張小華，劉向勇，卞偉華，徐巖艷，許 聰

(濱州醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院，山東 煙臺(tái) 264003)

酵母SOD1基因缺失突變體應(yīng)答真菌細(xì)胞壁抑制劑CFW的轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析

張小華，劉向勇*，卞偉華，徐巖艷，許 聰

(濱州醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院，山東 煙臺(tái) 264003)

以釀酒酵母為研究材料，采用酵母全基因組表達(dá)譜芯片，分析超氧化物歧化酶SOD1基因缺失(sod1Δ)對(duì)酵母細(xì)胞應(yīng)答真菌細(xì)胞壁抑制劑鈣熒光白(CFW)全基因組轉(zhuǎn)錄表達(dá)譜的影響，為揭示植物病原真菌細(xì)胞壁調(diào)控機(jī)制以及植物抗真菌基因工程改造提供新的理論基礎(chǔ)。結(jié)果表明：CFW (10 μg/mL) 處理1 h后，與野生型酵母細(xì)胞相比，sod1Δ酵母細(xì)胞中211個(gè)基因發(fā)生了顯著差異表達(dá)(97個(gè)基因表達(dá)上調(diào)、114個(gè)基因表達(dá)下調(diào))。隨機(jī)選取5個(gè)差異表達(dá)基因采用定量PCR驗(yàn)證，結(jié)果與芯片分析結(jié)果一致。差異表達(dá)基因功能主要涉及細(xì)胞壁、細(xì)胞代謝、蛋白質(zhì)合成、細(xì)胞防御以及大量功能未知蛋白。以上結(jié)果表明,SOD1基因缺失可顯著改變酵母細(xì)胞應(yīng)答真菌細(xì)胞壁抑制劑CFW脅迫的全基因組轉(zhuǎn)錄表達(dá)譜。

真菌細(xì)胞壁抑制劑； 鈣熒光白； 釀酒酵母； DNA芯片； 細(xì)胞壁; 超氧化物歧化酶

真菌是導(dǎo)致植物病害最重要的病原菌，已知的植物病原真菌有8 000種以上，可引起3萬余種植物病害，約占全部植物病害的80%以上。真菌病害對(duì)農(nóng)作物危害極大，可導(dǎo)致作物正常的組織和器官遭到破壞，引發(fā)作物表現(xiàn)出各種病態(tài)甚至死亡，此外,其傳播速度快、侵染范圍廣，從而造成大范圍農(nóng)作物減產(chǎn)降質(zhì)，給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來巨大損失[1-4]。深入開展真菌基礎(chǔ)生物學(xué)研究，對(duì)加快植物真菌病害防治研究，促進(jìn)農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)發(fā)展具有重要的基礎(chǔ)理論意義。

釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)是真菌酵母菌屬中的典型菌種，易于培養(yǎng)，遺傳背景清楚，分子遺傳操作體系完善，同時(shí)在細(xì)胞結(jié)構(gòu)(例如細(xì)胞壁)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、生化代謝途徑、基因調(diào)控等方面與已知植物病原真菌具有較高的同源性，為了解植物病原真菌相關(guān)的生物學(xué)機(jī)制提供了便捷的研究模式材料[5-6]。

