伏安圖。

2.6 檢測(cè)DA

圖9是不同濃度的多巴胺緩沖溶液（pH=5.0）在Fe（OH）4P/4arm-PEG-NH2共修飾電極上的示差脈沖伏安圖（DVP），發(fā)現(xiàn)在0.2～125μM的濃度范圍內(nèi)，峰電流隨多巴胺濃度的增加而線性增加，得到的線性方程為：ipa（μA）=0.6041+0.2357C（μM），相關(guān)系數(shù)r為0.9990。該修飾電極通過(guò)公式Cm=3sbl/m計(jì)算得到的最低檢測(cè)限為1.02×10-8M，傳感器靈敏度為235.7μA mM-1?？梢姡捎贔e（OH）4P與4arm-PEG-NH2之間的協(xié)同作用，大大改善了修飾電極的檢測(cè)限和靈敏度，拓展了其應(yīng)用性。

圖9 不同濃度DA的緩沖溶液在Fe（OH）4P/ 4arm-PEG-NH2修飾電極上的示差脈沖伏安圖

從（a）到（q）是DA濃度分別為0.2，0.6，1.0，2.0，5.0，10，15，20，25，35，45，55，65，75，100，125μM。插圖為DA濃度與氧化峰電流之間的關(guān)系。

2.7 穩(wěn)定性研究

為了了解共修飾電極的穩(wěn)定性，將其在室溫下儲(chǔ)存3個(gè)月然后通過(guò)循環(huán)伏安法對(duì)20μM的DA緩沖溶液（pH=5.0）進(jìn)行檢測(cè)。從檢測(cè)結(jié)果來(lái)看，DA在放置了3個(gè)月的共修飾電極中的氧化峰電流僅降低5.17%，且氧化峰電位沒(méi)有發(fā)生明顯變化。充分說(shuō)明，F(xiàn)e（OH）4P/4arm-PEG-NH2共修飾電極具有較長(zhǎng)的使用壽命和非常好的穩(wěn)定性。

圖10 DA在修飾電極上的循環(huán)伏安圖

2.8 真實(shí)樣品分析

利用示差脈沖伏安法對(duì)人體血液進(jìn)行的檢測(cè)目的在于評(píng)估共修飾電極的實(shí)際應(yīng)用性（見表1）。在檢測(cè)之前，將人血清樣品用pH值為5.0的磷酸鹽緩沖溶液稀釋20倍。從表中可以看出，在鹽酸多巴胺注射液中DA的回收率分別100.6%，101.7%和99.47%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差較低，結(jié)果比較令人滿意。這也預(yù)示著通過(guò)共修飾的方法制備的多巴胺傳感器有望應(yīng)用于實(shí)際樣本中DA的測(cè)定。

表1 在人體血清樣品中測(cè)定DA的結(jié)果

3 結(jié)論

通過(guò)兩步共價(jià)修飾的方法，成功地將羥基苯基鐵卟啉（Fe（OH）4P）和四臂-聚乙二醇-氨基聚合物（4arm-PEG-NH2）錨定到玻碳電極表面。在隨后的研究中發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)e（OH）4P和4arm-PEG-NH2兩種物質(zhì)具有很好的協(xié)同作用，使得該電極表現(xiàn)出了優(yōu)異的電化學(xué)催化活性。主要體現(xiàn)在用共價(jià)修飾方法所得到的多巴胺傳感器具備優(yōu)異的選擇性和較高的靈敏度，很好的穩(wěn)定性，較低的檢出限，較長(zhǎng)的使用壽命等等，而這些都使得它具備了很好的應(yīng)用前景。

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Construction of Novel Dopamine Sensors Based on Covalent Modification Procedure

DOU Zhiyu，ZHANG Bowen，WU Yanying
（School of Chemistry and Environmental Engineering，Changchun University of Science and Technology,Changchun 130022）

We presented a novel dopamine（DA）sensor via a two-step covalent modification approach via anchoring 5，10，15，20-tetrakis（4-hydroxyphenyl）porphyrin（Fe（OH）4P）and 4-arm-（polyethylene glycol）-aminor（4 arm-PEGNH2）onto a glassy carbon electrode（GCE）.The fabricated sensor showed a pronounced electrocatalytic activity improvement toward the oxidation of DA and led to a significant decrease in the anodic overpotentials compared with bare GCE，which should be ascribed to the synergistic effect of Fe（OH）4P and 4arm-PEG-NH2-GCE.Using differential pulse voltammetry（DPV），the sensor gave a linear response to DA over the concentration range of 0.2～125μM，with a detection limit of 1.02×10-8M.

4-arm-（polyethylene glycol）-amino；5，10，15，20-tetrakis（4-hydroxyphenyl）porphyrin；two-step covalent modification；dopamine

O657

A

1672-9870（2016）06-0062-05

2016-08-02

竇志宇（1979-），女，博士，講師，E-mail：douzhiyu79@sina.cn