孔少元，呂紀(jì)濤，張冬冬，王世英

(河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河北 保定 071000)

小麥全蝕病菌拮抗菌BacillusmethylotrophicusZ-9菌株產(chǎn)芽孢條件優(yōu)化

孔少元，呂紀(jì)濤，張冬冬*，王世英*

(河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河北 保定 071000)

甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌(Bacillusmethylotrophicus) Z-9菌株對小麥全蝕病病原菌有顯著拮抗活性，以芽孢產(chǎn)率和活菌數(shù)為主要指標(biāo)，采用單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)對Z-9菌株搖瓶產(chǎn)芽孢條件進(jìn)行優(yōu)化，為其工業(yè)生產(chǎn)提供試驗(yàn)依據(jù)。通過單因素試驗(yàn)確定最佳碳源、氮源和無機(jī)鹽分別為玉米粉、黃豆餅粉和MnSO4·H2O、MgSO4·7H2O。通過正交試驗(yàn)確定最適培養(yǎng)基組分為玉米粉1.0%、黃豆餅粉2.0%、MnSO4·H2O 0.04%、MgSO4·7H2O 0.04%、Na2HPO4·2H2O 0.4%、NaH2PO4·2H2O 0.2%；最適發(fā)酵條件為：初始pH值7.5，250 mL三角瓶裝液量50 mL，37 ℃培養(yǎng)36 h。優(yōu)化后發(fā)酵液的芽孢數(shù)量為1.60×109cfu/mL，較優(yōu)化前提高了13.7倍，芽孢產(chǎn)率達(dá)到96.5%。

小麥全蝕病； 拮抗菌； 芽孢桿菌； 芽孢； 發(fā)酵條件； 優(yōu)化； 芽孢產(chǎn)率

小麥全蝕病是小麥生產(chǎn)上的毀滅性災(zāi)害之一，由禾頂囊殼小麥變種(Gaeumannomycesgraminisvar.tritic)引起。小麥發(fā)病后，分蘗減少，成穗率降低，千粒質(zhì)量下降，造成嚴(yán)重減產(chǎn)，甚至絕收[1-3]。目前，缺乏抗小麥全蝕病的品種，化學(xué)防治不僅成本高，還會(huì)污染環(huán)境，并使病原菌產(chǎn)生耐藥性[4]。輪作倒茬能降低發(fā)病率，但適用于大面積種植，有很大的局限性[5]。生物防治有很大優(yōu)勢，具有防治作用持久、產(chǎn)品無殘留等特點(diǎn)，有些微生物還有一定的促生長能力[6]。目前，國內(nèi)外關(guān)于小麥全蝕病微生物防治的研究主要集中在熒光假單胞桿菌(Pseudomonasfluorescens)[7]、解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)[8]、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtillis)[9]上。芽孢桿菌能夠產(chǎn)生抗逆、耐熱的芽孢，這有利于生防菌的生產(chǎn)、劑型加工及在環(huán)境中存活[10]，而且生產(chǎn)工藝相對簡單、成本較低。芽孢桿菌菌劑一般采用芽孢形式，因此產(chǎn)芽孢條件的優(yōu)化對工業(yè)制劑生產(chǎn)有著重要意義。秦艷等[11]通過對蠟樣芽孢桿菌發(fā)酵條件優(yōu)化研究，改變了它的生長參數(shù)，提高了生物量及芽孢產(chǎn)率。王振海等[12]通過對Bacillusvelezensis發(fā)酵條件的優(yōu)化，使活菌含量達(dá)2.33×1010cfu/mL。河北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院制藥工程系從小麥全蝕病發(fā)病地區(qū)土壤中篩選到1株甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌(Bacillusmethylotrophicus)Z-9，該菌株對小麥全蝕病病原菌有顯著拮抗活性，對小麥全蝕病的防治效果也很明顯[13]。本試驗(yàn)以芽孢產(chǎn)率和活菌數(shù)為主要指標(biāo)，通過單因素和正交試驗(yàn)對Z-9菌株進(jìn)行搖瓶產(chǎn)芽孢條件優(yōu)化，為其工業(yè)化生產(chǎn)提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 Z-9菌株由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院制藥工程系從小麥全蝕病發(fā)病地區(qū)土壤中分離，通過對該菌株的形態(tài)特征觀察、生理生化特性和16S rDNA序列分析，確定Z-9菌株為Bacillusmethylotrophicus，其對小麥全蝕病病原菌有很好的拮抗活性。