細(xì)胞壁是真菌重要的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，在維持細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞物質(zhì)運(yùn)輸、細(xì)胞增殖、細(xì)胞防御等方面發(fā)揮重要作用。真菌細(xì)胞壁是抗真菌農(nóng)用抗生素的重要藥物作用靶點(diǎn)和植物抗真菌基因工程中理想的抗菌靶位。釀酒酵母細(xì)胞壁主要成分包括幾丁質(zhì)、葡聚糖、甘露糖蛋白等，它們之間相互交聯(lián)形成一種韌性結(jié)構(gòu)[7]。真菌細(xì)胞壁抑制劑鈣熒光白(Calcofluor white, CFW) 通過與酵母細(xì)胞壁中幾丁質(zhì)發(fā)生特異性結(jié)合，破壞細(xì)胞壁的正常組裝，產(chǎn)生細(xì)胞壁脅迫，抑制菌體正常生長[8-9]。SOD1基因編碼的銅鋅超氧化物歧化酶是酵母細(xì)胞中最重要的抗氧化酶，可把有害的超氧自由基轉(zhuǎn)化為過氧化氫和氧氣。前期研究發(fā)現(xiàn)，SOD1基因缺失(sod1Δ)導(dǎo)致酵母細(xì)胞對(duì)真菌細(xì)胞壁幾丁質(zhì)特異性結(jié)合抑制劑CFW的敏感性增加，提示真菌細(xì)胞壁對(duì)抑制劑的耐受性與細(xì)胞抗氧化能力改變相關(guān)[10]。本研究以釀酒酵母為研究材料，采用酵母全基因組表達(dá)譜芯片，研究SOD1基因缺失對(duì)酵母細(xì)胞應(yīng)答真菌細(xì)胞壁抑制劑CFW全基因組轉(zhuǎn)錄表達(dá)譜的影響，進(jìn)一步解析真菌細(xì)胞壁對(duì)抑制劑的耐受性與細(xì)胞抗氧化能力之間的關(guān)系，為全面揭示植物病原真菌細(xì)胞壁調(diào)控機(jī)制以及植物抗真菌基因工程改造提供新的理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試野生型釀酒酵母BY4741菌株(MATa his3Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0) 由日本酵母遺傳中心提供。釀酒酵母sod1Δ菌株(sod1::kanMX4) 購自Thermo Scientific (Waltham, MA)公司。

釀酒酵母常規(guī)培養(yǎng)采用YPD培養(yǎng)基：葡萄糖 20 g、蛋白胨10 g、酵母粉10 g，加蒸餾水至1 000 mL，分裝，pH值6.0～6.5, 115 ℃ 30 min滅菌。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 酵母CFW脅迫處理 接種釀酒酵母(BY4741 和sod1Δ) 單菌落至10 mL的YPD液體培養(yǎng)基中，30 ℃搖床培養(yǎng)過夜。離心收集過夜培養(yǎng)物，轉(zhuǎn)接至含有50 mL YPD液體培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，菌體起始含量為OD600=0.1。繼續(xù)培養(yǎng)至酵母細(xì)胞進(jìn)入對(duì)數(shù)生長期(OD600=0.6～0.7)，在培養(yǎng)物中添加33.4 μL質(zhì)量濃度為15 mg/mL 的CFW母液(至CFW終質(zhì)量濃度為10 μg/mL)，30 ℃搖床培養(yǎng)1 h，離心收集菌體。

1.2.2 酵母全基因組表達(dá)譜芯片分析 使用Trizol試劑(Invitrogen 公司，美國)提取釀酒酵母總RNA, 并通過NucleoSpin?RNA clean-up 試劑盒(Marcherey-nagel, 德國)純化。分別采用甲醛變性膠電泳和紫外分光光度計(jì)檢測總RNA完整性和濃度。采用Jingxin?cRNA amplification and labelling kit(博奧生物公司, 中國)進(jìn)行cDNA合成和標(biāo)記。芯片雜交使用7K Yeast Genome Array(博奧生物公司, 中國)，之后采用LuxScan 10K/A雙通道激光掃描儀(CapitalBio公司)進(jìn)行芯片掃描。采用GenePix Pro 4.0 圖像分析軟件(Axon Instruments公司，美國)對(duì)芯片圖像進(jìn)行分析，計(jì)算ratio值；芯片數(shù)據(jù)經(jīng)Lowess方法歸一化后，用T-test和以2倍差異(即ratio值大于等于2.0，小于等于0.5)標(biāo)準(zhǔn)來確定差異表達(dá)基因。采用MIPS Functional Catalogue Database(http://mips.helmholtz-muenchen.de/funcatDB/)[11]和SaccharomycesGenome Database(SGD, http://www.yeastgenome.org)對(duì)所選差異表達(dá)基因進(jìn)行功能聚類分析。

1.2.3 實(shí)時(shí)定量RT-PCR驗(yàn)證 酵母總RNA經(jīng)RNA free DNaseⅠ(寶生物公司，中國)處理后，采用MMLV reverse transcriptase (Promega, 美國)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以cDNA為模板，采用SYBR Green Ⅰ 熒光染料檢測法，在ABI PRISM7900 PCR儀(Applied Biosystems公司，美國)中進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增。以看家基因ACT1為內(nèi)參，PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 10 min；95 ℃ 10 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 15 s，共40個(gè)循環(huán)。相對(duì)表達(dá)變化倍數(shù)采用2-ΔΔCt法分析[12]。實(shí)時(shí)熒光定量PCR所用引物見表1。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR所用引物

2 結(jié)果與分析

2.1 酵母總RNA的提取

分別提取真菌細(xì)胞壁抑制劑CFW處理后野生型酵母菌株BY4741和sod1Δ菌株的總RNA，過柱純化后，甲醛變性膠電泳檢測完整性，如圖1顯示，28S rRNA和18S rRNA條帶清晰、明亮，濃度比接近1∶1，提示RNA 完整性良好，無明顯降解。紫外分光光度計(jì)檢測表明，CFW處理的野生型酵母菌株BY4741 總RNA OD260/OD280=1.92，sod1Δ菌株總RNA OD260/OD280=2.05, 質(zhì)量符合表達(dá)譜芯片分析要求。

2.2 野生型菌株與sod1Δ菌株在CFW脅迫下轉(zhuǎn)錄表達(dá)譜分析

基因芯片數(shù)據(jù)分析顯示，經(jīng)10 μg/mL CFW 處理1 h后，與野生型菌株相比，sod1Δ菌株全基因組

表達(dá)譜發(fā)生明顯改變，211個(gè)基因差異表達(dá)，其中，表達(dá)上調(diào)基因97個(gè)，下調(diào)基因114個(gè)(表2)。進(jìn)一步利用MIPS Functional Catalogue Database和SaccharomycesGenome Database對(duì)所選差異表達(dá)基因進(jìn)行功能聚類分析。

1：CFW處理后野生型酵母菌株BY4741總RNA;2:CFW處理后sod1Δ菌株總RNA

表2 CFW脅迫條件下sod1Δ菌株與野生型菌株差異表達(dá)基因統(tǒng)計(jì)

2.2.1 表達(dá)上調(diào)差異基因 如圖2所示，表達(dá)上調(diào)差異基因功能主要涉及細(xì)胞組件(22個(gè))、細(xì)胞防御(13個(gè))、細(xì)胞代謝(17個(gè))及功能未知蛋白(15個(gè))。細(xì)胞組件功能分類中9個(gè)基因與細(xì)胞壁相關(guān)，其中包括幾丁質(zhì)合成酶Ⅰ基因 (CHS1)、幾丁質(zhì)合成酶Ⅲ基因(CHS3)、幾丁質(zhì)合成酶Ⅲ激活因子基因(SKT5)、幾丁質(zhì)轉(zhuǎn)糖基酶基因(CRH1) 等細(xì)胞壁幾丁質(zhì)相關(guān)基因，細(xì)胞壁蛋白相關(guān)基因(PIR1、CCW14和PST1)，β-葡聚糖合成相關(guān)基因KRE6和KRE11。該結(jié)果表明，SOD1基因缺失可以影響酵母細(xì)胞應(yīng)答CFW脅迫中細(xì)胞壁相關(guān)基因的表達(dá)。

細(xì)胞防御功能分類中涉及已報(bào)道在多種脅迫條件下對(duì)細(xì)胞發(fā)揮保護(hù)作用的海藻糖合成基因(TPS3、TPS1)[13]、熱沖擊蛋白基因(HSP104)[14]和γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶基因(GSH1)[15]。以上基因上調(diào)表達(dá)，將有利于sod1Δ酵母細(xì)胞應(yīng)答CFW引發(fā)的細(xì)胞壁脅迫。

2.2.2 表達(dá)下調(diào)差異基因 如圖2所示，表達(dá)下調(diào)差異基因功能主要涉及細(xì)胞代謝(12個(gè))、蛋白質(zhì)命運(yùn)(11個(gè))、蛋白質(zhì)合成(19個(gè))及功能未知蛋白(29個(gè))。蛋白質(zhì)合成功能分類中包含大量核糖體相關(guān)基因：RPS31、MRPS5、RPS4A、RPS28B、MRPL50、RPP2A、RPS19A、RPS28A、MRPS16。核糖體基因表達(dá)的大規(guī)模下調(diào)，將有利于sod1Δ酵母細(xì)胞節(jié)約更多的生物質(zhì)和能量[16]，應(yīng)急表達(dá)抵抗CFW脅迫的相關(guān)蛋白質(zhì)，以適應(yīng)外界環(huán)境變化。

圖2 CFW脅迫條件下sod1Δ菌株與野生型菌株差異表達(dá)基因功能分類

2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證

隨機(jī)選取5個(gè)差異表達(dá)基因(ERV2、PAM18、PHA2、MSH5、UPC2)，以看家基因ACT1為內(nèi)參，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)芯片分析結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。如表3所示，實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果與芯片分析結(jié)果一致。

表3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證

3 結(jié)論與討論

真菌侵染性病害是引發(fā)農(nóng)作物減產(chǎn)降質(zhì)的重要因素之一，其防治相關(guān)的基礎(chǔ)和應(yīng)用研究一直備受關(guān)注。幾丁質(zhì)是真菌細(xì)胞壁的重要組分之一，由N-乙酰葡糖胺通過β-1, 4-糖苷鍵聚合而成，與其他細(xì)胞壁組分相互交聯(lián)，形成具有一定韌性的結(jié)構(gòu)，為細(xì)胞提供機(jī)械支撐和保護(hù)[17]。由于植物不含幾丁質(zhì)，所以其成為抗真菌農(nóng)用抗生素篩選開發(fā)和植物抗真菌基因工程中理想的抗菌靶位[18-19]。本研究通過酵母全基因組表達(dá)譜芯片研究發(fā)現(xiàn)，真菌細(xì)胞壁幾丁質(zhì)特異性結(jié)合抑制劑CFW處理(10 μg/mL，1 h)后，與野生型酵母細(xì)胞相比，sod1Δ酵母細(xì)胞中211個(gè)基因發(fā)生了顯著差異表達(dá)(97個(gè)基因表達(dá)上調(diào)、114個(gè)基因表達(dá)下調(diào))。隨機(jī)選取5個(gè)差異表達(dá)基因采用定量PCR驗(yàn)證，結(jié)果與芯片分析結(jié)果一致。差異表達(dá)基因功能主要涉及細(xì)胞壁、細(xì)胞代謝、蛋白質(zhì)合成、細(xì)胞防御以及大量功能未知蛋白。以上結(jié)果表明，SOD1基因缺失可顯著改變酵母細(xì)胞應(yīng)答真菌細(xì)胞壁抑制劑CFW脅迫的全基因組轉(zhuǎn)錄表達(dá)譜，為揭示植物病原真菌細(xì)胞壁調(diào)控機(jī)制以及植物抗真菌基因工程改造提供新的理論基礎(chǔ)。

此外，在所篩選的差異表達(dá)(上調(diào)/下調(diào))基因中，功能未知基因總數(shù)達(dá)到44個(gè)，占差異表達(dá)基因總數(shù)的21%，解析這些基因的功能，將為深入揭示真菌細(xì)胞壁調(diào)控機(jī)制提供重要幫助。

[1] 王孝坤，王春燕，謝成建，等.黃萎病菌致病及植物抗黃萎病分子機(jī)制研究進(jìn)展[J].河南農(nóng)業(yè)科學(xué),2014,43(1):1-6.

[2] 練啟仙，桑維鈞，楊茂發(fā).吳茱萸病害調(diào)查及病原菌鑒定[J].河南農(nóng)業(yè)科學(xué), 2012,41(8):115-117.

[3] 王宗華，魯國東，謝聯(lián)輝，等.對(duì)植物病原真菌群體遺傳研究范疇及其意義的認(rèn)識(shí)[J].植物病理學(xué)報(bào)，1998，8(1):5-9.

[4] 祁高富，楊斌，葉建仁.植物病原真菌毒素研究進(jìn)展[J].南京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2000,24(2):66-70.

[5] 吳敏，谷守芹，李坡，等.玉米大斑病菌轉(zhuǎn)錄因子StSte12的活性及其對(duì)酵母生長的功能互補(bǔ)分析[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，45(16):3281-3287.

[6] 彭靜靜.植物病原真菌中MAPK級(jí)聯(lián)通路研究進(jìn)展[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，42(9):11-15.

[7] Orlean P.Architecture and biosynthesis of theSaccharomycescerevisiaecell wall[J].Genetics,2012，192(3): 775-818.

[8] Ram A F,Klis F M.Identification of fungal cell wall mutants using susceptibility assays based on Calcofluor white and Congo red[J].Nature Protocols，2006，1:2253-2256.

[9] Meissner D，Odman-Naresh J，Vogelpohl I，etal.A novel role of the yeast CaaX protease Ste24 in chitin synthesis[J].Molecular Biology of the Cell,2010,21(14):2425-2433.

[10] Liu X，Zhang X，Zhang Z. Cu,Zn-superoxide dismutase is required for cell wall structure and for tolerance to cell wall-perturbing agents inSaccharomycescerevisiae[J]. FEBS Letters,2010，584(6):1245-1250.

[11] Mewes H W，Albermann K，Heumann K，etal.MIPS:A database for protein sequences, homology data and yeast genome information [J].Nucleic Acids Research,1997,25(1):28-30.

[12] Livak K J, Schmittgen T D.Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-ΔΔ Ctmethod [J].Methods,2001,25(4):402-408.

[13] Eleutherio E C，Araujo P S，Panek A D. Protective role of trehalose during heat stress inSaccharomycescerevisiae[J].Cryobiology,1993,30(6):591-596.

[14] Vogel J L，Parsell D A，Lindquist S.Heat-shock proteins Hsp104 and Hsp70 reactivate mRNA splicing after heat inactivation[J].Current Biololgy,1995，5(3):306-317.

[15] Dormer U H，Westwater J，Stephen D W，etal.Oxidant regulation of theSaccharomycescerevisiaeGSH1 gene[J].Biochim Biophys Acta,2002,1576(1/2):23-29.

[16] Gasch A P.The environmental stress response:A common yeast response to diverse environmental stresses[M]//Hohmann S，Mager P.Topics in current genetics:Yeast stress responses.New York:Springer-Verlag Press,2003:20-21.

[17] Lesage G，Bussey H.Cell wall assembly inSaccharomycescerevisiae[J].Microbiol Mol Biol Rev，2006，70(2):317-343.

[18] 單麗波，賈旭.幾丁質(zhì)酶及其在抗真菌病基因工程中的應(yīng)用[J].生物工程進(jìn)展，1998，18(3):37-40.

[19] 馬養(yǎng)民，趙潔，周雪寧.植物內(nèi)生真菌抗植物病原真菌活性物質(zhì)的研究[J].化學(xué)進(jìn)展，2010，22(2/3):440-448.

Genome-wide Transcriptome Analysis of YeastSOD1 Gene Deletion Mutant in Response to Calcofluor White Stress

ZHANG Xiaohua,LIU Xiangyong*,BIAN Weihua,XU Yanyan,XU Cong

(Department of Pharmacy,Binzhou Medical College,Yantai 264003,China)

This paper investigated the effect ofSOD1 gene deletion on the genome-wide transcriptional response to fungal cell wall-perturbing agent Calcofluor white(CFW) inSaccharomycescerevisiaeusing DNA microarray，to provide a new theoretical basis for revealing the regulatory mechanism of cell walls of plant pathogenic fungi and optimizing plant anti-fungal genetic engineering.The results showed that 211 genes (97 up-regulated genes and 114 down-regulated genes) were differentially expressed insod1Δ yeast cells compared with the wild type yeast cells after CFW treatment (10 μg/mL for 1 h).The microarray data were further confirmed by qPCR analysis,using five randomly selected,differentially expressed genes.The differentially expressed genes were mainly related to cell wall,cell metabolism,protein synthesis,cell defence,and included genes with unknown functions.Taken together,SOD1 deletion significantly affects the genome-wide transcriptional profile in response to the cell wall-perturing agent CFW in yeast.

fungal cell wall-perturbing agent; Calcofluor white;Saccharomycescerevisiae; DNA microarray; cell wall; SOD

2015-06-29

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31000039); 山東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(ZR2012CQ041)

張小華(1980- )，女，山東榮成人，講師，碩士，主要從事釀酒酵母生物脅迫反應(yīng)研究。 E-mail：xiaohua124@gmail.com

*通訊作者：劉向勇(1981-)，男，山東濱州人，副教授，博士，主要從事釀酒酵母分子遺傳學(xué)研究。 E-mail:liuxiangyong81@gmail.com

S432.4+4

A

1004-3268(2016)01-0076-04