王浩權(quán)，糾 敏，汪倫記，邱智軍，黃 獅，張 敏

(河南科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院/洛陽市微生物發(fā)酵工程技術(shù)研究中心,河南 洛陽 471023)

侵染河南省番茄的番茄黃化曲葉病毒及伴隨衛(wèi)星DNA分子的基因組特征

王浩權(quán)，糾 敏*，汪倫記，邱智軍，黃 獅，張 敏

(河南科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院/洛陽市微生物發(fā)酵工程技術(shù)研究中心,河南 洛陽 471023)

從河南省長葛市的番茄病株上分離到4份病毒分離物HNCG1、HNCG2、HNCG3和HNCG4,為明確病原類型及其親緣關(guān)系，首先采用檢測雙生病毒的簡并引物進(jìn)行檢測，均能從樣品中擴(kuò)增出約500 bp的片段，4個序列同源性達(dá)99%。對HNCG4基因組DNA-A全序列測定表明，其全長為2 781 bp，與番茄黃化曲葉病毒(TYLCV)省內(nèi)分離物(HNSQ1、HNNY1、HNLY1、HNQX)及其臨近省份的河北分離物(TYLCV LF)、北京分離物(TYLCV BJ3)親緣關(guān)系較近，序列同源性均達(dá)99%。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，HNCG1和HNCG4均伴隨有1 347 bp的衛(wèi)星DNAβ，而HNCG2和HNCG3中未檢測到DNAβ。序列比對結(jié)果表明，HNCG1和HNCG4的DNAβ之間序列同源性為100%，與越南TYLCV分離物DX2的衛(wèi)星DNAβ序列同源性最高，達(dá)88%。根據(jù)以上結(jié)果，引起河南省長葛市番茄黃化曲葉病的病毒為TYLCV，部分分離物伴隨有衛(wèi)星DNA分子。

番茄黃化曲葉病毒； DNA-A； DNAβ； 雙生病毒； 番茄

雙生病毒是一種單鏈DNA植物病毒，具有孿生顆粒形態(tài)，已在多種經(jīng)濟(jì)作物上引起嚴(yán)重危害[1-3]。我國云南、廣東、廣西、海南和河南等地的番茄、煙草及番木瓜等多種經(jīng)濟(jì)作物及雜草寄主均受到雙生病毒的侵染，給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成極大損失[4-7]。由于雙生病毒的基因組結(jié)構(gòu)、傳播介體和其侵染的寄主范圍有所不同，可將其分為玉米線條病毒屬(Mastrevirus)、甜菜曲頂病毒屬(Curtovirus)、番茄偽曲頂病毒屬(Topocuvirus)和菜豆金色花葉病毒屬(Begomovirus)。其中菜豆金色花葉病毒屬病毒危害最為嚴(yán)重，發(fā)生也最為廣泛。在自然條件下，這類病毒多數(shù)是通過煙粉虱(Bemisiatabaci)進(jìn)行大范圍傳播，因此其也被稱為粉虱傳雙生病毒[8]。菜豆金色花葉病毒屬病毒中的多數(shù)病毒為雙組分病毒，基因組含有2條相似大小的DNA，即DNA-A和DNA-B雙組分序列，大小均為2.5～3.0 kb。另一部分菜豆金色花葉病毒屬病毒為單組分病毒，這類病毒分布相對較少，基因組中僅含有DNA-A，序列長度約為2.8 kb[9]。近年來，在全國暴發(fā)的一些單組分雙生病毒中，還逐漸發(fā)現(xiàn)其伴隨有衛(wèi)星DNAβ分子，并與之形成雙生病毒/DNAβ病害復(fù)合體[10]。

粉虱傳雙生病毒在熱帶、亞熱帶及部分溫帶地區(qū)多有發(fā)生，到目前為止，已報道有39個國家和地區(qū)的番茄、煙草、棉花等作物遭受到毀滅性的危害[2]。近年來，我國江蘇、河南、浙江等地也陸續(xù)報道發(fā)現(xiàn)類似雙生病毒引發(fā)的病狀，多種雙生病毒先后被報道[11-13]。為了明確粉虱傳雙生病毒在河南省長葛市番茄上的侵染狀況及進(jìn)化起源，在長葛市采集番茄病毒病樣品進(jìn)行病原的分子鑒定，發(fā)現(xiàn)引起長葛市番茄黃化曲葉病的病毒分離物為番茄黃化曲葉病毒(tomato yellow leaf curl virus，TYLCV)，其中部分病毒分離物伴隨有衛(wèi)星DNAβ，并對病毒分離物及其伴隨衛(wèi)星DNA分子進(jìn)行親緣關(guān)系分析，為研究雙生病毒在河南省的傳播和防控提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 毒源 病毒分離物HNCG1、HNCG2、HNCG3和HNCG4分離自河南省長葛市表現(xiàn)植株矮縮、頂葉卷曲黃化的番茄病株。

