吳金海，周玉堂，謝伶俐，張學(xué)昆，許本波*

(1．長江大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，湖北 荊州 434025； 2.孝感市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，湖北 孝感 432000；3．中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 油料作物研究所，湖北 武漢432600)

甘藍型油菜濕害相關(guān)基因BnLDH-1的克隆和表達分析

吳金海1，周玉堂2，謝伶俐1，張學(xué)昆3，許本波1*

(1．長江大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，湖北 荊州 434025； 2.孝感市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，湖北 孝感 432000；3．中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 油料作物研究所，湖北 武漢432600)

采用RACE技術(shù)從中雙9號中克隆了甘藍型油菜BnLDH-1基因全長cDNA序列和基因組序列。BnLDH-1基因的DNA序列為1 432 bp，包含1個內(nèi)含子；cDNA序列全長1 319 bp，含有1個1 053 bp的ORF，其編碼蛋白含350個氨基酸。經(jīng)預(yù)測發(fā)現(xiàn)，BnLDH-1蛋白存在LDH-1保守結(jié)構(gòu)域。qRT-PCR結(jié)果表明，濕害誘導(dǎo)BnLDH-1表達，但在不同耐濕性甘藍型油菜品種中，BnLDH-1的誘導(dǎo)表達水平不同。相關(guān)分析表明，濕害脅迫后48 h的BnLDH-1表達量與12份測試的甘藍型油菜材料的耐濕指數(shù)呈顯著負相關(guān)，其相關(guān)系數(shù)為0.73。

甘藍型油菜； 克??； 表達； 乳酸脫氫酶； 耐濕

甘藍型油菜(BrassicanapusL.)是我國乃至世界上最重要的油料作物，其生產(chǎn)常受到濕害的脅迫。濕害造成土壤和大氣中CO2和O2交換困難，土壤缺氧，從而給植物生長帶來危害，造成植物落葉、生長受抑制，甚至造成植株死亡[1]，可導(dǎo)致油菜減產(chǎn)17.0%～42.4%[2]。

濕害過程中，由于O2在土壤中的溶解度和擴散系數(shù)降低而造成植物O2脅迫[3]。蛋白質(zhì)2維電泳分析結(jié)果表明，濕害造成玉米根部20多種蛋白質(zhì)的差異表達，這些蛋白質(zhì)參與糖的無氧和有氧代謝[4-5]。在O2脅迫條件下，植物啟動無氧代謝途徑有利于提高植物對環(huán)境的適應(yīng)能力，維持植物生長發(fā)育[6-7]。濕害過程中，一系列酶，包括乙醛脫氫酶(FDH，EC1.2.1.2)、乙醇脫氫酶(ADH，EC1.1.1.1)、乳酸脫氫酶(LDH，EC1.1.1.27) 和丙酮酸脫酸酶(PDC，EC4.1.1.1)被誘導(dǎo)表達[7-8]。研究表明，植物的耐濕性與植物濕害過程中腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)含量、ADH和PDC的誘導(dǎo)表達水平密切相關(guān)[9-10]。相同量的糖分子在無氧條件下分解產(chǎn)生的ATP量低于有氧條件，因此，植物必須加速進行糖酵解和糖代謝[11]。根據(jù)Davis-Roberts pH假說，植物對O2脅迫的第一反應(yīng)是產(chǎn)生大量的乳酸，降低細胞中pH值，激活PDC和ADH的轉(zhuǎn)錄，并抑制LDH的轉(zhuǎn)錄，啟動乙醇代謝途徑[12]。為研究LDH在甘藍型油菜耐濕中的作用，從甘藍型油菜中雙9號中克隆出BnLDH-1，利用qRT-PCR研究了BnLDH-1在不同耐濕性甘藍型油菜中的表達特征及與甘藍型油菜耐濕性指數(shù)的關(guān)系。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

根據(jù)田間淹水試驗結(jié)果，從4 000個材料中選取12個具有不同耐濕能力的甘藍型油菜品系作為試驗材料，包括中雙9號、H305、秦油8號、955、H04、H1020、PH36、滬油17、GH01、中雙6號、2021和中雙11號。

1.2 甘藍型油菜耐濕指數(shù)的計算

對于12份甘藍型油菜材料，分別取100粒發(fā)芽種子，在20 ℃條件下浸泡24 h，然后取出種子，用雙蒸水沖洗2次[13]，對照發(fā)芽種子不作20 ℃條件下浸泡24 h處理。將種子平鋪于9 cm 培養(yǎng)皿中，第7天，記錄平均萌發(fā)率、成苗率、幼苗根長，并計算耐濕指數(shù)。耐濕指數(shù)=(處理成苗率×處理幼苗根長)/ (對照成苗率×對照幼苗根長)[14]。在甘藍型油菜成熟期，計算單株的籽粒產(chǎn)量。

1.3 甘藍型油菜BnLDH-1基因的全長cDNA擴增及序列分析

利用CTAB法提取甘藍型油菜的DNA[15]和RNA[16]，利用RNase-free DNase I (TaKaRa)除去RNA中混有的微量DNA。按照SuperScript Ⅲ First-Strand Synthesis Super Mix(Invitrogen)說明書完成cDNA的合成。對來自擬南芥(Arabidopsisthaliana)(NM_117832)、玉米(Zeamays)(AY109690)等物種的LDH基因的核苷酸序列進行多重比對，設(shè)計甘藍型油菜BnLDH-1基因的3′和5′RACE一擴和巢式PCR擴增引物(表1)。其中，引物FBnLDH-31和FBnLDH-32與試劑盒3′RACE引物配對用于3′ cDNA 末端擴增，引物RBnLDH-51和RBnLDH-52與試劑盒5′RACE引物配對用于5′cDNA末端擴增，按照GeneRacer 試劑盒 (Invitrogen, USA)說明書分別進行甘藍型油菜BnLDH-1的3′及5′RACE擴增。擴增體系為50 μL:10×PCR Buffer 5 μL、25 mmol/L MgCl23 μL、10 mmol/L dNTP 1 μL、試劑盒引物1 μL、 RACE引物1 μL、cDNA 1 μL、Taq酶 (5 U/μL)0.5 μL、ddH2O 37.5 μL。PCR反應(yīng)程序為：94 ℃ 2 min；94 ℃ 1 min，52 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，30個循環(huán)；72 ℃ 10 min。

根據(jù)5′和3′末端測序結(jié)果，設(shè)計1對引物FBnLDH/RBnLDH(表1)用于擴增甘藍型油菜BnLDH-1全長cDNA及對應(yīng)的基因組序列。PCR產(chǎn)物經(jīng)過電泳、凝膠回收后連接到pMD18-T載體，交由北京三博生物有限工程測序。利用軟件Vector NTI Advance 9.0對測定序列進行分析，查找開放閱讀框(ORF)，翻譯成蛋白質(zhì)，并進行蛋白質(zhì)參數(shù)計算。利用BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)分析核酸、蛋白質(zhì)的同緣性。在EXPASY網(wǎng)站 (http://www.expasy.org and http://www.softberry.com/berry.phtml)進行蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和性質(zhì)分析。

表1 PCR引物名稱及序列

1.4 甘藍型油菜中BnLDH-1表達譜分析

將12份材料種植于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所試驗地，在花期進行淹水處理至地面積水10 cm，取淹水處理0、24、48 h的根系材料保存于-80 ℃，提取RNA，并反轉(zhuǎn)錄成cDNA。根據(jù)擬南芥actin基因序列設(shè)計甘藍型油菜actin基因擴增引物FACT/RACT(表2)，以actin基因為內(nèi)參基因，根據(jù)SYBR?PrimeScript?RT-PCR 試劑盒(TaKaRa)說明書，采用BnLDH-1基因qRT-PCR引物QFLDH/QRLDH檢測12份甘藍型油菜材料BnLDH-1基因轉(zhuǎn)錄水平。qRT-PCR在熒光定量PCR儀(iQ5，Bio-Rad，USA)中進行，反應(yīng)體系按照TaKaRa公司SYBR Premix ExTaq試劑盒的操作說明配制，總共25 μL：2×One Step SYBR?RT-PCR Buffer Ⅲ 12.5 μL、TaKaRa ExTaqHS(5 U/μL)0.5 μL、PrimeScript RT Enzyme Mix Ⅱ 0.5 μL、QFLDH(10 μmmol/L)0.5 μL、QRLDH(10 μmmol/L)0.5 μL、RNA 2.0 μL、無RNA酶的H2O 8.5 μL，反應(yīng)程序為：95 ℃ 30 s;95 ℃ 5 s,56 ℃ 30 s,72 ℃ 45 s，40個循環(huán)。每個反應(yīng)重復(fù)3次，并且以標準差小于0.25為選擇標準，數(shù)據(jù)分析采用iQ5 PCR 儀器附帶的數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)(iQ5 Optical System Software，Version 2.1) 進行。

2 結(jié)果與分析

2.1BnLDH-1全長cDNA序列的克隆及序列分析

分別以cDNA和基因組DNA為模板，利用引物FBnLDH/RBnLDH分別成功地擴增出1條約1.3 kb的亮帶和1條約1.4 kb的亮帶，將該基因命名為BnLDH-1。經(jīng)測序發(fā)現(xiàn)，其基因組DNA全長為1 432 bp，其遵循標準的內(nèi)含子剪接方式：GT…AG，只包含1個內(nèi)含子。其cDNA全長為1 319 bp，5′UTR長度為92 bp，ORF長度為1 053 bp，3′UTR長度為174 bp；另外，在polyA上游20 bp的序列ATAAA與已知的大多數(shù)的植物的加尾信號序列AATAAA在序列特征和位置上相似，因此它可能充當BnLDH-1基因的加尾信號(圖1)。

ATG和TAA用下劃線和粗體表示，內(nèi)含子用灰字體表示，N35—Q347的保守域用灰背景表示，加尾信號AATTAA用下劃線表示圖1 BnLDH-1的核酸序列及其編碼氨基酸序列

經(jīng)NCBI Blastn分析表明，BnLDH-1和來自十字花科的白菜(Brassicarapa)、甘藍(Brassicaoleracea)、山萮菜(Eutremasalsugineum)和琴葉擬南芥(Arabidopsislyrata)的LDH基因的同源性最高，分別為94.0%、78.2%、78.4%和74.3%，和其他一些植物的LDH基因的同源性也比較高。

對BnLDH-1的開放讀碼框進行翻譯，得到1個由350個氨基酸組成的37.52 ku的多肽鏈，其等電點為5.82。Blastp結(jié)果表明，BnLDH-1蛋白序列與許多已知的植物L(fēng)DH蛋白具有很高的相似性，與甘藍的LDH蛋白相似性最高，其與甘藍、擬南芥和山萮菜LDH蛋白的一致性/相似性分別為99.7%/98.6%、94.3%/90.7%和96.3%/91.5%，說明在十子花科LDH蛋白進化過程中，該蛋白序列非常保守。

多重比對和聚類分析結(jié)果表明，BnLDH-1蛋白和來自十字花科植物甘藍和白菜的LDH蛋白聚成1個亞類(圖2)。其中，BnLDH-1與甘藍LDH的遺傳距離最近，它們與同屬十字花科的擬南芥(Arabidopsisthaliana)、琴葉擬南芥、山萮蔡、薺菜(Capsellarubella)以及薺藍(Camelinasativa)的LDH遺傳距離也比較近，形成1個大類(圖2)。

