毛璐璐，孔佑賓，李喜煥，張彩英

(河北農(nóng)業(yè)大學(xué)/教育部華北作物種質(zhì)資源研究與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 保定 071001)

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轉(zhuǎn)紫色酸性磷酸酶基因GmPAP14大豆研究

毛璐璐，孔佑賓，李喜煥*，張彩英*

(河北農(nóng)業(yè)大學(xué)/教育部華北作物種質(zhì)資源研究與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 保定 071001)

為獲得磷高效利用轉(zhuǎn)基因大豆新材料，構(gòu)建紫色酸性磷酸酶基因GmPAP14超表達(dá)載體pBI121-GmPAP14與pCAMBIA3301-GmPAP14，通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)子葉節(jié)轉(zhuǎn)化技術(shù)將2個(gè)載體分別轉(zhuǎn)入高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)大豆品種，并分析了GmPAP14在轉(zhuǎn)基因植株內(nèi)的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，利用PCR和DNA測(cè)序分析可檢測(cè)到轉(zhuǎn)化植株中的目的條帶，其中，轉(zhuǎn)入pBI121-GmPAP14載體的保豆3號(hào)陽(yáng)性植株有6 株；轉(zhuǎn)入pCAMBIA3301-GmPAP14載體的中豆32有9株，冀豆12有11株，農(nóng)大豆2號(hào)20株。進(jìn)一步將上述T0植株自交，目前已獲得T1轉(zhuǎn)基因后代；經(jīng)實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)，部分株系的GmPAP14表達(dá)量顯著高于野生型對(duì)照，說(shuō)明GmPAP14已整合到大豆基因組，并能夠在轉(zhuǎn)錄水平正常表達(dá)。

大豆； 紫色酸性磷酸酶基因； 載體構(gòu)建； 遺傳轉(zhuǎn)化； 基因表達(dá)

酸性磷酸酶是植物應(yīng)對(duì)低磷脅迫的一種重要水解酶類(lèi)，直接參與磷代謝轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程，能催化分解土壤或植株體內(nèi)的單核苷酸、磷脂等有機(jī)態(tài)磷化合物，釋放無(wú)機(jī)態(tài)磷供植物吸收利用[4]。因此，克隆并轉(zhuǎn)化酸性磷酸酶基因成為提高植物耐低磷特性的新途徑。Liang等[5]從菜豆中分離酸性磷酸酶基因PvPAP3，當(dāng)ATP作為唯一磷源時(shí)，PvPAP3能夠增強(qiáng)植物對(duì)ATP的利用。Wang等[6]將擬南芥酸性磷酸酶基因AtPAP15轉(zhuǎn)入大豆，轉(zhuǎn)基因株系在酸性土壤中的單株莢數(shù)和單株粒數(shù)較野生型顯著增加。Hur等[7]將磷特異誘導(dǎo)基因OsPAP2轉(zhuǎn)入擬南芥，發(fā)現(xiàn)超表達(dá)轉(zhuǎn)基因擬南芥酸性磷酸酶活性顯著高于野生型。Kong等[8]從大豆中克隆獲得GmPAP4基因，經(jīng)轉(zhuǎn)化擬南芥發(fā)現(xiàn)，在有機(jī)態(tài)磷處理?xiàng)l件下，轉(zhuǎn)基因擬南芥生物質(zhì)量較野生型顯著提高。

筆者所在實(shí)驗(yàn)室前期克隆了大豆紫色酸性磷酸酶基因GmPAP14(GenBank No.FJ617239)，植酸磷處理后，超表達(dá)轉(zhuǎn)GmPAP14擬南芥植株形態(tài)及植酸磷利用相關(guān)的生理指標(biāo)均優(yōu)于野生型，說(shuō)明GmPAP14具有提高轉(zhuǎn)基因擬南芥耐低磷能力的作用[9-11]。在此基礎(chǔ)上，本研究構(gòu)建GmPAP14超表達(dá)載體，通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)子葉節(jié)技術(shù)轉(zhuǎn)化高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)大豆品種，并分析GmPAP14在轉(zhuǎn)基因植株內(nèi)的表達(dá)情況，以獲得磷高效利用轉(zhuǎn)基因新材料，為進(jìn)一步培育磷高效利用轉(zhuǎn)基因大豆新品種(系)提供基礎(chǔ)材料。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

本研究所用轉(zhuǎn)化受體包括保豆3號(hào)、中豆32、冀豆12和農(nóng)大豆2號(hào)，均為生產(chǎn)上推廣的高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)大豆品種，由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)大豆遺傳育種課題組提供。中間載體pGM-T-GmPAP14為本實(shí)驗(yàn)室前期獲得，由克隆載體pGM-T與GmPAP14的開(kāi)放閱讀框構(gòu)建而成。植物表達(dá)載體pBI121由本實(shí)驗(yàn)室提供，pCAMBIA3301由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院生物技術(shù)研究所提供，農(nóng)桿菌菌株為EHA105。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 植物超表達(dá)載體pBI121-GmPAP14的構(gòu)建 利用限制性?xún)?nèi)切酶XbaⅠ與BamHⅠ，對(duì)中間載體pGM-T-GmPAP14和植物超表達(dá)載體pBI121進(jìn)行雙酶切處理，將回收的目的片段采用T4-DNA連接酶進(jìn)行連接；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α后挑取單克隆，經(jīng)菌液PCR和酶切檢測(cè)后，將陽(yáng)性克隆進(jìn)一步測(cè)序鑒定；提取序列正確的陽(yáng)性克隆質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌菌株EHA105。PCR擴(kuò)增所用引物為PAP-F1：5′-GGTACCATGGGTGTTGTGGAGGGTCT-

CT-3′；PAP-R1：5′-GTCGACTTAATGTGAAACATGAGCAG-3′。

1.2.2 植物超表達(dá)載體pCAMBIA3301-GmPAP14的構(gòu)建 利用限制性?xún)?nèi)切酶PmlⅠ、BamHⅠ酶切中間載體pGM-T-GmPAP14和超表達(dá)載體pCAMBIA3301，將回收的目的片段用T4-DNA連接酶進(jìn)行連接；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α后挑取單克隆，經(jīng)菌液PCR和酶切檢測(cè)后，將陽(yáng)性克隆進(jìn)一步測(cè)序鑒定；提取序列正確的陽(yáng)性克隆質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌菌株EHA105。PCR擴(kuò)增所用引物為PAP-F2：5′-GGATCCATGGGTGTTGTGGAGGGT-3′；PAP-R2：5′-CACGTGTTAATGTGAAACATGAGC-3′。

1.2.3 農(nóng)桿菌介導(dǎo)大豆子葉節(jié)遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù) 轉(zhuǎn)化方法參照邵振啟[12]農(nóng)桿菌介導(dǎo)子葉節(jié)遺傳轉(zhuǎn)化，其中轉(zhuǎn)pBI121-GmPAP14的外植體再生芽卡那霉素(Kan)篩選質(zhì)量濃度為0.1 g/L，轉(zhuǎn)pCAMBIA3301-GmPAP14的草銨膦(PPT)篩選質(zhì)量濃度為0.005 g/L。

1.2.4 轉(zhuǎn)化植株及其后代PCR檢測(cè) CTAB法提取大豆植株葉片基因組DNA，對(duì)GmPAP14進(jìn)行PCR擴(kuò)增和電泳檢測(cè)。轉(zhuǎn)pBI121-GmPAP14載體大豆植株所用引物序列為PAP-F3：5′-CACGACACACTTGTCTACTCCA-3′；PAP-R3：5′-CCAGTAATGCACTTCGCTCG-3′；轉(zhuǎn)pCAMBIA3301-GmPAP14載體大豆植株所用引物序列為PAP-F4：5′-TGGTTGGGCGGTCGTTCA-3′；PAP-R4：5′-AGCAAAGACATCGCTGTCAAG-3′。其中引物PAP-F3與PAP-R3擴(kuò)增片段長(zhǎng)度683 bp，PAP-F4與PAP-R4擴(kuò)增片段長(zhǎng)度559 bp。PCR擴(kuò)增程序?yàn)?5 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，60 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，回收目的片段進(jìn)行測(cè)序分析。