1.1.2 試劑Taq酶、克隆載體pMD18-T及T4 DNA連接酶均購自寶生物工程(大連)有限公司，所用引物均由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2 DNA提取

葉片總DNA的提取參考劉玉樂等[14]的方法。稱取10 mg 新鮮番茄病葉，加100 μL 0.5 mol/L NaOH，勻漿后低速離心，上清液用0.1 mol/L Tris-HCl(pH值8.0)稀釋100倍，取1 μL作模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

1.3 PCR擴(kuò)增、克隆和序列測定

根據(jù)謝艷等[15]報道的檢測粉虱傳雙生病毒的簡并引物PA(5′-TAATATTACCKGWKGVCCSC-3′)和PB(5′-TGGACYTTRCAWGGBCCTTCACA-3′)(K=G或T;W=A或T;V=A,C或G;S=C或G;Y=C或T;R=A或G;B=C,T或G)進(jìn)行PCR，擴(kuò)增到的特異片段包含雙生病毒基因間隔區(qū)(IR)序列和部分外殼蛋白(CP)基因，片段大小約500 bp，然后進(jìn)行T載體克隆和序列測定。根據(jù)測序結(jié)果，利用DNAMAN軟件設(shè)計特異性引物HN-F(5′-AACAGATTCAGGGAATTCATTTAG-3′)和HN-R(5′-CGGAAGCCCAGAATATACAGAATG-3′)，擴(kuò)增近全長的DNA-A。DNAβ全長序列擴(kuò)增參考謝艷等[16]的方法。通過1%瓊脂糖凝膠電泳分離PCR產(chǎn)物，經(jīng)凝膠回收試劑盒回收純化后，克隆到pMD18-T載體上，送南京金斯瑞生物科技有限公司測序。

1.4 序列分析

DNA序列用DNAMAN Version 6.0進(jìn)行處理與分析。采用NCBI序列比對工具BLAST程序nucleotide blast進(jìn)行序列比對，多序列比較分析采用Clustal W，進(jìn)化樹構(gòu)建采用MEGA 5.05中的鄰近相鄰法(Neighbor-Joining)。用于DNA-A和DNAβ序列比較和進(jìn)化分析的其他序列分別列于表1和表2。

表1 用于構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹的30種TYLCV分離物

續(xù)表1 用于構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹的30種TYLCV分離物

表2 用于序列比較的TYLCV分離物及伴隨的衛(wèi)星DNA

2 結(jié)果與分析

2.1 病毒分離物HNCG4基因組DNA-A結(jié)構(gòu)

以提取的HNCG1、HNCG2、HNCG3和HNCG4基因組DNA為模板，PA和PB為擴(kuò)增引物，PCR擴(kuò)增后電泳檢測，均得到約500 bp的特異性條帶。對產(chǎn)物進(jìn)行純化克隆并測序，發(fā)現(xiàn)HNCG1、HNCG2、HNCG3和HNCG4中這一段序列同源性高達(dá)99%，故此推測它們?yōu)橥浑p生病毒的不同分離物。選取其中HNCG4進(jìn)行全序列測定，拼接后發(fā)現(xiàn)，HNCG4 DNA-A全長2 781 bp，具有典型的Begomovirus屬病毒的基因組結(jié)構(gòu)特征，共編碼6個開放閱讀框(open reading frame,ORFs)。其中，病毒鏈編碼2個ORFs，即AV1(308—1 084 bp，編碼CP)和AV2(148—498 bp，編碼病毒移動相關(guān)蛋白)，互補(bǔ)鏈編碼4個ORFs，分別為AC1(1 542—2 615 bp，編碼復(fù)制酶)、AC2(1 226—1 633 bp，編碼轉(zhuǎn)錄激活蛋白)、AC3(1 081—1 485 bp，編碼復(fù)制增強(qiáng)蛋白)和AC4(2 171—2 464 bp，編碼復(fù)制或轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子)。在基因AC1與AV2之間有313 bp的IR序列，該區(qū)含有保守序列TAATATTAC、TATA box、正向重復(fù)序列GGTGTCT。

