楊立均，趙鈺澤，王 靜，周 祁，楊金淼，劉衛(wèi)群*

(1.河南省煙草公司 駐馬店市公司，河南 駐馬店463000； 2.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河南 鄭州 450002； 3.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 煙草學(xué)院，河南 鄭州 450002)

煙草對(duì)煙草花葉病毒耐受性的早期防御反應(yīng)

楊立均1，趙鈺澤2，王 靜3，周 祁2，楊金淼2，劉衛(wèi)群2*

(1.河南省煙草公司 駐馬店市公司，河南 駐馬店463000； 2.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河南 鄭州 450002； 3.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 煙草學(xué)院，河南 鄭州 450002)

為深入研究植物對(duì)煙草花葉病毒(TMV)產(chǎn)生耐受性的機(jī)制，以烤煙栽培種NC89和其自然變異株系培育的品種豫煙8號(hào)(具有TMV耐受性)為材料，人工接種TMV后，檢測(cè)其生理生化指標(biāo)變化及抗性基因表達(dá)水平，并進(jìn)行組織切片比較分析。結(jié)果顯示，豫煙8號(hào)接種TMV 24 h葉片中的超氧陰離子含量、過(guò)氧化物酶(POD)活性、苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性、過(guò)氧化氫酶(CAT)活性都明顯高于NC89，而丙二醛(MDA)含量低于NC89，N基因表達(dá)水平高于NC89。接種TMV 9 d的煙草組織切片顯示：相對(duì)豫煙8號(hào)，NC89葉片表皮細(xì)胞破裂，柵欄組織細(xì)胞間排列疏松，海綿組織細(xì)胞間隙較大。表明豫煙8號(hào)對(duì)TMV的耐受性體現(xiàn)在早期的快速應(yīng)答反應(yīng)。

煙草花葉病毒； 耐受性； 早期響應(yīng)； 活性氧； 防御酶；N基因

煙草花葉病毒(tobacco mosaic virus,TMV)是寄主范圍非常廣泛、傳播能力強(qiáng)、危害嚴(yán)重的侵染性病原[1]，其防治相當(dāng)困難。目前主要靠加強(qiáng)田間栽培管理和化學(xué)藥劑進(jìn)行防治[2]，但收效甚微，并且隨著病毒抗藥性的增加和人們對(duì)生態(tài)環(huán)境的重視，化學(xué)藥劑防治的發(fā)展受到限制?？蒲泄ぷ髡咴诨蚬こ滩呗院蜕镌崔r(nóng)藥防治等方面進(jìn)行了大量的研究[3]，但至今實(shí)際應(yīng)用效果不佳。由于病毒的增殖完全依賴(lài)寄主細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)和能源，要達(dá)到既不傷害寄主細(xì)胞，又能防止病毒的侵染或增殖，就必須解析病毒侵染后寄主的早期響應(yīng)及其產(chǎn)生耐受性的調(diào)節(jié)機(jī)制，從而有針對(duì)性地設(shè)計(jì)防治措施。

抗病和感病植物的重要區(qū)別在于寄主植物對(duì)病原侵入識(shí)別的時(shí)間性和激發(fā)寄主植物防衛(wèi)機(jī)制的速度和有效性，感病植物由于防衛(wèi)反應(yīng)慢且信號(hào)弱，最終導(dǎo)致病原的蔓延而使植物受到嚴(yán)重?fù)p害[4]。由病原菌侵染而引發(fā)防御反應(yīng)的啟動(dòng)首先是產(chǎn)生大量的活性氧以及蛋白質(zhì)的磷酸化，繼而防衛(wèi)相關(guān)基因表達(dá)、發(fā)生過(guò)敏反應(yīng)(hypersensitive response，HR)，最后產(chǎn)生系統(tǒng)獲得性抗性(systemic acquired resis-tance，SAR)等[5-6]。為深入研究植物對(duì)TMV 產(chǎn)生耐受性的分子機(jī)制，采用從TMV高發(fā)病的NC89煙田中篩選的無(wú)病健壯變異單株，經(jīng)過(guò)選育幾代而成的豫煙8號(hào)品種為對(duì)照材料，通過(guò)人工接種TMV，比較兩品種對(duì)TMV侵染的早期響應(yīng)及隨后抗性基因表達(dá)水平，結(jié)合組織切片分析其對(duì)TMV耐受性的差異，為后期研究TMV侵染引起的植物代謝變化及植物的調(diào)節(jié)機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試劑和材料