1.2.5 轉(zhuǎn)GmPAP14陽(yáng)性植株目的基因表達(dá)量分析 以冀豆12-GmPAP14 T1陽(yáng)性植株及其野生型為材料，提取其RNA并反轉(zhuǎn)錄cDNA，以actin11作為內(nèi)參對(duì)照，分別設(shè)計(jì)目的基因GmPAP14與內(nèi)參基因actin11實(shí)時(shí)定量PCR引物(PAP-F5：5′-TCAAGCAGCCCCTTCATTAG-3′,PAP-R5：5′-AGTTTTC-CTTCGGCAATCTTC-3′;actin11-F1：5′-ATCTTGACTGAGCGTGGTTATTCC-3′,actin11-R1：5′-GCTGGTCCTGGCTGTCTCC-3′)，反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃ 5 min；95 ℃ 15 s，56 ℃ 15 s，72 ℃ 20 s，40 個(gè)循環(huán)；利用2-△△Ct方法進(jìn)行目的基因表達(dá)量分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 植物超表達(dá)載體pBI121-GmPAP14的構(gòu)建

通過(guò)酶切和連接獲得植物超表達(dá)載體pBI121-GmPAP14，將載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，對(duì)獲得的單克隆菌液進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到大小為1 395 bp的目的片段；利用XbaⅠ、BamH Ⅰ雙酶切鑒定陽(yáng)性克隆，獲得GmPAP14片段(圖1)；進(jìn)一步將陽(yáng)性克隆測(cè)序分析，得到了序列正確的超表達(dá)載體pBI121-GmPAP14，用于后續(xù)大豆品種遺傳轉(zhuǎn)化(圖2)。

a.菌液PCR檢測(cè)，M：DNA Marker DL2000； B：空白對(duì)照；1—8：pBI121-GmPAP14陽(yáng)性單克隆。b.酶切鑒定，M：DNA Marker DL2000； 1：未酶切對(duì)照；2：酶切后的pBI121-GmPAP14

圖2 超表達(dá)載體pBI121-GmPAP14示意圖

2.2 植物超表達(dá)載體pCAMBIA3301-GmPAP14的構(gòu)建

通過(guò)酶切和連接獲得植物超表達(dá)載體pCAMBIA3301-GmPAP14，將載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，對(duì)獲得的單克隆菌液進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到大小為

1 395 bp的目的片段；采用BamHⅠ、PmlⅠ雙酶切鑒定陽(yáng)性克隆，獲得GmPAP14目的片段(圖3)；進(jìn)一步將陽(yáng)性克隆測(cè)序分析，得到了序列正確的超表達(dá)載體pCAMBIA3301-GmPAP14，用于后續(xù)大豆品種遺傳轉(zhuǎn)化(圖4)。

a.菌液PCR檢測(cè)，M：DNA Marker DL2000；B：空白對(duì)照；1—8：pCAMBIA3301-GmPAP14陽(yáng)性單克隆。