1.1.2 培養(yǎng)基 NA培養(yǎng)基：牛肉膏5.0 g、蛋白胨10.0 g、NaCl 5.0 g、瓊脂20.0 g、蒸餾水1 000 mL，pH值7.2～7.4。種子培養(yǎng)基：蛋白胨1.0%、葡萄糖1.0%、NaH2PO4·2H2O 0.2%、MgSO4·7H2O 0.05%，pH值7.2～7.4?；A(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖2.0%、蛋白胨1.0%、Na2HPO4·2H2O 0.4%、NaH2PO4·2H2O 0.2%、MgSO4·7H2O 0.05%、CaCl2·2H2O 0.02%，pH值自然。

1.2 種子液培養(yǎng)

配制種子培養(yǎng)基，250 mL三角瓶裝液量50 mL，121 ℃滅菌20 min。用接種針從Z-9菌株的NA斜面挑取少量的菌苔，接種于裝有50 mL種子培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中。37 ℃、200 r/min搖床培養(yǎng)12 h后備用。

1.3 產(chǎn)孢條件單因素試驗(yàn)

選取7種碳源(可溶性淀粉、乳糖、糊精、葡萄糖、玉米粉、甘露醇、蔗糖)、7種氮源(牛肉膏、硫酸銨、尿素、蛋白胨、酵母膏、黃豆餅粉、胰蛋白胨)及6種無機(jī)鹽(FeSO4、ZnSO4、CuSO4·5H2O、CaCl2、MnSO4·H2O、MgSO4·7H2O)，在基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，單因素改變碳源、氮源、無機(jī)鹽的種類，配制各種發(fā)酵培養(yǎng)基，將培養(yǎng)12 h的種子液以2.0%的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基(250 mL三角瓶裝液量50 mL)中，37 ℃、200 r/min搖床培養(yǎng)48 h后取樣檢測菌體生物量和芽孢產(chǎn)量，確定最佳碳源、氮源及無機(jī)鹽。

1.4 產(chǎn)孢條件正交試驗(yàn)

1.4.1 培養(yǎng)基組成正交試驗(yàn) 根據(jù)單因素試驗(yàn)中確定的最佳碳源、氮源和無機(jī)鹽，按照L9(34)正交試驗(yàn)表配制不同濃度的發(fā)酵培養(yǎng)基，在發(fā)酵終點(diǎn)測定菌體含量和芽孢數(shù)量，計(jì)算芽孢產(chǎn)率，正交試驗(yàn)的因素和水平設(shè)計(jì)見表1。綜合正交試驗(yàn)結(jié)果確定最佳組合，從而得出Z-9菌株的最佳培養(yǎng)基組成。

表1 培養(yǎng)基組成正交試驗(yàn)因素水平

1.4.2 培養(yǎng)條件正交試驗(yàn) 以最適碳源、氮源、無機(jī)鹽配制培養(yǎng)基，按照L9(34)正交試驗(yàn)表，研究pH值、溫度、裝液量及發(fā)酵時(shí)間對芽孢形成的影響，正交試驗(yàn)水平設(shè)計(jì)見表2。綜合正交試驗(yàn)結(jié)果確定最佳組合，從而得出Z-9菌株的最佳發(fā)酵工藝條件。

表2 培養(yǎng)條件正交試驗(yàn)因素水平

1.5 生物量和芽孢產(chǎn)量的檢測

生物量測定采用細(xì)菌計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。芽孢產(chǎn)率測定采用染色法，利用孔雀石綠初染和沙黃復(fù)染，在顯微鏡下觀察，芽孢為綠色，菌體為紅色。每處理選擇5個(gè)不同的視野，分別統(tǒng)計(jì)芽孢和菌體數(shù)量，芽孢產(chǎn)率即芽孢數(shù)與總菌數(shù)的比值。每處理重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)基單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 碳源對Z-9菌株發(fā)酵液活菌含量及芽孢產(chǎn)率的影響 分別加入2.0%的不同碳源到基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中，比較不同碳源對Z-9菌株發(fā)酵液活菌含量和芽孢產(chǎn)率的影響。結(jié)果(表3)表明，以玉米粉為碳源時(shí)，活菌含量和芽孢產(chǎn)率最高，活菌含量為2.7×108cfu/mL，芽孢產(chǎn)率為84.8%。因此玉米粉為最佳碳源。

表3 不同碳源對Z-9菌株活菌含量和芽孢產(chǎn)率的影響

2.1.2 氮源對Z-9菌株發(fā)酵液活菌含量及芽孢產(chǎn)率的影響 分別加入1.0%的不同氮源到已確定最佳碳源的基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基(玉米粉2.0%、Na2HPO40.4%、NaH2PO40.2%、MgSO4·7H2O 0.05%、CaCl2·2H2O 0.02%)中，比較不同氮源對Z-9菌株發(fā)酵液活菌含量和芽孢產(chǎn)率的影響，結(jié)果(表4)表明，黃豆餅粉為氮源時(shí)，活菌含量和芽孢產(chǎn)率最高，活菌含量為7.8×108cfu/mL，芽孢產(chǎn)率為86.6%。因此黃豆餅粉為最佳氮源。

表4 不同氮源對Z-9菌株活菌含量和芽孢產(chǎn)率的影響

2.1.3 無機(jī)鹽對Z-9菌株發(fā)酵液活菌含量及芽孢產(chǎn)率的影響 分別加入0.02%的不同無機(jī)鹽到已確定最佳碳源、氮源的基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基(玉米粉2.0%、黃豆餅粉1.0%、Na2HPO40.4%、NaH2PO40.2%)中，比較不同無機(jī)鹽對Z-9菌株搖瓶發(fā)酵液活菌含量和芽孢產(chǎn)率的影響。結(jié)果(表5)表明，無機(jī)鹽為MnSO4·H2O時(shí)，活菌含量和芽孢產(chǎn)率最高，活菌含量為11.2×108cfu/mL，芽孢產(chǎn)率為94.1%，MgSO4·7H2O次之。因此選取MnSO4·H2O和MgSO4·7H2O作為考察因子。

表5 不同無機(jī)鹽對Z-9菌株活菌含量和芽孢產(chǎn)率的影響

2.2 培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件正交試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 培養(yǎng)基組成正交試驗(yàn)結(jié)果 據(jù)各單因素試驗(yàn)確定的最適碳源、氮源、無機(jī)鹽，進(jìn)行L9(34)正交試驗(yàn)，結(jié)果見表6。由表6可知，培養(yǎng)基組分最優(yōu)組合為A1B2C2D2，即玉米粉1.0%、黃豆餅粉2.0%、MnSO4·H2O 0.04%、MgSO4·7H2O 0.04%。由R值可以看出，RB>RD>RA>RC，說明氮源和無機(jī)鹽Ⅱ?qū)ρ挎邤?shù)量影響較大。理論的最佳組合恰為試驗(yàn)中的2號組合，芽孢數(shù)量和芽孢產(chǎn)率在各組合中均最高，分別為13.92×108cfu/mL和92.8%。因此選用2號組合培養(yǎng)基：玉米粉1.0%、黃豆餅粉2.0%、MnSO4·H2O為0.04%、MgSO4·7H2O為0.04%、Na2HPO4·2H2O 0.4%、NaH2PO4·2H2O 0.2%。

2.2.2 培養(yǎng)條件正交試驗(yàn)結(jié)果 在確定了最佳培養(yǎng)基成分及濃度后，又對其發(fā)酵工藝參數(shù)進(jìn)行了正交設(shè)計(jì)，試驗(yàn)結(jié)果見表7。由表7可以看出，發(fā)酵條件最佳組合為A2B2C3D2，即發(fā)酵時(shí)間為36 h、250 mL三角瓶裝液量50 mL、pH值7.5、溫度37 ℃。R值大小為：RB>RC>RD>RA，說明裝液量和pH值對芽孢數(shù)量影響比較大。理論組合在試驗(yàn)中沒有出現(xiàn)，所以需要和5號組合進(jìn)行對比驗(yàn)證試驗(yàn)。驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果表明，理論組合芽孢數(shù)量為1.60×109cfu/mL，5號組合芽孢數(shù)量為1.43×109cfu/mL，理論組合比5號組合增加11.9%；芽孢產(chǎn)率達(dá)96.5%,比5號組合提高了1.3%。因此，確定最佳培養(yǎng)條件為發(fā)酵時(shí)間36 h、250 mL三角瓶裝液量50 mL、pH值7.5、溫度37 ℃。