TRIZOL試劑購(gòu)自Invitrogen生物技術(shù)有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量試劑盒均購(gòu)自大連寶生物工程有限公司(Takara)；其他常規(guī)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。供試材料豫煙8號(hào)和NC89由駐馬店煙草公司提供。

1.2 病毒源提取、接種與取樣

病毒源提?。喝MV毒源新鮮病葉，清水沖洗干凈后用消毒濾紙吸干并去除主脈。根據(jù)取樣質(zhì)量加入40倍體積的磷酸緩沖液(0.05 mol/L，pH值7.0)，研磨后配制成40倍的病毒汁液，離心取上清液[3]備用。

接種病毒：選取移栽期50 d左右、長(zhǎng)勢(shì)一致的豫煙8號(hào)與NC89煙株，選擇頂端新生葉下數(shù)第4片葉，表面均勻撒下石英砂，用棉簽蘸取等量病毒汁液輕輕摩擦，來(lái)回重復(fù)3次。對(duì)照采用磷酸緩沖液按同樣的方法進(jìn)行處理。接種完成1 h后清水噴洗葉面，以利于植株發(fā)病[7-8]。

1.3 葉片組織石蠟切片分析

組織切片制作參照《植物顯微技術(shù)》[9]。在DMBA450型MOTIC顯微鏡下觀察并拍照保存。

1.4 粗酶液提取及酶活性測(cè)定

過(guò)氧化物酶(POD)活性、苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性、過(guò)氧化氫酶(CAT)活性以及丙二醛(MDA)含量的測(cè)定參照《植物生理生化實(shí)驗(yàn)原理和技術(shù)》[10]中的方法操作。

1.6N基因的表達(dá)模式分析

（5）加強(qiáng)國(guó)際協(xié)作，引領(lǐng)人工智能規(guī)范的國(guó)際治理。人工智能發(fā)展關(guān)系未來(lái)人類(lèi)共同命運(yùn)，加快國(guó)際合作，共同制定發(fā)展規(guī)范是大勢(shì)所趨。除應(yīng)重視技術(shù)發(fā)展外，還應(yīng)加強(qiáng)與各國(guó)的合作，積極參與相關(guān)國(guó)際規(guī)范制定。當(dāng)前，國(guó)際社會(huì)普遍關(guān)注網(wǎng)絡(luò)安全和數(shù)據(jù)隱私，以及人工智能對(duì)社會(huì)倫理的影響，要主動(dòng)加強(qiáng)在產(chǎn)業(yè)、智庫(kù)、學(xué)者層面的溝通交流，主動(dòng)引領(lǐng)命題，提供中國(guó)經(jīng)驗(yàn)和中國(guó)解決方案。此外，中國(guó)的大市場(chǎng)為發(fā)展人工智能提供了很好平臺(tái)，在保障國(guó)家安全的前提下，積極創(chuàng)造條件，推動(dòng)國(guó)際合作，邊應(yīng)用、邊治理，推進(jìn)相關(guān)領(lǐng)域的國(guó)際立法。■