b.酶切鑒定，M：DNA Marker DL2000； 1：未酶切對(duì)照；2：酶切后的pCAMBIA3301-GmPAP14

圖3 含pCAMBIA3301-GmPAP14載體菌液的PCR與酶切鑒定

圖4 超表達(dá)載體pCAMBIA3301-GmPAP14示意圖

2.3 轉(zhuǎn)GmPAP14大豆陽(yáng)性植株及其后代PCR檢測(cè)結(jié)果

采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)子葉節(jié)轉(zhuǎn)化技術(shù)(圖5)，將超表達(dá)載體pBI121-GmPAP14轉(zhuǎn)入保豆3號(hào)，將pCAMBIA3301-GmPAP14載體轉(zhuǎn)入中豆32、冀豆12和農(nóng)大豆2號(hào)。對(duì)轉(zhuǎn)化植株進(jìn)行PCR檢測(cè)，含不同載體的大豆品種均能擴(kuò)增出目的條帶，片段大小分別為683 bp、559 bp；回收目的條帶并進(jìn)行測(cè)序分析，與對(duì)應(yīng)表達(dá)載體基因序列完全一致。其中，轉(zhuǎn)pBI121-GmPAP14保豆3號(hào)有6株；轉(zhuǎn)pCAMBIA3301- GmPAP14中豆32有9株，冀豆12有11株，農(nóng)大豆2號(hào)有20株。將陽(yáng)性植株自交，進(jìn)行目的基因PCR檢測(cè)和測(cè)序分析，獲得了轉(zhuǎn)有GmPAP14的T1植株(圖6，圖7)。由此說(shuō)明，GmPAP14已整合于大豆品種基因組中，且可自交遺傳至T1。

A：種子消毒； B、C：萌發(fā)培養(yǎng)； D：共培養(yǎng)； E：芽誘導(dǎo)； F：芽伸長(zhǎng)； G、H：生根； I：煉苗； J：移栽

a.PCR檢測(cè)，M：DNA Marker DL2000； B：空白對(duì)照； W：野生型對(duì)照； 1—11：轉(zhuǎn)化植株； P：陽(yáng)性對(duì)照。

a.PCR檢測(cè)，M：DNA Marker DL2000； B：空白對(duì)照； W：野生型對(duì)照； 1—13：轉(zhuǎn)化植株； P：陽(yáng)性對(duì)照。

2.4 轉(zhuǎn)GmPAP14大豆目的基因表達(dá)量分析

采用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)對(duì)獲得的轉(zhuǎn)GmPAP14 T1陽(yáng)性材料冀豆12-GmPAP14進(jìn)行目的基因表達(dá)量分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，5個(gè)轉(zhuǎn)基因株系中，有3個(gè)株系(OE-3、OE-4、OE-5)中的GmPAP14表達(dá)量顯著高于野生型對(duì)照(圖8)，說(shuō)明GmPAP14在上述3個(gè)株系中能夠正常轉(zhuǎn)錄表達(dá)。

WT：野生型對(duì)照； OE-1—OE-5：轉(zhuǎn)GmPAP14不同大豆株系

3 結(jié)論與討論

紫色酸性磷酸酶是一類(lèi)具有雙核金屬脫氫酶特征的含鐵糖蛋白，有5個(gè)保守基序、7個(gè)高度保守氨基酸殘基，大多具有非特異性，在植物組織中廣泛分布[13]。它是植物對(duì)土壤有機(jī)磷利用和植株體內(nèi)磷重新分配過(guò)程的重要參與者。在低磷脅迫條件下，酸性磷酸酶在植物體內(nèi)活性增強(qiáng)，進(jìn)而分解單核苷酸、磷脂等有機(jī)磷，釋放出無(wú)機(jī)磷供植物生長(zhǎng)發(fā)育所需。與此同時(shí)，根系分泌酸性磷酸酶增多，活化土壤有機(jī)磷成分供植物吸收利用，進(jìn)而維持植物體磷素平衡[14-16]。

迄今，有關(guān)大豆酸性磷酸酶基因的研究報(bào)道較少。筆者所在課題組篩選得到磷高效大豆品種中黃15，并從中克隆得到酸性磷酸酶基因GmPAP14。比對(duì)分析GmPAP14編碼蛋白質(zhì)與其他物種紫色酸性磷酸酶的同源性，發(fā)現(xiàn)其與豆科植物GmPAP1及MtPAP1有較近的親緣關(guān)系[9-10]，GmPAP1被證實(shí)在低磷脅迫下能提高大豆植株磷利用率，轉(zhuǎn)化MtPAP1基因的擬南芥和白三葉草在有機(jī)態(tài)磷處理下的生物學(xué)產(chǎn)量顯著高于野生型，且吸收利用有機(jī)磷的能力明顯提高[17-20]。GmPAP14經(jīng)植酸磷處理14～70 d，其在磷高效大豆品種的表達(dá)量持續(xù)顯著高于磷低效品種，且證實(shí)轉(zhuǎn)GmPAP14擬南芥具有分解根際周?chē)菜崃椎哪芰11]。