表6 培養(yǎng)基組成正交試驗(yàn)結(jié)果

表7 培養(yǎng)條件正交試驗(yàn)結(jié)果

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)明確了小麥全蝕病菌拮抗菌株BacillusmethylotrophicusZ-9的最佳產(chǎn)芽孢條件，其中培養(yǎng)基組分為：玉米粉1.0%、黃豆餅粉2.0%、MnSO4·H2O為0.04%、MgSO4·7H2O為0.04%、Na2HPO4·2H2O 0.4%、NaH2PO4·2H2O 0.2%；培養(yǎng)條件為：初始pH值7.5，250 mL三角瓶裝液量50 mL，37 ℃培養(yǎng)36 h。優(yōu)化后芽孢數(shù)量為1.60×109cfu/mL，比優(yōu)化前(1.09×108cfu/mL)提高了13.7倍，芽孢產(chǎn)率從72.6%提高到96.5%，為進(jìn)一步的小試和中試奠定了基礎(chǔ)。

本試驗(yàn)優(yōu)化后最佳碳源、氮源分別為玉米粉、黃豆餅粉，這與張冬冬等[14]對棉花黃萎病生防芽孢桿菌Z-5菌株發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化的結(jié)果一致，這些不僅都是天然培養(yǎng)基，而且有利于工業(yè)生產(chǎn)成本的降低。無機(jī)鹽Mn2+、Mg2+能提高芽孢產(chǎn)率和活菌含量，明顯優(yōu)于其他金屬離子。其中Mn2+在皮層生物合成的相關(guān)酶活性和(或)基因表達(dá)中發(fā)揮作用，本研究結(jié)果與徐世榮等[15]所報(bào)道的在形成芽孢的培養(yǎng)基中添加Mn2+能使芽孢的得率提高一致。

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Conditions Optimization for Spore Production of Antagonistic Bacterium

BacillusmethylotrophicusZ-9 against Wheat Take-all Disease

KONG Shaoyuan,Lü Jitao,ZHANG Dongdong*,WANG Shiying*

(College of Life Science,Agriculture University of Hebei,Baoding 071000,China)

Significant antagonistic activity of strainBacillusmethylotrophicusZ-9 against wheat take-all disease was shown.In order to optimize spore production conditions of the strain Z-9,researches were done by single-factor tests and orthogonal tests with number of viable cells and spore production rate as indexes.The best carbon source,nitrogen source and inorganic salt were corn flour,soybean meal,and MnSO4·H2O,MgSO4·7H2O,respectively,by the single factor experiments.The optimum medium components were determined as corn flour 1.0%，soybean meal 2.0%,MnSO4·H2O 0.04%,MgSO4·7H2O 0.04%,Na2HPO4·2H2O 0.4%,NaH2PO4·2H2O 0.2%,and the optimum fermentation conditions were determined as initial pH value of 7.5,medium volume of 50 mL in 250 mL flask,cultivating at 37 ℃ for 36 h by the orthogonal experiments.The spore yield reached 1.60×109cfu/mL,which was improved by 13.7 times,compared to the result before optimization,and the spore production rate reached 96.5% under the optimum conditions.

wheat take-all disease; antagonistic bacterium;Bacillus; spore; fermentation conditions; optimization; spore production rate

2015-09-18

河北省科學(xué)技術(shù)研究與發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(11220313)

孔少元(1989-)，男，河北邢臺(tái)人，在讀碩士研究生，研究方向：農(nóng)業(yè)微生物學(xué)。E-mail:25038926@qq.com

*通訊作者：王世英(1963-)，男，河北安平人，教授，本科，主要從事農(nóng)牧微生物學(xué)研究。E-mail:wsy99999@126.com 張冬冬(1981-)，男，河北保定人，副教授，在讀博士研究生，主要從事植物土傳病害的生物防治研究。 E-mail:zhangdongcumt@163.com

S435.121;TQ920.6

A

1004-3268(2016)01-0088-04