韓長(zhǎng)志,任雪敏

(西南林業(yè)大學(xué) 林學(xué)院/云南省森林災(zāi)害預(yù)警與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650224)

褐環(huán)乳牛肝菌中分泌蛋白的理化性質(zhì)分析

韓長(zhǎng)志,任雪敏

(西南林業(yè)大學(xué) 林學(xué)院/云南省森林災(zāi)害預(yù)警與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650224)

為了更好地明確褐環(huán)乳牛肝菌分泌蛋白的功能，基于前期所獲得327個(gè)分泌蛋白序列，對(duì)其理化性質(zhì)進(jìn)行分析。結(jié)果表明，69.72%的分泌蛋白理論等電點(diǎn)小于6.0，屬于酸性蛋白，同時(shí)，利用隨機(jī)數(shù)生成軟件對(duì)上述不同理論等電點(diǎn)類別的分泌蛋白進(jìn)行10%抽樣分析，明確33個(gè)不同理論等電點(diǎn)類別的分泌蛋白(包括23個(gè)酸性蛋白、4個(gè)中性蛋白、6個(gè)堿性蛋白)的分子質(zhì)量、分子式、原子數(shù)量、半衰期、不穩(wěn)定性系數(shù)、脂肪族氨基酸指數(shù)、總平均親水性等理化性質(zhì)，其中14個(gè)分泌蛋白為穩(wěn)定性蛋白，14個(gè)分泌蛋白為親水性蛋白。

褐環(huán)乳牛肝菌； 分泌蛋白； 理論等電點(diǎn)； 理化性質(zhì)

褐環(huán)乳牛肝菌(Suillusluteus)又名褐環(huán)粘蓋牛肝菌，該菌不僅可以與松樹(shù)、落葉松、云杉和冷杉等針葉植物形成外生菌根，為上述植物提供重要的磷元素供給，還可以為人們帶來(lái)營(yíng)養(yǎng)豐富的美味享受。目前該菌全基因組序列已經(jīng)公布，國(guó)內(nèi)學(xué)者從發(fā)酵條件[1-2]、培養(yǎng)條件[3]方面對(duì)其進(jìn)行了大量研究，以及該菌對(duì)樟子松和油松苗的促生作用[4]、與木霉協(xié)同促進(jìn)紅皮云杉苗木抗逆增效作用等[5]研究，同時(shí)，還涉及過(guò)量鈉鹽、堿性pH值[6]和平菇汁[7]、接種量[8]對(duì)其生長(zhǎng)的影響研究，以及pH值對(duì)其三羧酸循環(huán)、草酸分泌及代謝途徑中關(guān)鍵酶活性的影響研究[9-10]等。此外，就國(guó)內(nèi)諸多學(xué)者對(duì)該菌最適pH值的研究報(bào)道而言[2-3,6,8,11-15]，主要研究單位涉及西北農(nóng)林科技大學(xué)、中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院、內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)等。通過(guò)對(duì)上述研究結(jié)果進(jìn)行匯總分析，明確國(guó)內(nèi)S.luteus的pH值在4.0～7.0，尤以5.5～6.0居多。作為針葉樹(shù)種的重要外生菌根菌之一，在提高根系對(duì)磷元素和水分的吸收方面具有重要的作用[16]。然而，關(guān)于該菌為宿主植物提供磷元素的分子生態(tài)機(jī)制以及該菌分泌蛋白在磷元素代謝方面的作用研究尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究基于前期所獲得的327個(gè)分泌蛋白序列，同時(shí)結(jié)合前人對(duì)該菌最適酸堿度的研究成果，通過(guò)生物信息學(xué)分析方法解析該菌分泌蛋白的基本理化性質(zhì)，以期為深入開(kāi)展植物非致病菌中分泌蛋白影響寄主生長(zhǎng)方面的研究提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料

前期利用SignalP、ProtComp、TMHMM、big-PI Fungal Predictor和TargetP等預(yù)測(cè)程序?qū).luteus蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)中的18 303條序列進(jìn)行分析預(yù)測(cè)，以該菌中含有的327個(gè)分泌蛋白為供試材料。

1.2 方法

1.2.1 蛋白質(zhì)理化性質(zhì)預(yù)測(cè) 利用蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)[17]在線分析預(yù)測(cè)分泌蛋白的等電點(diǎn)、分子質(zhì)量及氨基酸組成等。

1.2.2 后續(xù)蛋白選擇 利用隨機(jī)數(shù)形成軟件，對(duì)327個(gè)分泌蛋白中屬于不同等電點(diǎn)類別的分泌蛋白進(jìn)行10%的隨機(jī)抽樣選擇，用于后續(xù)蛋白理化性質(zhì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 分泌蛋白的理論等電點(diǎn)預(yù)測(cè)

通過(guò)對(duì)327個(gè)分泌蛋白的理論等電點(diǎn)進(jìn)行分析(圖1)，發(fā)現(xiàn)最低值為3.33，最高值為10.76，以0.50為1個(gè)間隔單位，對(duì)上述分泌蛋白進(jìn)行歸類分析，結(jié)果表明，位于4.51～5.00的分泌蛋白數(shù)量最多，為73個(gè)，所占比例為23.32%；其次為位于4.01～4.50的分泌蛋白，數(shù)量為72個(gè)，所占比例為22.02%。理論等電點(diǎn)小于6.0的分泌蛋白有228個(gè)，所占比例高達(dá)69.72%，其次為理論等電點(diǎn)高于8.0的分泌蛋白有62個(gè)，所占比例為18.96%，而位于6.0～8.0的分泌蛋白所占比例僅為11.31%，數(shù)量為37個(gè)，上述結(jié)果表明，褐環(huán)乳牛肝菌中分泌蛋白大多屬于酸性蛋白，該現(xiàn)象是否與其為松樹(shù)等共生植物提供磷元素有關(guān)尚有待于進(jìn)一步驗(yàn)證。

圖1 褐環(huán)乳牛肝菌中327個(gè)分泌蛋白理論等電點(diǎn)的分布情況

2.2 部分分泌蛋白理化性質(zhì)分析

從表1可以看出，在23個(gè)酸性蛋白中，有14個(gè)為假定蛋白(hypothetical protein)，所占比例為60.87%，其余8個(gè)為糖苷水解酶家族蛋白(glycoside hydrolase family)，1個(gè)為多銅氧化酶(multicopper oxidase)；4個(gè)中性蛋白預(yù)測(cè)功能均為假定蛋白；6個(gè)堿性蛋白中，5個(gè)預(yù)測(cè)功能為假定蛋白，所占比例為83.33%，1個(gè)為碳水化合物結(jié)合模塊家族蛋白(carbohydrate-binding module family)。同時(shí)，就不同類型分泌蛋白所含有的正、負(fù)電荷氨基酸殘基數(shù)而言，酸性蛋白中的負(fù)電荷氨基酸殘基數(shù)均大于正電荷氨基酸殘基數(shù)，而中性蛋白中的正、負(fù)電荷氨基酸殘基數(shù)基本相同，堿性蛋白則與上述蛋白不同，為正電荷氨基酸殘基數(shù)大于負(fù)電荷氨基酸殘基數(shù)。

此外，對(duì)分泌蛋白的分子質(zhì)量、分子式、原子數(shù)量、半衰期、不穩(wěn)定性系數(shù)、脂肪族氨基酸指數(shù)、總平均親水性等理化性質(zhì)進(jìn)行分析，結(jié)果表明，分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)，其原子數(shù)量也多；而就所預(yù)測(cè)的不穩(wěn)定系數(shù)而言，上述33個(gè)分泌蛋白中除GI號(hào)為750988325、750993542、751000725、751001439、750997409、751007593、751001188、751001671、750992882、751004198、751005465、750993505、750996377、750999030等14個(gè)蛋白質(zhì)為穩(wěn)定性蛋白外，其他均為不穩(wěn)定性蛋白；就上述33個(gè)分泌蛋白的疏水性而言，14個(gè)蛋白質(zhì)總平均親水性小于0，屬于親水性蛋白，所占比例為42.42%(表2)。

表1 不同酸堿度分泌蛋白的基本信息

表2 部分分泌蛋白的理化性質(zhì)

續(xù)表2 部分分泌蛋白的理化性質(zhì)

3 結(jié)論與討論

前人對(duì)植物病原卵菌、真菌甚至細(xì)菌的分泌蛋白均進(jìn)行了相關(guān)預(yù)測(cè)以及分析，其中卵菌包括致病疫霉[18]、樟疫霉[19]，真菌包括釀酒酵母[20]、黃孢原毛平革菌[21]、禾谷鐮刀菌[22]、粗糙脈孢菌[23]、稻瘟菌[24]、大麗輪枝菌[25]、米曲霉[26]、禾谷炭疽菌[27]等，細(xì)菌包括根癌土壤桿菌[28]、結(jié)核分枝桿菌[29]等。對(duì)于分泌蛋白在上述卵菌、真菌、細(xì)菌等不同種類植物病原菌中發(fā)揮的功能則不盡相同，所具有的作用機(jī)制也不盡相同。同時(shí)，就諸如褐環(huán)乳牛肝菌等對(duì)于寄主植物具有益生關(guān)系的外生菌根菌而言，其內(nèi)分泌蛋白與上述植物病原菌中分泌蛋白所發(fā)揮的功能是否相同，作用機(jī)制相同與否均有待于進(jìn)一步研究。

云南松(Pinusyunnanensis)作為我國(guó)西南地區(qū)尤其是云南省境內(nèi)重要的建群樹(shù)種以及荒山綠化造林先鋒樹(shù)種，其面積、蓄積量分別占云南省林地面積、蓄積量的29.2%和15.8%[30]。云南松林下外生菌根真菌資源十分豐富，現(xiàn)有27科39屬211種可與其形成外生菌根[31]，包括紅菇屬(Russula)、牛肝菌屬(Boletus)、乳菇屬(Lactarius)、乳牛肝菌屬(Suillus)等。然而，由于諸多外生菌根菌全基因組序列尚未公布，其分泌蛋白數(shù)量和種類也不清楚，對(duì)于分泌蛋白的功能研究報(bào)道更是非常少見(jiàn)。因此，關(guān)于外生菌根菌分泌蛋白參與供給磷元素的作用機(jī)制尚不夠明晰，以及不同外生菌根菌供給磷元素的作用通路是否一致也不得而知。

外生菌根真菌往往喜歡偏酸性的環(huán)境，最適pH值一般在4.0～6.0[32]，同時(shí)，外生菌根菌還可以產(chǎn)生有機(jī)酸來(lái)改變環(huán)境的酸堿度[33]。本研究所獲得的327個(gè)分泌蛋白，其中2/3分泌蛋白的理論等電點(diǎn)均小于6.0，外生菌根菌分泌蛋白的理論等電點(diǎn)范圍與環(huán)境中最適酸堿度范圍幾乎一致，這有待于進(jìn)一步驗(yàn)證。

本研究基于前期所獲得的S.luteus中327個(gè)分泌蛋白序列，對(duì)其理化性質(zhì)進(jìn)行分析，同時(shí)，根據(jù)預(yù)測(cè)的理論等電點(diǎn)進(jìn)行分類，明確69.72%的分泌蛋白屬于酸性蛋白質(zhì)。另外，通過(guò)隨機(jī)選擇10%的分泌蛋白進(jìn)行理論性質(zhì)分析，明確上述分泌蛋白的分子質(zhì)量、分子式、原子數(shù)量、半衰期、不穩(wěn)定性系數(shù)、脂肪族氨基酸指數(shù)、總平均親水性等基本性質(zhì)。該研究為進(jìn)一步解析褐環(huán)乳牛肝菌中分泌蛋白影響針葉植物生長(zhǎng)的分子機(jī)制提供了理論基礎(chǔ)，也為外生菌根菌分泌蛋白發(fā)揮的功能解析提供了理論指導(dǎo)。

[1] 李敏.褐環(huán)乳牛肝菌(Suillusluteus(L.：Fr.) Gray)發(fā)酵生物學(xué)的研究[D].呼和浩特:內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué),2007.