2.2 HNCG4 DNA-A與其他TYLCV分離物的同源性比較

TYLCV的株系有TYLCV-Israel、TYLCV-Mild及TYLCV-Iran等[17]。通過對分離物DNA-A基因組全序列同源性比對，發(fā)現(xiàn)HNCG4分離物與TYLCV-Israel株系同源性高達(dá)98.7%，遠(yuǎn)高于與其他株系的同源性(92%以下)。依據(jù)同種雙生病毒基因組序列同源性大于94%被認(rèn)為是同一株系的不同變種[18]，認(rèn)為采自河南省長葛市的HNCG4分離物屬于TYLCV-Israel株系。

基于DNA-A全序列構(gòu)建HNCG4分離物與其他已報道各分離物的系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖1)，可以得知HNCG4 DNA-A與TYLCV省內(nèi)分離物(HNSQ1、HNNY1、HNLY1、HNQX)及其臨近省份的河北分離物(TYLCV-LF)、北京分離物(TYLCV BJ3)親緣關(guān)系較近，序列同源性均達(dá)99%，而與其他分離物的DNA-A親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

圖1 基于DNA-A全序列構(gòu)建的TYLCV

2.3 病毒伴隨的DNAβ分子結(jié)構(gòu)及與其他已報道DNAβ的同源性比較

利用特異引物β01/β02對DNAβ全長進(jìn)行PCR擴(kuò)增，從分離物HNCG1和HNCG4中均得到一特異性條帶，長約1.3 kb，說明分離物HNCG1和HNCG4均伴隨有衛(wèi)星DNAβ。序列測定表明，HNCG1和HNCG4 DNAβ序列全長均為1 347 bp，兩者序列相似性為100%?；蚪M的結(jié)構(gòu)分析表明，HNCG樣品中病毒衛(wèi)星DNAβ具有一般雙生病毒的衛(wèi)星基因組結(jié)構(gòu)特征(圖2)：互補(bǔ)鏈編碼一個由113個氨基酸組成的βC1蛋白；一個相對保守的區(qū)域——衛(wèi)星病毒保守區(qū)域(SCR)，保守9核苷酸序列TAATATT/AC在其3′端；基因組764—1 001 bp處有一個腺嘌呤(A)的富集區(qū)域(A-rich區(qū))，A的重復(fù)數(shù)最高為11個(位于898—908 bp)。除莖環(huán)結(jié)構(gòu)TAATATT/AC外，DNAβ與其輔助病毒DNA-A

1指保守9核苷酸序列TAATATT/AC的切割位點

基因組序列之間基本沒有同源性。

HNCG1 DNAβ與其他TYLCV分離物DNAβ的全序列同源性比較表明，它與來自越南的TYLCV分離物VRQ、DX2伴隨衛(wèi)星DNA分子的同源性較高，分別為87%、88%，并與其聚為一支(圖3)，而與其他雙生病毒DNAβ的同源性均在71%以下，并且，該樣品的衛(wèi)星DNAβ序列與中國其他番茄黃化曲葉病毒分離物伴隨的衛(wèi)星DNAβ序列同源性均較低。

圖3 基于DNAβ全序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹

3 結(jié)論與討論

從河南省長葛市番茄上分離到HNCG1、HNCG2、HNCG3和HNCG4分離物，用PA和PB即雙生病毒簡并引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，均得到約500 bp片段，且4個序列之間同源性高達(dá)99%，推測它們可能為同一病毒。分析HNCG4 DNA-A序列和BLAST比對發(fā)現(xiàn)，HNCG4 DNA-A與TYLCV省內(nèi)分離物及其臨近省份的河北分離物、北京分離物親緣關(guān)系較近，序列同源性均達(dá)99%。雙生病毒科病毒全基因組核苷酸序列之間，如果同源性小于89%，一般被認(rèn)為是不同病毒；如果大于89%，可認(rèn)為是同一病毒的不同株系[19]。由此，認(rèn)為HNCG4是TYLCV的一個分離物，TYLCV是引起河南番茄黃化曲葉病的主要病原[7]。

PCR檢測結(jié)果表明，HNCG1和HNCG4還伴隨有衛(wèi)星DNA分子。近年來，有關(guān)單組分雙生病毒伴隨有衛(wèi)星DNA分子的報道不斷增多[20-23]。同種雙生病毒的衛(wèi)星DNA分子之間序列同源性達(dá)72%～99%，而不同雙生病毒的衛(wèi)星DNA分子之間序列同源性為36%～57%[10]。HNCG1和HNCG4伴隨的衛(wèi)星DNA分子與已報道的TYLCV越南分離物DX2、VRQ伴隨的衛(wèi)星DNA分子序列同源性分別為88%、87%，因此，HNCG1和HNCG4伴隨的衛(wèi)星DNA分子與TYLCV越南分離物DX2、VRQ為同種雙生病毒的衛(wèi)星DNA分子。