半定量分析和實(shí)時(shí)熒光定量PCR選用煙草Actin基因?yàn)閮?nèi)參基因，引物序列如下：上游引物為5′-GTTGGGCGTCCTCGTCA-3′，下游引物為5′-TGGGTCATCTTCTCCCTGTT-3′。N基因的特異性引物：上游引物為5′-ATGGGATTATTAGGCTTTCT-3′，下游引物為5′-AACCTCTGGTCCTTGTTTAT -3′，擴(kuò)增片段為152 bp?？俁NA提取參照TRIZOL試劑操作手冊(cè)進(jìn)行；cDNA第一鏈合成按照Takara公司的PrimeScriptTMRT Reagent Kit試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。實(shí)時(shí)熒光定量PCR在Biorad IQ5 熒光定量PCR儀上進(jìn)行，結(jié)果分析采用 2-ΔΔCT法，其中,CT是循環(huán)閾值，ΔCT是目的基因與看家基因CT值的差值，ΔΔCT是不同時(shí)間處理與對(duì)照ΔCT值的差值。

2 結(jié)果與分析

2.1 接種TMV后活性氧含量的變化

2.2 接種TMV后防御酶活性和MDA含量的變化

從圖2可以看出，接種TMV后兩品種葉片中POD和 CAT酶活變化趨勢(shì)相同，均在24 h達(dá)到峰值，隨后酶活性開(kāi)始下降，但豫煙8號(hào)葉片中的酶活性一直高于NC89。兩品種MDA含量也迅速增加至第3天達(dá)到峰值。但豫煙8號(hào)葉片中MDA含量明顯低于NC89，表明豫煙8號(hào)具有較強(qiáng)地維持細(xì)胞內(nèi)活性氧平衡的能力，其遭受TMV傷害的程度小。

PAL是苯丙烷類(lèi)代謝途徑中的關(guān)鍵酶和限速酶，其能催化L-苯丙氨酸直接脫氨產(chǎn)生反式肉桂酸，在木質(zhì)素和酚類(lèi)物質(zhì)的合成中起著重要的作用。因而苯丙烷類(lèi)的代謝與植物抗病性有著密切關(guān)系，PAL會(huì)參與植物的抗病反應(yīng)[13]。接種TMV后檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，兩品種煙株葉片內(nèi)的PAL活性均明顯升高，至12 h達(dá)到峰值后酶活緩慢下降，但豫煙8號(hào)中PAL酶活下降速度明顯低于NC89。以上結(jié)果進(jìn)一步表明，豫煙8號(hào)對(duì)TMV侵染具有一定的耐受性。

煙草N基因是一個(gè)單顯性抗TMV基因。為了進(jìn)一步檢測(cè)2個(gè)品種對(duì)TMV侵染的耐受性，采用半定量和定量PCR檢測(cè)N基因的表達(dá)水平，結(jié)果表明(圖3)，接種TMV后24 hN基因表達(dá)量最高，6 d表達(dá)量最低，豫煙8號(hào)整體表達(dá)水平比NC89高。

圖2 接種TMV后POD、PAL、CAT活性和MDA含量變化

A為熒光定量PCR結(jié)果； B為半定量RT-PCR結(jié)果，0～4依次為NC89接種后0 h、12 h、24 h、6 d、9 d，5～9依次為豫煙8號(hào)接種后0 h、12 h、24 h、6 d、9 d圖3 接種TMV后N基因表達(dá)變化

2.4 接種TMV后葉片組織結(jié)構(gòu)變化

接種病毒后9 d上部葉片開(kāi)始發(fā)病，下部葉少發(fā)病或不發(fā)病。心葉葉脈組織變淺綠色，對(duì)光看呈半透明狀，以后蔓延至整個(gè)葉片形成“花葉”的典型癥狀：葉片局部組織葉綠素褪色，形成濃綠、淺綠相間。進(jìn)行組織切片檢測(cè)(圖4)發(fā)現(xiàn)，TMV侵染9 d葉片組織結(jié)構(gòu)與對(duì)照相比變化較大；NC89與豫煙8號(hào)相比，其葉片表皮細(xì)胞破裂，柵欄組織細(xì)胞間排列疏松，海綿組織細(xì)胞間隙較大。未接種的兩品種間差異不明顯。

1為未接種TMV的NC89(100倍)； 2為未接種TMV的豫煙8號(hào)(100倍)；3為接種TMV 9 d后的NC89(100倍)； 4為接種TMV 9 d后的豫煙8號(hào)(100倍)圖4 接種TMV后葉片組織結(jié)構(gòu)變化

3 結(jié)論與討論

在植物與病原物漫長(zhǎng)的協(xié)同進(jìn)化過(guò)程中，植物逐步建立起多種多樣的防御機(jī)制去抵御病原侵染[23]，其中最主要的是通過(guò)表達(dá)與抗病相關(guān)的基因來(lái)激活細(xì)胞內(nèi)的防衛(wèi)系統(tǒng)。N基因是煙草TMV抗性的標(biāo)志基因[24]。本試驗(yàn)接種TMV后，豫煙8號(hào)N基因表達(dá)水平均高于NC89，從分子水平初步說(shuō)明豫煙8號(hào)比NC89抗TMV。由于植物的抗病機(jī)制是一個(gè)復(fù)雜的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)過(guò)程，抗病性與體內(nèi)相關(guān)基因在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)調(diào)控及轉(zhuǎn)錄后蛋白質(zhì)翻譯加工水平的改變有密切的聯(lián)系[25]。功能基因組學(xué)的發(fā)展，尤其是轉(zhuǎn)錄組、蛋白質(zhì)組的研究，在探討基因組在特定時(shí)期轉(zhuǎn)錄水平上的表達(dá)豐度及差異表達(dá)情況、大規(guī)模分析基因的表達(dá)模式等方面起著重要的作用，將有助于進(jìn)一步深入揭示豫煙8號(hào)比NC89具有更強(qiáng)抗病能力的分子遺傳基礎(chǔ)。

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Early Defensive Reaction of Flue-cured Tobacco Tolerant to TMV

YANG Lijun1,ZHAO Yuze2,WANG Jing3,ZHOU Qi2,YANG Jinmiao2,LIU Weiqun2*

(1.Zhumadian Branch of Henan Province Tobacco Company,Zhumadian 463000,China; 2.College of Life Science,Henan Agricultural University,Zhengzhou 450002,China; 3.College of Tobacco Science,Henan Agricultural University,Zhengzhou 450002,China)

To further investigate the mechanism for tobacco mosaic virus(TMV) tolerance in plant,the physiological and biochemical indexes of flue-cured varieties NC89 and Yuyan 8,which was the natural variant cultivar from NC89 and acquired the tolerance to TMV,were detected after inoculation of TMV.The results showed that the content of superoxide anion,the enzyme activities of peroxidase(POD),phenylalanine ammonia lyase(PAL) and catalase(CAT) in Yuyan 8 were obviously higher than NC89,but the content of malondialdehyde (MDA) was lower than NC89 at 24 hours after inoculation with TMV.The expression level ofNgene in Yuyan 8 was higher than NC89.The tissue sections at 9 days post inoculation with TMV displayed that epidermal cells ruptured,the cell arrange of palisade tissue loosened,the porosity of spongy tissue increased in NC89 compared to Yuyan 8.The results suggested that the rapid response to TMV at early stage was the base for tolerance of Yuyan 8 to TMV.

TMV; tolerance; early response; reactive oxygen species; defense enzymes;Ngene

2015-08-19

駐馬店市煙草公司科技計(jì)劃項(xiàng)目

楊立均(1968-)，男，河南羅山人，農(nóng)藝師，碩士，主要從事煙草生產(chǎn)和管理工作。E-mail：zmdylj@163.com

*通訊作者：劉衛(wèi)群(1956-)，女，河北臨城人，教授，博士，主要從事植物逆境分子生物學(xué)研究。 E-mail：liuweiqun2004@126.com

S435.72

A

1004-3268(2016)03-0082-05