[2] 李敏,閆偉,堵國(guó)成,等.褐環(huán)乳牛肝菌發(fā)酵條件的優(yōu)化[J].食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào),2009,28(3):390-396.

[3] 劉楊.褐環(huán)粘蓋牛肝菌培養(yǎng)條件的研究[D].呼和浩特:內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué),2007.

[4] 鐘帥,閆偉,張瑞霞.褐環(huán)乳牛肝菌對(duì)輕基質(zhì)營(yíng)養(yǎng)包樟子松和油松苗的促生效應(yīng)[J].林業(yè)科技開(kāi)發(fā),2014,28(2):122-124.

[5] 宋小雙,鄧勛,尹大川,等.褐環(huán)乳牛肝菌N94與綠木霉T43復(fù)合接種下紅皮云杉苗木的生理響應(yīng)[J].吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2015,37(1):37-42,46.

[6] 劉強(qiáng),閆偉.過(guò)量鈉鹽、堿性pH值對(duì)褐環(huán)乳牛肝菌生長(zhǎng)的影響[J].內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2009,30(2):52-56.

[7] 段慧.平菇汁對(duì)褐環(huán)粘蓋牛肝菌生長(zhǎng)影響的研究[D].呼和浩特:內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué),2010.

[8] 劉淑清,陳有君,包健,等.pH條件和接種量對(duì)褐環(huán)乳牛肝菌生長(zhǎng)的影響[J].內(nèi)蒙古科技與經(jīng)濟(jì),2008(22):29-31,42.

[9] 孫琳.pH對(duì)褐環(huán)粘蓋牛肝菌三羧酸循環(huán)中關(guān)鍵酶活性的影響[D].呼和浩特:內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué),2014.

[10] 王明慧.pH對(duì)褐環(huán)粘蓋牛肝菌草酸代謝幾個(gè)關(guān)鍵酶活性的影響[D].呼和浩特:內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué),2013.

[11] 張茹琴,唐明,張峰峰,等.酸堿度和重金屬對(duì)3種外生菌根真菌生長(zhǎng)的影響[J].北京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2008,30(2):113-118.

[12] 陳連慶,裴致達(dá).馬尾松優(yōu)良菌根真菌(S.l)液培條件的研究[J].林業(yè)科學(xué)研究,1998,11(4):104-107.

[13] 蔡楠楠.褐環(huán)粘蓋牛肝菌菌絲與培養(yǎng)基pH的相互作用[D].呼和浩特:內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué),2011.

[14] 姚慶智,閆偉.11株外生菌根真菌菌株純培養(yǎng)營(yíng)養(yǎng)生理特性的研究[J].內(nèi)蒙古大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2005,36(2):186-191.

[15] 應(yīng)國(guó)華,呂明亮,陳奕良,等.褐環(huán)粘蓋牛肝菌生態(tài)學(xué)特性研究[J].林業(yè)科學(xué)研究,2005,18(3):267-273.

[16] 劉潤(rùn)進(jìn),李曉林.叢枝菌根及其應(yīng)用[M].北京:科學(xué)出版社,2000.

[17] Gasteiger E,Hoogland C,Gattiker A,etal.Protein identification and analysis tools on the ExPASy server[C]//Walker J M.The proteomics protocols handbook.Totawa:Humana Press,2005:571-607.

[18] 周曉罡,侯思名,陳鐸文,等.馬鈴薯晚疫病菌全基因組分泌蛋白的初步分析[J].遺傳,2011,33(7):125-133.

[19] 韓長(zhǎng)志.全基因組預(yù)測(cè)樟疫霉的候選效應(yīng)分子[J].南京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2015,39(2):69-74.

[20] 楊靜,李成云,王云月,等.釀酒酵母分泌蛋白組的計(jì)算機(jī)分析[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué),2005,38(3):516-522.

[21] Wymelenberg A V,Sabat G,Martinez D,etal.ThePhanerochaetechrysosporiumsecretome:Database predictions and initial mass spectrometry peptide identifications in cellulose-grown medium[J].Journal of Biotechnology,2005,118(1):17-34.