在此基礎(chǔ)上，本研究利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)大豆子葉節(jié)轉(zhuǎn)化技術(shù)將GmPAP14轉(zhuǎn)入保豆3號(hào)、冀豆12、中豆32和農(nóng)大豆2號(hào)等高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)大豆品種中，經(jīng)PCR擴(kuò)增與測(cè)序分析，證實(shí)GmPAP14已穩(wěn)定整合至上述品種基因組中，目前已獲得T1轉(zhuǎn)基因后代；經(jīng)進(jìn)一步采用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)檢測(cè)GmPAP14在不同轉(zhuǎn)基因株系中的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，GmPAP14在不同株系中的RNA水平表達(dá)量存在一定差異，分析其原因可能與不同株系中的GmPAP14整合位置及其拷貝數(shù)等因素有關(guān)；基于不同轉(zhuǎn)基因株系中的目的基因表達(dá)情況，本研究篩選出GmPAP14表達(dá)量較野生型顯著提高的3個(gè)新材料，為今后繼續(xù)深入研究GmPAP14在來(lái)源物種中的生物學(xué)功能及其耐低磷轉(zhuǎn)基因新品種(系)培育奠定重要物質(zhì)基礎(chǔ)。

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Transformation of Soybean with Purple Acid Phosphatase GeneGmPAP14

MAO Lulu,KONG Youbin,LI Xihuan*,ZHANG Caiying*

(Agricultural University of Hebei/North China Key Laboratory of Crop Germplasm Resources, Education Ministry of China,Baoding 071001,China)

To obtain new transgenic soybean materials with high phosphorus utilization efficiency,the over-expression vectors pBI121-GmPAP14 and pCAMBIA3301-GmPAP14 were constructed base onGmPAP14,a purple acid phosphatase gene,and were introduced into high-yield soybean varieties byAgrobacterium-mediated cotyledonary-node transformation method.The results of PCR amplification and DNA-sequencing analysis showed that the target bands were detected in transformed plants.Total six PCR positive plants of vector pBI121-GmPAP14 in Baodou 3,and nine,eleven,twenty PCR positive plants of vector pCAMBIA3301-GmPAP14 in Zhongdou 32,Jidou 12,Nongdadou 2 were obtained,respectively.T1transgenic plants were obtained by selfing of T0transformed plants,and the results of real-time quantitative PCR showed that the expression ofGmPAP14 in transgenic plants were significantly higher than that in the wild-type control,which suggested that theGmPAP14 was incorporated into the soybean genome and could express at the transcriptional level.

soybean; purple acid phosphatase gene; vector construction; genetic transformation; gene expression

2016-06-02

轉(zhuǎn)基因生物新品種培育科技重大專(zhuān)項(xiàng)(2014ZX0800404B)；國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31401405)

毛璐璐(1990-)，女，黑龍江鶴崗人，在讀碩士研究生，研究方向：大豆分子生物學(xué)與轉(zhuǎn)基因研究。 E-mail:maolulu524@163.com

*通訊作者：李喜煥(1974-)，女，河北保定人，副教授，博士，主要從事大豆遺傳育種與轉(zhuǎn)基因研究。 E-mail:lixihuan@hebau.edu.cn 張彩英(1960-)，女，河北深澤人，研究員，博士，主要從事大豆遺傳育種與轉(zhuǎn)基因研究。 E-mail:zhangcaiying@hebau.edu.cn

S565.1

A

1004-3268(2016)11-0025-05