本研究僅在HNCG1和HNCG4分離物中檢測到伴隨DNAβ的現(xiàn)象，而在HNCG2和HNCG3分離物內(nèi)未檢測到。另外，采自河南省不同地區(qū)的59份分離物中，除了HNCG1和HNCG4以外，也均未檢測到DNAβ的存在[12]，這也許是大田中TYLCV致病不一定都需要衛(wèi)星DNA分子的伴隨。之前已有一些相似的報道，云南煙草曲葉病毒(tobacco leaf curl Yunnan virus,TbLCYNV)[24]和廣西番茄曲葉病毒(tomato leaf curl Guangxi virus,ToLCGxV)[25]僅有一部分分離物伴隨有衛(wèi)星DNA分子，并且衛(wèi)星DNA分子也未加重癥狀的表現(xiàn)。

張輝[13]在對侵染我國番茄雙生病毒種類鑒定過程中發(fā)現(xiàn)，侵染河南番茄的病毒除TYLCV以外，還有中國番木瓜曲葉病毒(papaya leaf curl China virus,PaLCuCNV)，并且該病毒伴隨有衛(wèi)星DNAβ。因此，有關(guān)河南省內(nèi)番茄病毒病的病原類型以及是否存在伴隨DNAβ，還有待進(jìn)一步的病毒樣品采集及分子檢測。通過對雙生病毒及其伴隨衛(wèi)星進(jìn)行檢測，能夠進(jìn)一步提高對雙生病毒發(fā)病情況的關(guān)注度，有利于預(yù)防該病毒病在河南省內(nèi)大面積暴發(fā)。另外，有關(guān)HNCG1和HNCG4分離物中伴隨的衛(wèi)星DNA分子在TYLCV致病中的作用，也有待做進(jìn)一步的研究。

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Genomic Characterization of DNA-A and Associated Satellite DNA Molecule of Tomato Yellow Leaf Curl Virus Infecting Tomato in Henan

WANG Haoquan,JIU Min*,WANG Lunji,QIU Zhijun,HUANG Shi,ZHANG Min

(College of Food and Bioengineering,Henan University of Science and Technology/Luoyang Engineering and Technology Research Center of Microbial Fermentation,Luoyang 471023,China)

Four virus isolates including HNCG1,HNCG2,HNCG3 and HNCG4 were obtained from tomato plants showing leaf curl symptom in Changge city,Henan province.In order to clear the pathogens and find out the genetic relationship between each other,PCR was adopted firstly to detect the tomato samples using degenerate primers for geminiviruses.A 500 bp fragment was obtained from all the samples,and the nucleotide sequence identity between the four isolates reached 99%.The complete DNA-A sequence of HNCG4 was determined to be 2 781 bp.Comparisons showed that the DNA-A of HNCG4 had the highest sequence identity(99%) with that of tomato yellow leaf curl virus(TYLCV) isolates HNSQ1,HNNY1,HNLY1,HNQX from Henan,and TYLCV LF,TYLCV BJ3 isolated from adjacent Hebei and Beijing,respectively.PCR analysis demonstrated that isolates HNCG1 and HNCG4 were associated with DNAβ component of 1 347 bp,but isolates HNCG2 and HNCG3 were not.Sequence comparisons revealed that DNAβ of HNCG1 and HNCG4 was 100% similar to each other,and they shared the highest sequence identity(88%) with that of TYLCV Vietnam isolate DX2.In conclusion,leaf curl symptom of tomato in Changge city was caused by TYLCV,and partial isolates of the virus were associated with DNAβ molecule.

tomato yellow leaf curl virus; DNA-A; DNAβ; geminivirus; tomato

2016-02-19

國家自然科學(xué)基金項目(31101443); 河南省科技攻關(guān)計劃項目(122102110197)

王浩權(quán)(1991-),男,河南登封人,在讀碩士研究生,研究方向：煙粉虱與雙生病毒的互作機(jī)制。 E-mail:664366923@qq.com

*通訊作者：糾 敏(1971-),女,河南杞縣人,副教授,博士,主要從事煙粉虱與雙生病毒的互作機(jī)制研究。 E-mail:jiumin0912@163.com

S436.412.1

A

1004-3268(2016)10-0071-06