各LDH蛋白的GenBank序列號分別為ALLDH:XP_002870113.1,AtLDH:AAM64829.1,CrLDH:XP_006284020.1,CsLDH:XP_010434693.1,BoLDH:XP_013595446.1,BrLDH:XP_009144619.1,EsLDH:XP_006414250.1,CasiLDH:ADM88555.1,VvLDH:XP_002274162.3,GaLDH:EPS59698.1,JcLDH:XP_012069951.1,CsiLDH:XP_006477218.1,GmLDH:XP_003549909.1,NtaLDH:AIL30517.1,NtLDH:XP_009602609.1,StLDH:XP_006355475.1,SiLDH:XP_004951206.1

圖2 BnLDH-1蛋白系統(tǒng)發(fā)育樹

NCBI保守域搜索結(jié)果表明，BnLDH-1蛋白的N11到Q347區(qū)域存在LDH-1保守結(jié)構(gòu)域。SignalP 3.0預(yù)測表明，BnLDH-1蛋白沒有信號肽；TargetP預(yù)測表明，BnLDH-1蛋白位于葉綠體、線粒體的可能性很小；PSORT預(yù)測表明，BnLDH-1蛋白可能定位于細胞質(zhì)中，結(jié)合BnLDH-1蛋白功能分析，BnLDH-1蛋白應(yīng)該位于細胞質(zhì)中；而TMpred預(yù)測表明，BnLDH-1蛋白具有5個強的跨膜結(jié)構(gòu)。

利用SOPMA軟件預(yù)測BnLDH-1二級結(jié)構(gòu)(圖3)發(fā)現(xiàn)，該蛋白的二級結(jié)構(gòu)含有36.57%的α螺旋、25.14%的延伸鏈、6.57%的β轉(zhuǎn)角和31.71%的隨機卷曲。BnLDH-1蛋白的中部有4個大型的α螺旋，同時在其尾部(C-末端)也有類似的2個大型α螺旋。在其頭部(N-末端)均有大量隨機卷曲，且不存在α螺旋；同時在其中部α螺旋與尾部α螺旋之間存在轉(zhuǎn)角與延伸鏈交錯的結(jié)構(gòu)。

h：α螺旋； e： 延伸鏈； t：β轉(zhuǎn)角； c： 隨機卷曲。線條從長變短分別表示h、e、t、c

2.2 12個甘藍型油菜材料的耐濕指數(shù)

由表2可知，12份甘藍型油菜材料的耐濕指數(shù)存在極顯著差異，中雙9號最大，為82.3，其次為H1020，GH01最小，為13.2，PH36次之;籽粒產(chǎn)量損失與之相反，即耐濕指數(shù)越大的材料，濕害處理后其產(chǎn)量損失越小，表明這些材料適合用于甘藍型油菜耐濕性分析。

2.3BnLDH-1在甘藍型油菜中的表達特征

由圖4可知，在濕害處理過程中，12份甘藍型油菜材料的BnLDH-1表達量存在明顯差異，但變化趨勢基本相同。在0～24 h的脅迫過程中，各材料的BnLDH-1表達量緩慢升高，但在24～48 h，BnLDH-1表達量迅速升高。在PH36和GH01這些耐濕指數(shù)比較低的材料中，BnLDH-1表達量的增加幅度明顯高于高耐濕指數(shù)材料(如中雙11號和中雙9號)(圖4)。相關(guān)分析表明，耐濕指數(shù)與濕害脅迫處理48 h的BnLDH-1表達量呈顯著負相關(guān)，其相關(guān)系數(shù)為0.73(圖5)。

表2 12個不同耐濕材料的耐濕指數(shù)和產(chǎn)量損失

注：同列數(shù)據(jù)后不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)。

圖4 不同濕害脅迫時間下BnLDH-1相對表達量變化

*表示相關(guān)性顯著(P<0.05)

