張運峰

(唐山師范學(xué)院 生命科學(xué)系，河北 唐山063000)

碳源對StSte12基因調(diào)控玉米大斑病菌生長和分生孢子發(fā)育的影響

張運峰

(唐山師范學(xué)院 生命科學(xué)系，河北 唐山063000)

以葡萄糖、蔗糖、乳糖和可溶性淀粉為碳源分別培養(yǎng)玉米大斑病菌野生型和StSte12基因RNAi陽性轉(zhuǎn)化子，研究碳源對StSte12基因調(diào)控玉米大斑病菌菌絲生長和分生孢子發(fā)育的影響，為闡明StSte12基因的功能和病菌的致病機制奠定基礎(chǔ)。結(jié)果表明，StSte12基因?qū)τ衩状蟀卟【z生長和分生孢子發(fā)育均有重要的調(diào)控作用，StSte12基因的表達量下降后，菌絲的生長勢變?nèi)?，顏色變淺，生長速度顯著下降，產(chǎn)孢量顯著降低。4種供試碳源中，可溶性淀粉對StSte12基因調(diào)控菌絲生長和發(fā)育的影響最大，蔗糖最?。蝗樘菍tSte12基因調(diào)控分生孢子發(fā)育沒有顯著影響，而其他3種碳源的影響均達到顯著水平。

玉米大斑病菌；StSte12基因； 碳源； 菌絲生長； 分生孢子發(fā)育

玉米大斑病是由玉米大斑病菌(Setosphaeriaturcica)引起的玉米葉部病害，主要發(fā)生在氣候冷涼濕潤的地區(qū)，在嚴重流行年份減產(chǎn)可達50%以上[1]。StSte12基因(S.turcicaSte12)屬于Ste12-like基因，與釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、稻瘟病菌(Magnaporthegrisea)等真菌的Ste12-like基因有較高的同源性，其轉(zhuǎn)錄蛋白StSte12是Fus3/Kss1-homolog途徑(又稱Pathogenicity MAPK cascad)的主要轉(zhuǎn)錄因子，具有典型轉(zhuǎn)錄因子所特有的STE homeodomain 和ZnF_C2H2鋅指結(jié)構(gòu)；將StSte12基因在釀酒酵母ste12缺失突變體中表達時能夠恢復(fù)該酵母突變細胞缺失的生理特征[2]。近期的研究表明，StSte12基因在玉米大斑病菌中調(diào)控附著胞發(fā)育，是病菌致病力形成的關(guān)鍵因子之一[3]。但StSte12基因?qū)τ衩状蟀卟【L和孢子發(fā)育的調(diào)控作用，以及該調(diào)控作用是否受不同碳源的影響尚不明確。本研究擬以玉米大斑病菌StSte12基因的RNAi(RNA interference)陽性轉(zhuǎn)化子及其野生型菌株為試驗材料，分析蔗糖、葡萄糖、可溶性淀粉和乳糖4種碳源對菌絲生長、菌落形態(tài)和分生孢子發(fā)育的影響，闡明碳源對StSte12基因功能的影響，分析影響StSte12基因功能的可能營養(yǎng)物質(zhì)及其代謝途徑，為深入研究玉米大斑病菌StSte12轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控機制奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 玉米大斑病菌野生型菌株01-23(WT)和StSte12 RNAi陽性轉(zhuǎn)化子(StRNAi 3-6和StRNAi 9-10)，由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)真菌毒素與植物分子病理學(xué)實驗室保存。StRNAi 3-6和StRNAi 9-10的StSte12基因表達量分別為野生型菌株的38%和67%[2]。

1.1.2 基礎(chǔ)培養(yǎng)基 配方：土豆200 g、葡萄糖 20 g、瓊脂15 g、去離子水1 000 mL。

1.1.3 化學(xué)試劑 葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、乳糖等化學(xué)試劑均為國產(chǎn)化學(xué)純。

1.2 試驗設(shè)計

分別用等量的供試碳源代替基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的葡萄糖，研究不同碳源對玉米大斑病菌野生型菌株及StSte12 RNAi陽性轉(zhuǎn)化子(StRNAi)菌絲生長和孢子發(fā)育的影響，每個處理重復(fù)8次。供試培養(yǎng)基碳源為：葡糖糖、蔗糖、可溶性淀粉和乳糖。

1.3 試驗方法

將在PDA平板培養(yǎng)基上25 ℃條件下生長7 d的試驗菌株菌盤(直徑8 mm)接種于不同碳源培養(yǎng)基平板(直徑90 mm)的中心，25 ℃恒溫、黑暗條件下培養(yǎng)8 d，每天測量菌落直徑，以培養(yǎng)時間為橫坐標、菌落直徑為縱坐標繪制菌絲生長曲線，計算菌絲生長速率，菌絲生長速率(mm/d)=菌落直徑(mm)/培養(yǎng)時間(d)，取第4～8天菌絲生長速率的平均值作為各處理的平均菌絲生長速率(V)；以WT為對照，計算StSte12 RNAi陽性轉(zhuǎn)化子的菌絲生長抑制率(I)，I=(VWT-VStRNAi)/VWT×100%。觀察并記錄菌落形態(tài)和菌絲特征。收集培養(yǎng)8 d時的菌絲和分生孢子，顯微觀察菌絲和孢子形態(tài)，利用血球計數(shù)板統(tǒng)計分生孢子數(shù)量。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2013、SPSS統(tǒng)計軟件對試驗數(shù)據(jù)進行系統(tǒng)處理與分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 碳源對StSte12基因調(diào)控玉米大斑病菌菌絲生長速度的影響

由圖1可以看出，野生型菌株和StSte12 RNAi陽性轉(zhuǎn)化子在4種碳源培養(yǎng)基上均能生長，并且在8 d的培養(yǎng)時間內(nèi)，一定程度上菌落直徑隨培養(yǎng)時間呈線性增加(R2>0.99)，在4種碳源培養(yǎng)基上StSte12 RNAi陽性轉(zhuǎn)化子的生長速度均低于野生型菌株01-23(圖1)。以野生型菌株為對照，計算StSte12 RNAi陽性轉(zhuǎn)化子的菌絲生長抑制率(圖2)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，StSte12 RNAi陽性轉(zhuǎn)化子StRNAi 3-6的菌絲生長受抑制程度顯著高于StSte12 RNAi陽性轉(zhuǎn)化子StRNAi 9-10(P<0.05)，并且抑制程度受到碳源種類的顯著影響。可溶性淀粉對轉(zhuǎn)化子StRNAi 3-6的抑制率(31.4%)顯著高于其他3種碳源(平均26.5%)，而葡萄糖、乳糖和可溶性淀粉等3種碳源對轉(zhuǎn)化子StRNAi 9-10的抑制率(平均14.1%)極顯著高于蔗糖(1.5%)。以蔗糖為碳源時，StRNAi 9-10的菌絲生長速率與野生型菌株01-23沒有顯著差異(P>0.05)。以上試驗結(jié)果表明，StSte12基因的表達水平與菌絲生長速率有關(guān)，即StSte12基因調(diào)控著玉米大斑病菌菌絲的生長，但其調(diào)控作用受環(huán)境中的碳源種類影響，對于StSte12基因表達水平較低的轉(zhuǎn)化子StRNAi 3-6，不同碳源之間的影響差異顯著，而對于StSte12基因表達水平較高的轉(zhuǎn)化子StRNAi 9-10，不同碳源之間的影響差異極顯著。4種碳源中，總體上可溶性淀粉的影響最強，蔗糖的影響最弱。

A.葡萄糖； B.乳糖； C.蔗糖； D.可溶性淀粉圖1 玉米大斑病菌野生型菌株和StSte12 RNAi陽性轉(zhuǎn)化子的菌落生長曲線

A.葡萄糖, B.乳糖, C.蔗糖, D.可溶性淀粉；*表示P < 0.05，**表示P < 0.01圖2 碳源對StSte12基因調(diào)控玉米大斑病菌菌絲生長速度的影響

2.2 碳源對StSte12基因調(diào)控玉米大斑病菌菌落形態(tài)的影響

StSte12 RNAi陽性轉(zhuǎn)化子StRNAi 3-6的菌落形態(tài)與野生型菌株顯著不同，菌落顏色變淺，氣生菌絲減少，菌落平伏，菌絲生長勢減弱，在4種碳源培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)基本一致，受碳源種類的影響較??；StSte12 RNAi陽性轉(zhuǎn)化子StRNAi 9-10的菌落形態(tài)與野生型菌株基本一致，但菌落顏色受碳源種類的影響非常顯著，白色菌絲體的面積按葡萄糖、蔗糖、乳糖、可溶性淀粉的順序逐漸擴大(圖3)。以上試驗結(jié)果表明，StSte12對玉米大斑病菌的菌絲顏色、長勢和氣生菌絲數(shù)量有一定的調(diào)控作用，尤其對菌絲顏色的調(diào)控最明顯，隨著StSte12基因表達量的降低，菌絲顏色變淺，推測StSte12基因可能與菌絲的黑色素合成有關(guān)，StSte12基因表達量的降低會抑制菌絲黑色素的合成。StSte12基因表達量減少約1/3時對菌絲顏色的調(diào)控作用受碳源種類影響顯著，按葡萄糖、蔗糖、乳糖和可溶性淀粉的順序?qū)谏睾铣傻囊种谱饔弥饾u增強，但當StSte12基因表達量減少約2/3時對菌絲顏色的調(diào)控作用受碳源種類的影響較小。

圖3 碳源對StSte12基因調(diào)控玉米大斑病菌菌落形態(tài)的影響

2.3 碳源對StSte12基因調(diào)控玉米大斑病菌產(chǎn)孢量的影響

碳源種類對玉米大斑病菌分生孢子的產(chǎn)生有顯著影響。對于野生型菌株來說，葡萄糖和可溶性淀粉培養(yǎng)基上的產(chǎn)孢量最高，其次為蔗糖培養(yǎng)基，產(chǎn)孢量僅為葡萄糖培養(yǎng)基的51%，乳糖培養(yǎng)基的產(chǎn)孢量最低，僅為葡萄糖培養(yǎng)基的14%(圖4)。碳源對StSte12基因RNAi陽性轉(zhuǎn)化子StRNAi 9-10產(chǎn)孢量的影響與對野生型菌株基本一致，但是，除了乳糖培養(yǎng)基以外，StRNAi 9-10的產(chǎn)孢量均較野生型菌株

顯著下降，葡萄糖培養(yǎng)基上下降了66%，蔗糖培養(yǎng)基上下降了47%，可溶性淀粉培養(yǎng)基上下降了67%。StSte12基因RNAi陽性轉(zhuǎn)化子StRNAi 3-6在4種碳源培養(yǎng)基上幾乎都不產(chǎn)生分生孢子(圖4)。試驗結(jié)果表明，StSte12基因?qū)τ衩状蟀卟【稚咦拥陌l(fā)育有重要的調(diào)控作用，StSte12基因的表達量下降時，產(chǎn)孢量顯著減少。除了乳糖以外，葡萄糖、蔗糖和可溶性淀粉對StSte12基因調(diào)控產(chǎn)孢量的影響均達顯著水平。

A.葡萄糖, B.蔗糖, C.乳糖, D.可溶性淀粉； 圖中數(shù)字為各處理與WT在葡萄糖培養(yǎng)基上產(chǎn)孢量的比值;*表示P<0.05,**表示P<0.01

2.4 碳源對StSte12基因調(diào)控玉米大斑病菌菌絲和分生孢子形態(tài)的影響

顯微觀察3種供試菌株在4種碳源培養(yǎng)基上的菌絲和分生孢子形態(tài)，結(jié)果表明，StSte12基因RNAi陽性轉(zhuǎn)化子StRNAi 9-10與野生型菌株的分生孢子形態(tài)和菌絲形態(tài)在4種供試碳源培養(yǎng)基上基本一致。與其他2個供試菌株相比，StRNAi 3-6的菌絲纖弱，分節(jié)小甚至無分節(jié)，顏色較淺，在葡萄糖、蔗糖和乳糖培養(yǎng)基上的表現(xiàn)基本一致，但在可溶性淀粉培養(yǎng)基上，菌絲顏色更淺，更纖細，生長勢更弱(圖5)。試驗結(jié)果表明，StSte12基因?qū)τ衩状蟀卟【z長勢和顏色有一定的調(diào)控作用，可溶性淀粉對該調(diào)控作用有一定的影響，此試驗結(jié)果與2.1和2.2的結(jié)果一致。

圖5 碳源對StSte12基因調(diào)控玉米大斑病菌菌絲和分生孢子形態(tài)的影響

3 結(jié)論與討論

Ste12基因最早是在釀酒酵母中發(fā)現(xiàn)的，其是絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)途徑下游的一個關(guān)鍵調(diào)控因子[4]，主要功能是調(diào)控酵母細胞的交配反應(yīng)、假菌絲發(fā)育及侵入生長[5]。Madhani等[6]已經(jīng)證實，Ste12基因也存在于絲狀真菌以及人類和植物的一些病原菌中。周端詠等[7]研究表明，香蕉枯萎病菌Ste12基因在病原菌侵染寄主的過程中起主要作用。在黃瓜炭疽病菌[8]、西瓜炭疽病菌[9]和番茄枯萎病菌[10]中，缺失Ste12基因的菌株毒力顯著下降，這表明Ste12基因在病菌侵染植株的過程中發(fā)揮重要作用。

張長志等[11]發(fā)現(xiàn)，玉米大斑病菌Ste12同源蛋白StSte12具有Ste12-like所特有的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和空間結(jié)構(gòu)，該蛋白在附著胞發(fā)育中發(fā)揮重要功能。本試驗研究了StSte12基因?qū)τ衩状蟀卟【z和分生孢子發(fā)育的調(diào)控作用，結(jié)果表明，StSte12基因?qū)z生長和分生孢子發(fā)育均有重要的調(diào)控作用，該基因的表達量下降后，菌絲的生長勢變?nèi)?，顏色變淺，生長速度下降，產(chǎn)孢量顯著降低。目前，有多篇關(guān)于Ste12-like基因調(diào)控病原真菌菌絲發(fā)育的報道，如白色念珠菌(Candidaalbicans)Ste12的下游靶基因CHS7缺失突變體的菌絲異常彎曲，在培養(yǎng)基表面不能輻射狀生長[12]；輪枝鐮孢菌(Fusariumverticillioides)Ste12的下游靶基因CHS5缺失突變體的菌絲細胞膨大，對抗真菌藥物Nikkomycin Z敏感，病菌的致病性降低[13]；稻瘟病菌和尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)的Ste12-like功能缺失突變體因不能產(chǎn)生正常的侵染性菌絲而導(dǎo)致致病性喪失或下降[8,14]。這些研究結(jié)果均表明，Ste12基因?qū)z發(fā)育的調(diào)控作用與病菌的致病性顯著相關(guān)。

碳源是真菌合成碳水化合物和氨基酸骨架的主要來源，同時也是植物病原真菌生長發(fā)育的重要營養(yǎng)來源之一。本試驗研究了碳源對StSte12基因調(diào)控玉米大斑病菌菌絲和分生孢子發(fā)育的影響，結(jié)果表明，在4種供試碳源中，可溶性淀粉對StSte12基因調(diào)控菌絲生長和發(fā)育的影響最大，而乳糖對StSte12基因調(diào)控分生孢子發(fā)育的影響最小。其可能的原因是：可溶性淀粉屬于多糖，病菌需要將其降解為寡糖或單糖才能吸收利用，在同等質(zhì)量條件下，多糖的吸收利用比單糖和雙糖需要消耗更多的能量，需要更長的時間，因此不利于病菌的營養(yǎng)生長，即菌絲的生長發(fā)育；乳糖本身就不利于玉米大斑病菌分生孢子的產(chǎn)生，野生型菌株在乳糖培養(yǎng)基上的產(chǎn)孢量很少，即乳糖對玉米大斑病菌分生孢子產(chǎn)生有一定的抑制作用，這種抑制作用可能抵消了StSte12基因?qū)Ψ稚咦赢a(chǎn)生的調(diào)控作用。

[1] 趙輝,高增貴,張小飛,等.我國玉米大斑病菌生理小種種群動態(tài)分析[J].沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2008, 39(5):551-555.

[2] 吳敏,谷守芹,李坡,等.玉米大斑病菌轉(zhuǎn)錄因子StSte12的活性及其對酵母生長的功能互補分析[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué),2012,45(16):3281-3287.

[3] Gu S Q,Li P,Wu M,etal.StSTE12 is required for the pathogenicity ofSetosphaeriaturcicaby regulating appressorium development and penetration[J].Microbiological Research,2014,169(11): 817-823.

[4] Zhao X,Mehrabi R,Xu J R.Mitogen activated protein kinase pathways and fungal pathogenesis[J].Eukaryot Cell,2007,6:1701-1714.

[5] Errede B,Ammerer G.STE12,a protein involved in cell-type-specific transcription and signal transduction in yeast, is part of protein-DNA complexes[J]. Genes and Development,1989,3:1349-1361.

[6] Madhani H D,Fink G R.Combinatorial control required for the specificity of yeast MAPK signaling [J]. Science, 1997,275:1314-1317.

[7] 周端詠,劉一賢,謝德嘯,等.香蕉枯萎病菌Ste12 基因的克隆與序列分析[J].熱帶作物學(xué)報,2011,32(12):2298-2301.

[8] Park G,Xue C,Zheng L,etal.MST12 regulates infectious growth but not appressorium formation in the rice blast fungusMagnaporthegrisea[J].Molecular Plant-Microbe Interactions,2002,15:183-192.

[9] Hoi J W,Herbert C,Bacha N.Regulation and role of a STE12-like transcription factor from the plant pathogenColletotrichumlindemuthianum[J].Molecular Microbio-logy,2007,64:68-82.

[10] Tsuji G,Fujii S,Tsuge S.TheColletotrichumlagenariuSTE12-like geneCST1 is essential for appressorium penetration[J].Molecular Plant-Microbe Interactions,2003,16:315-325.

[11] 張長志,李坡,谷守芹,等.玉米大斑病菌轉(zhuