王溪橋，左佳妮，尤 佳，李春雷，王軍平

(甘肅出入境檢驗(yàn)檢疫局 綜合技術(shù)中心，甘肅 蘭州730010)

不同藥劑處理種子對(duì)番茄細(xì)菌性潰瘍病菌的除害效果

王溪橋，左佳妮，尤 佳，李春雷，王軍平*

(甘肅出入境檢驗(yàn)檢疫局 綜合技術(shù)中心，甘肅 蘭州730010)

利用不同劑量的磷酸三鈉、次氯酸鈣、蘇納米、甲醛、高錳酸鉀、鹽酸和二氯異氰尿酸鈉溶液對(duì)帶番茄細(xì)菌性潰瘍病菌的番茄種子進(jìn)行不同時(shí)間的處理，旨在篩選出各藥劑除菌的最適處理劑量和最宜處理時(shí)間。借助傳統(tǒng)PCR方法檢測(cè)藥劑處理對(duì)人工接菌種子的除害效果，同時(shí)采用活菌培養(yǎng)法測(cè)定各藥劑對(duì)番茄細(xì)菌性潰瘍病菌的抑制作用。結(jié)果顯示，各藥劑最適宜的除害處理?xiàng)l件為：8%磷酸三鈉處理30 min，1%次氯酸鈣處理20 min，0.4%蘇納米處理20 min，甲醛100倍液處理20 min，pH值1.5的鹽酸處理10 min，1%高錳酸鉀處理30 min，二氯異氰尿酸鈉700倍液處理40 min。應(yīng)用紙床法進(jìn)行發(fā)芽試驗(yàn)，檢測(cè)各藥劑處理對(duì)番茄種子發(fā)芽的影響，結(jié)果表明，各藥劑處理對(duì)番茄種子的發(fā)芽率沒有明顯不利影響。綜合7種藥劑的特點(diǎn)、最適除害處理?xiàng)l件和對(duì)發(fā)芽率的影響，二氯異氰尿酸鈉為最理想的種子除害處理藥劑。

番茄細(xì)菌性潰瘍?。?番茄種子； 除害處理； 發(fā)芽率

番茄細(xì)菌性潰瘍病是由密執(zhí)安棒桿菌密執(zhí)安亞種(Clavibactermichiganensissubsp.michiganensis，CMM)引起的種傳維管束病害。該病自1910年在美國報(bào)道以來，在日本、印度、伊朗、中國、澳大利亞、新西蘭等57個(gè)國家都有發(fā)生，罹病植株發(fā)生萎蔫、死亡造成缺株斷壟，成熟期則造成果實(shí)皺縮、畸形，嚴(yán)重影響番茄的質(zhì)量和產(chǎn)量。CMM主要隨種子遠(yuǎn)距離傳播，在田間或溫室主要通過水、傷口等途徑近距離擴(kuò)散，已被歐洲及地中海植物保護(hù)組織(EPPO)、日本、俄羅斯、芬蘭、法國、德國、中國等國家及組織列為檢疫對(duì)象[1-2]。

目前，對(duì)番茄細(xì)菌性病害的防治主要采取種植抗病品種、種子處理和農(nóng)業(yè)防病措施，并輔之以化學(xué)防治。對(duì)種子進(jìn)行處理是防治細(xì)菌性病害最直接、有效的措施之一，國內(nèi)外對(duì)此已經(jīng)做了很多研究[3-11]。孔祥義等[12]用不同劑量的蘇納米處理帶細(xì)菌性果斑病菌的甜瓜種子，發(fā)現(xiàn)300倍液對(duì)果斑病有明顯的防治作用，另外發(fā)現(xiàn)，經(jīng)甲醛100倍液浸泡過的甜瓜種子，發(fā)芽、鮮質(zhì)量、根長、過氧化氫酶(CAT)活性、丙二醛(MDA)含量、發(fā)病率、植株長勢(shì)、嫁接后表現(xiàn)等各方面指標(biāo)均良好。宋順華等[13]用3%、5%和8%的鹽酸處理西瓜種子以防治西瓜細(xì)菌性果腐病。對(duì)于帶有番茄細(xì)菌性潰瘍病菌的種子，王寶石等[14]用5%鹽酸浸種5～10 h，王潔等[15]用1%的高錳酸鉀浸泡15～20 min，Blood[16]用6%的乙酸和1.2%的乳酸處理，F(xiàn)atami等[17]用0.6 mol/L的鹽酸浸泡5 h然后浸泡在0.25%或0.50%的酸化乙酸銅中20 min，均可以完全除害。

關(guān)于帶番茄細(xì)菌性潰瘍病菌的番茄種子的處理前人未做系統(tǒng)性研究，且對(duì)種子處理劑處理?xiàng)l件的研究只是挑取單個(gè)時(shí)間或劑量進(jìn)行，篩選得到的處理?xiàng)l件未必是最佳條件。為此，本研究根據(jù)實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)選取7種常用種子處理劑，設(shè)計(jì)適宜的時(shí)間梯度和劑量梯度進(jìn)行試驗(yàn)，以期篩選出每種藥劑實(shí)現(xiàn)完全除害的最佳劑量和時(shí)間，以避免高劑量、長時(shí)間處理對(duì)種子造成的損害以及藥劑的浪費(fèi)。而且本研究挑選的藥劑種類全，其除害機(jī)制有所不同，可以為以后復(fù)合種子處理劑的研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 供試材料及試劑

番茄種子：由酒泉東方種子有限公司贈(zèng)予，經(jīng)檢測(cè)為健康無菌種子。

供試菌株：番茄細(xì)菌性潰瘍病菌由甘肅省出入境檢驗(yàn)檢疫局綜合技術(shù)中心外繁種子實(shí)驗(yàn)室分離保存。

種子處理藥劑：磷酸三鈉、次氯酸鈣、高錳酸鉀購自天津塘沽鵬達(dá)化工廠，二氯異氰尿酸鈉購自常州市潤洋化工有限公司,鹽酸和甲醛購自天津市北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠，蘇納米(Tsunami 100)購自先正達(dá)公司。

營養(yǎng)瓊脂(NA)購自北京陸橋生物技術(shù)有限責(zé)任公司；PCR及電泳相關(guān)試劑，如Loading buffer、dNTP、rTaq、RNase free ddH2O等均購自寶生物工程(大連)有限公司；新型植物基因組DNA提取試劑盒購自北京天根生化科技有限公司；引物PSA-8/PSA-R (5′- TTGGTCAATTCTGTCTCCCTTC -3′和5′-TACTGAGATGTTTCACTTCCCC -3′)，由寶生物工程(大連)有限公司合成，特異性擴(kuò)增片段長度為270 bp。

1.2 模擬帶菌種子制備

將保存于-80 ℃的番茄細(xì)菌性潰瘍病菌活化后接種到250 mL液體NA培養(yǎng)基中，28 ℃、180 r/min條件下培養(yǎng)24 h，測(cè)定菌液在600 nm下的吸光值，并進(jìn)行平板菌落計(jì)數(shù)。檢測(cè)菌液濃度達(dá)到1×108cfu/mL時(shí)，數(shù)取10 000粒番茄種子浸泡在菌液中，28 ℃、180 r/min培養(yǎng)24 h后，將種子從菌液中濾出，陰干。

1.3 種子帶菌檢測(cè)

取帶菌種子100粒，浸泡在0.8%無菌生理鹽水中，加入0.1%的吐溫-20，4 ℃下靜置過夜后在搖床上180 r/min振蕩30 min。用紗布將種子濾除，10 000 r/min離心30 min后取沉淀，將沉淀用0.8%無菌生理鹽水懸浮,1 000 r/min離心3 min,取上清，將上清液12 000 r/min離心5 min后取沉淀，用無菌生理鹽水懸浮所得沉淀即為待測(cè)菌液，用于平板測(cè)定和PCR檢測(cè)。

平板測(cè)定：取10 μL所得菌液，梯度稀釋為10-1、10-2、10-3，均勻涂布在NA平板上，置于28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4～5 d。待培養(yǎng)平板長出菌落，用無菌水沖洗各平板，將所得溶液95 ℃水浴裂解處理后，作為模板直接進(jìn)行PCR。

PCR檢測(cè)：提取所剩菌液的基因組DNA，用特異性引物擴(kuò)增目標(biāo)片段。反應(yīng)體系：10×Buffer(Mg2+plus)2.5 μL、2.5 mmol/L dNTP Mixture 2 μL、PSA-8 1 μL、PSA-R 1 μL、5 U/L rTaq 0.5 μL、ddH2O 10 μL、菌液DNA 8 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃ 4 min；95 ℃ 30 s，63 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 7 min。

帶菌種子經(jīng)檢測(cè)合格后備用。

1.4 藥劑處理

根據(jù)生產(chǎn)中及前人研究所用的藥劑處理時(shí)間及劑量，設(shè)計(jì)本試驗(yàn)的藥劑處理劑量和時(shí)間，如表1所示。將帶菌的番茄種子按表1所述進(jìn)行浸泡振蕩處理，處理完成后用無菌水沖洗3～4次，將清洗后的種子陰干備測(cè)。每個(gè)處理選用200粒種子，其中100粒用于細(xì)菌檢測(cè)(方法同1.3)，100粒用于發(fā)芽試驗(yàn)(見1.5)，3次重復(fù)。同時(shí)，將帶菌種子用無菌水處理作為陽性對(duì)照，健康種子用無菌水處理作為陰性對(duì)照。

表1 藥劑處理劑量及時(shí)間

藥劑處理劑量處理時(shí)間/min磷酸三鈉8%20、30、4010%20、30、4012%20、30、40次氯酸鈣1%10、20、301.5%10、20、302%10、20、30蘇納米0.4%10、20、300.6%10、20、300.8%10、20、301.2%10、20、30甲醛100倍液20、30、40150倍液20、30、40200倍液20、30、40鹽酸pH值1.510、20、30pH值2.010、20、30pH值2.510、20、30高錳酸鉀1%20、30、401.5%20、30、402%20、30、40二氯異氰尿酸鈉400倍液30、40、50500倍液30、40、50600倍液10、20、30、40、50700倍液30、40、50

1.5 種子發(fā)芽率測(cè)定

在培養(yǎng)皿里放置2層發(fā)芽紙，充分吸濕，瀝去多余水分，將100粒種子直接置于濕潤的發(fā)芽紙上，蓋好培養(yǎng)皿，放入人工氣候箱進(jìn)行發(fā)芽試驗(yàn)，溫度25 ℃、相對(duì)濕度80%、7：00—18:00光照。在第5天時(shí)初次計(jì)數(shù)，將可疑的、損傷的、畸形的或不均衡的幼苗留到末次計(jì)數(shù)，將嚴(yán)重腐爛的幼苗或發(fā)霉的種子從培養(yǎng)皿中除去。第14天時(shí)末次計(jì)數(shù)，數(shù)取發(fā)育正常的幼苗，將發(fā)育不正常、硬實(shí)種子和死種子除去，計(jì)算種子發(fā)芽率。

2 結(jié)果與分析

2.1 模擬種子帶菌檢測(cè)

活化的CMM培養(yǎng)24 h后，測(cè)定其OD600為0.698，平板菌落計(jì)數(shù)測(cè)得活菌數(shù)為5.1×109cfu/mL，將健康的種子浸泡在此菌液中培養(yǎng)24 h后濾出陰干檢測(cè)其帶菌情況。PCR檢測(cè)和平板檢測(cè)結(jié)果分別如圖1、2所示，270 bp的目標(biāo)條帶清晰可見，與陽性對(duì)照條帶亮度相當(dāng)，說明帶菌種子制備成功，可以滿足后續(xù)試驗(yàn)的要求。

M為DNA Marker; A、B、C分別為3個(gè)重復(fù); CMM+為陽性對(duì)照; CMM-為陰性對(duì)照。下同

圖2 模擬帶菌平板檢測(cè)

2.2 藥劑處理后種子帶菌檢測(cè)

7種藥劑對(duì)帶CMM番茄種子的處理結(jié)果如表2所示。10%和12%磷酸三鈉的所有處理PCR檢測(cè)和平板檢測(cè)結(jié)果均為陰性；8%磷酸三鈉處理40 min后也未檢測(cè)到CMM，處理20 min和30 min后PCR檢測(cè)到CMM，而處理20 min后的平板檢測(cè)結(jié)果為陽性，處理30 min后的平板檢測(cè)結(jié)果為陰性，由此可推斷出磷酸三鈉的最佳處理?xiàng)l件為 8%磷酸三鈉處理30 min 。

采用次氯酸鈣處理時(shí)，1.5%和2%所有處理PCR檢測(cè)和平板檢測(cè)結(jié)果均為陰性；1%處理20 min和30 min后也未檢出CMM，而處理10 min后PCR和平板測(cè)定均檢出CMM，由此可知用次氯酸鈣處理帶CMM的番茄種子的最佳劑量為1%，最佳時(shí)間為20 min。

用蘇納米處理時(shí)，0.6%、0.8%和1.2%所有處理PCR和平板上均未檢測(cè)到CMM；經(jīng)0.4%蘇納米處理20 min和30 min后也未檢出CMM，而處理10 min的帶菌種子被檢測(cè)出有CMM活菌的存在，所以用蘇納米處理帶CMM番茄種子的最適劑量為0.4%，最適時(shí)間為20 min。

用甲醛處理帶CMM的番茄種子，100倍液分別處理20 min、30 min和40 min后，均未檢測(cè)出CMM活菌，而150倍液和200倍液分別處理20 min、30 min和40 min后，PCR和平板上均檢測(cè)出CMM，所以甲醛處理帶CMM的番茄種子時(shí)最佳劑量為稀釋100倍，最佳時(shí)間為20 min。

分別用pH值為2.5、2.0和1.5的鹽酸處理感染CMM的番茄種子，結(jié)果顯示，用pH值為2.5、2.0的鹽酸分別處理帶菌種子10 min、20 min、30 min后，均檢測(cè)到CMM活菌，同時(shí)經(jīng)pH值為1.5的鹽酸處理20 min和30 min后，PCR和平板上也均檢測(cè)到CMM。而經(jīng)pH值為1.5的鹽酸處理10 min后未檢測(cè)到CMM活菌。由此可知，鹽酸的最佳除害條件為pH值1.5，處理10 min。

經(jīng)1.5%和2% 高錳酸鉀分別處理20 min、30 min、40 min后，PCR和平板上均未檢出CMM，經(jīng)1% 高錳酸鉀處理30 min和40 min后也未檢出CMM。而經(jīng)1% 高錳酸鉀處理20 min后檢測(cè)出有CMM活菌的存在。所以高錳酸鉀處理帶CMM種子的最適劑量為1%，最適時(shí)間為30 min。

采用二氯異氰尿酸鈉處理時(shí)，400、500、600倍液分別處理30 min、40 min和50 min以及600倍液處理10 min、20 min后均未檢出CMM， 700倍液處理40 min和50 min后PCR和平板上也未檢出CMM，而700倍液處理30 min后發(fā)現(xiàn)有CMM活菌的存在，所以二氯異氰尿酸鈉處理帶CMM番茄種子的最佳條件為稀釋700倍后處理40 min。

表2 藥劑對(duì)番茄種子上CMM的處理結(jié)果

藥劑處理劑量菌液DNAPCR檢測(cè)10min20min30min40min50min平板測(cè)定10min20min30min40min50min磷酸三鈉8%++-+--10%------12%------次氯酸鈣1%+--+--1.5%------2%------蘇納米0.4%+--+--0.6%------0.8%------1.2%------甲醛100倍液------150倍液++++++200倍液++++++鹽酸pH值1.5-++-++pH值2.0++++++pH值2.5++++++高錳酸鉀1%+--+--1.5%------2%------二氯異氰尿酸鈉400倍液------500倍液------600倍液----------700倍液+--+--

注：“+”表示檢出CMM，“-”表示未檢出CMM。

2.3 藥劑處理對(duì)番茄種子發(fā)芽率的影響

將用藥劑處理后的番茄種子擺在培養(yǎng)皿中的紙床上進(jìn)行發(fā)芽試驗(yàn)，結(jié)果如圖3—5所示。帶CMM的種子發(fā)芽率為87%，健康種子發(fā)芽率為97%，兩者間有顯著差異；各藥劑處理的種子發(fā)芽率介于93%～97%，其中經(jīng)蘇納米、鹽酸、高錳酸鉀處理的種子發(fā)芽率稍低，為93%～95%，但與健康種子相比均沒有顯著性差異，與帶CMM種子相比，各藥劑處理發(fā)芽率均提高，且存在顯著性差異。說明各藥劑處理對(duì)番茄種子的發(fā)芽率沒有明顯不利影響。

圖3 次氯酸鈣、蘇納米、鹽酸處理后番茄種子的發(fā)芽率

圖4 磷酸三鈉、高錳酸鉀、甲醛處理后番茄種子的發(fā)芽率

圖5 二氯異氰尿酸鈉處理后番茄種子的發(fā)芽率

3 結(jié)論與討論

番茄細(xì)菌性潰瘍病是一種典型的種傳病害[18]。王寶石等[14]研究表明，CMM病菌主要附著在種子內(nèi)外，因此對(duì)番茄種子進(jìn)行除害是防治番茄細(xì)菌性潰瘍病發(fā)生的有效方法之一。本研究選用7種藥劑進(jìn)行處理，以篩選不同藥劑消除番茄細(xì)菌性潰瘍病菌的最適處理時(shí)間和最適處理劑量。磷酸三鈉在水中完全分解為磷酸氫二鈉和氫氧化鈉，屬于堿類消毒劑，它可以使病菌細(xì)胞膜破裂，沉淀菌體蛋白[19]。用8%磷酸三鈉處理帶菌種子30 min，PCR檢測(cè)結(jié)果為陽性但平板檢測(cè)結(jié)果為陰性，由此可推斷,帶菌種子經(jīng)過該處理已沒有活菌存在，PCR檢測(cè)到的應(yīng)為CMM殘?bào)w，所以8% 磷酸三鈉處理帶菌種子30 min就可以達(dá)到完全除害效果。次氯酸鈣和二氯異氰尿酸鈉屬于含氯消毒劑，它們主要是通過氧化還原反應(yīng)影響細(xì)菌酶的活性，或因化學(xué)結(jié)構(gòu)與代謝物相似，競(jìng)爭或非競(jìng)爭性地同酶結(jié)合而抑制酶的活性，引起菌體死亡[19]，次氯酸鈣除去全部CMM病菌的最適條件為1%劑量處理20 min，二氯異氰尿酸鈉除害的最佳條件為700倍液處理40 min。蘇納米、鹽酸和高錳酸鉀屬于氧化劑類消毒劑，消毒原理和含氯消毒劑相似[19]，通常用0.6%的蘇納米對(duì)種子進(jìn)行除害處理，可能由于菌種差異，蘇納米對(duì)帶CMM番茄種子徹底除害的條件是0.4%劑量處理20 min，另外鹽酸的最佳處理?xiàng)l件為pH值1.5處理10 min，高錳酸鉀的最佳處理?xiàng)l件為1%劑量處理30 min。甲醛作為一種常用醛類種子處理劑，主要依靠醛基,作用于菌體蛋白(包括酶)的醛基、羥基、羧基、氨基,使其烷基化,引起蛋白質(zhì)變性、凝固,造成微生物死亡，對(duì)于帶CMM的番茄種子，甲醛100倍液處理20 min就可完全除害。綜上所述，雖然7種藥劑均有很好的除害效果，但磷酸三鈉達(dá)到除害效果需要很大劑量，從經(jīng)濟(jì)角度考慮略有劣勢(shì)；蘇納米、鹽酸和高錳酸鉀氧化性很強(qiáng)，對(duì)工作人員的安全和健康有一定威脅；二氯異氰尿酸鈉是高效、廣譜、安全的消毒劑，達(dá)到除害效果所需的劑量很低，而且低毒，對(duì)種子發(fā)芽率沒有不利影響。綜合7種藥劑的特點(diǎn)、最適除害條件和對(duì)發(fā)芽率的影響，二氯異氰尿酸鈉為最理想的種子除害處理藥劑。

發(fā)芽率是衡量種子質(zhì)量的重要指標(biāo)之一，很多種子處理劑會(huì)嚴(yán)重影響種子的發(fā)芽率和種子質(zhì)量。趙秋菊等[20]發(fā)現(xiàn)，用8%的鹽酸處理后的西瓜種子外表出現(xiàn)深裂紋，8%的雙氧水處理后西瓜種子會(huì)出現(xiàn)種子爆裂的情況。雖然本研究中種子處理后未發(fā)生以上情況，但是藥劑高劑量、長時(shí)間處理后，種子發(fā)芽率略有下降。如何進(jìn)一步提高藥劑處理后的種子發(fā)芽率，以及藥劑處理對(duì)種子發(fā)芽后植株發(fā)育的影響還有待進(jìn)一步研究。

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Harm-elimination Effects of Seed Treatment with Different Agents on Bacterial Canker of Tomato

WANG Xiqiao,ZUO Jiani,YOU Jia,LI Chunlei,WANG Junping*

(Technology Center of Gansu Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau,Lanzhou 730010,China)

The tomato seeds infected with bacterial canker were treated by different concentrations of trisodium phosphate,calcium hypochlorite,tsunami,formaldehyde,potassium permanganate,hydrochloric acid,and sodium dichloroisocyanurate solutions for different time,to screen out the optimum concentration and optimum processing time of each agent.The conventional PCR method was used to detect the effectiveness of harm-elimination treatment to inoculated seeds,and plate culture method was used to detect the inhibition effect of agents on the pathogen of bacterial canker.The results showed that the most appropriate treatment conditions for each agent were as follows:8% trisodium phosphate treated seeds for 30 min,1% calcium hypochlorite treated seeds for 20 min,0.4% tsunami treated seeds for 20 min,100-fold dilution of formaldehyde treated seeds for 20 min,hydrochloric acid with pH value of 1.5 treated seeds for 10 min,1% potassium permanganate treated seeds for 30 min,700-fold dilution of sodium dichloroisocyanurate treated seeds for 40 min.The germination rate of treated seeds was tested by paper bed,and the results showed that the agents had no significant influence on tomato seed germination.Integrating their own characteristics of seven agents,the optimum treatment conditions and the impact on germination rate,sodium dichloroisocyanurate is the best agent to eliminate the pathogen of tomato bacterial canker by seed treatment.

bacterial canker of tomato; tomato seeds; harm-elimination treatment; germination rate

2015-07-27

國家質(zhì)檢總局質(zhì)檢公益性行業(yè)科研專項(xiàng)(201310071)

王溪橋(1984-)，男，甘肅蘭州人，工程師，主要從事有害微生物鑒定工作。E-mail:brooksu37@163.com

*通訊作者：王軍平(1976-)，男，甘肅正寧人，高級(jí)農(nóng)藝師，主要從事植物檢疫工作。E-mail:wangjp465@sohu.com

S436.412.1;S351.1

A

1004-3268(2016)03-0092-06