[22] 于欽亮,馬莉,劉林,等.禾谷鐮刀菌基因組中含寄主靶向模體分泌蛋白功能的初步分析[J].生物技術(shù)通報(bào),2008(1):160-165,180.

[23] 周曉罡,李成云,趙之偉,等.粗糙脈孢菌基因組分泌蛋白的初步分析[J].遺傳,2006,28(2):200-207.

[24] 陳繼圣,鄭士琴,鄭武,等.全基因組預(yù)測(cè)稻瘟菌的分泌蛋白[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué),2006,39(12):2474-2482.

[25] 田李,陳捷胤,陳相永,等.大麗輪枝菌(VerticilliumdahliaeVdLs.17)分泌組預(yù)測(cè)及分析[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué),2011,44(15):3142-3153.

[26] 任楠,李俊星,沈徐凱.米曲霉分泌組的預(yù)測(cè)及分析[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2010,38(25):13622-13625.

[27] 韓長(zhǎng)志.全基因組預(yù)測(cè)禾谷炭疽菌的分泌蛋白[J].生物技術(shù),2014,24(2):36-41.

[28] 范成明,李成云,趙明富,等.根癌土壤桿菌C58 Ce-reon中分泌蛋白信號(hào)肽分析[J].微生物學(xué)報(bào),2005,45(4):561-566.

[29] Gomez M,Johnson S,Gennaro M L.Identification of secreted proteins ofMycobacteriumtuberculosisby a bioinformatic approach[J].Infection and Immunity,2000,68(4):2323-2327.

[30] 金振洲,彭鑒.云南松[M].昆明:云南科技出版社,2004.

[31] 于富強(qiáng),劉培貴.云南松林野生食用菌物種多樣性及保護(hù)對(duì)策[J].生物多樣性,2005,13(1):58-69.

[32] 溫祝桂,陳亞華.中國(guó)外生菌根真菌研究進(jìn)展[J].生物技術(shù)通報(bào),2013(2):22-30.

[33] Ahonen-Jonnarth U,Van Hees P A W,Lundstr?m U S,etal.Organic acids produced by mycorrhizalPinussylvestrisexposed to elevated aluminium and heavy metal concentrations[J].New Phytologist,2000,146(3):557-567.

Analysis on Physicochemical Property of Secreted Proteins fromSuillusluteus

HAN Changzhi,REN Xuemin

(College of Forestry,Southwest Forestry University/The Key Laboratory of Forest Disaster Warning and Control of Yunnan Province,Kunming 650224,China)

To identify the function of secreted protein fromSuillusluteus,the physicochemical property of secreted protein were analyzed based on 327 secreted protein sequences.The results showed that the isoelectric point of 69.7% secreted proteins were less than 6.0,belonged to acidic protein,while 10 percent of these proteins were obtained by the random number producing software,and the physicochemical property of 33 secreted proteins including 23 acidic proteins,4 neutral proteins and 6 basic proteins with the different theoretical isoelectric point were analyzed including the molecular weight,atomic number,half-life,the instability factor,aliphatic amino acid index,total average hydrophilicity properties,and 14 proteins of which were stable protein,14 proteins were hydrophilic protein.

Suillusluteus; secreted protein; theoretical isoelectric point(PI); physicochemical property

2015-07-20

云南省高校優(yōu)勢(shì)特色重點(diǎn)學(xué)科(生態(tài)學(xué))建設(shè)項(xiàng)目;中國(guó)科學(xué)院微生物研究所真菌學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放基金項(xiàng)目；西南林業(yè)大學(xué)大學(xué)生科技創(chuàng)新基金項(xiàng)目(C15037);云南省高校林下生物資源保護(hù)及利用科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目(2014015)

韓長(zhǎng)志(1981-)，男，河北石家莊人，講師，博士，主要從事經(jīng)濟(jì)林木病害生物防治與真菌分子生物學(xué)的研究。 E-mail:hanchangzhi2010@163.com。任雪敏為并列第一作者。

Q939.96

A

1004-3268(2016)03-0125-05