3 結(jié)論與討論

水對植物生長具有重要作用，但缺水(干旱)或水分過多(濕害)都嚴重危害植物的生長發(fā)育。濕害通常造成氧脅迫，氧脅迫是植物遭受的一種最重要的非生物脅迫[17-18]。目前，已經(jīng)分離和鑒定了一些植物抗氧脅迫相關(guān)基因，并初步闡明了其抗逆機制[19]。在玉米的抗氧脅迫研究中發(fā)現(xiàn)，脅迫導(dǎo)致20多種蛋白質(zhì)的合成[20]，這些蛋白質(zhì)包括蔗糖合成酶、1,6-二磷酸果糖醛縮酶、PDC、LDH和ADH等[21-22]。ADH突變體不能合成ADH或者產(chǎn)生乙醇，但能產(chǎn)生LDH并造成pH值下降，因此該突變體對濕害脅迫非常敏感[3,23-24]。本研究發(fā)現(xiàn)，耐濕指數(shù)與濕害脅迫48 h時BnLDH-1表達量呈顯著負相關(guān)。這可能是由于BnLDH-1表達量迅速升高可以降低pH值，從而迅速啟動無氧代謝途徑，在一定程度上滿足植物生長發(fā)育的能量需求[12]，但過多的乳酸對植物細胞有害，因而造成耐濕性降低。根據(jù)相關(guān)報道，濕害過程中，通氣組織的形成，側(cè)根的發(fā)育，對提高植物的耐濕性具有重要作用[25-26]，其根本是提高植物的O2吸收和轉(zhuǎn)運能力。雖然不能利用抑制BnLDH-1基因表達提高植物耐濕性，但由于耐濕指數(shù)和濕害脅迫48 h時BnLDH-1的表達量呈顯著負相關(guān)，因此可以利用濕害脅迫48 h時BnLDH-1表達量的高低進行耐濕材料的快速篩選。

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Cloning and Expressional Characterization of Wet Damage Related GeneBnLDH-1 fromBrassicanapusL.

WU Jinhai1, ZHOU Yutang2, XIE Lingli1, ZHANG Xuekun3, XU Benbo1*

(1.College of Life Science,Yangtze University,Jingzhou 434025,China; 2.Xiaogan Academy of Agricultural Sciences,Xiaogan 432000,China; 3.Oil Crops Research Institute,Chinese Academy of Agricultural Sciences,Wuhan 432600,China)

TheBnLDH-1 gene cDNA and genomic sequences were cloned by the RACE from Zhongshuang No.9. The genomic sequence ofBnLDH-1 was 1 432 bp and contained one intron. The 1 319 bpBnLDH-1 cDNA had a 1 053 bp ORF which encoded a polypeptide of 350 amino acids. The predicted results in-dicated that the BnLDH-1 protein contained conserved LDH-1 domain. qRT-PCR results indicated thatBnLDH-1 transcription levels were induced by waterlogging, and theBnLDH-1 transcription level had significant difference among theBrassicanapusL. with different waterlogging tolerance after waterlogging treatment. Correlation analysis indicated thatBnLDH-1 transcription levels were significantly negatively correlated with waterlogging tolerance indices of 12BrassicanapusL. at 48 h after waterlogging treatment, and the correlation coefficient was 0.73.

BrassicanapusL.; cloning; expression; lactate dehydrogenase; waterlogging tolerance

2015-10-28

國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃(863計劃)項目(2011AA10A104)

吳金海(1978-)，男，湖北襄陽人，在讀碩士研究生，研究方向：植物生物技術(shù)。E-mail:1312813987@qq.com

*通訊作者：許本波(1977-)，男，湖北安陸人，副教授，博士，主要從事植物生物技術(shù)研究。 E-mail:benboxu@yangtzeu.edu.cn

S565.4；Q78

A

1004-3268(2016)03-0053-06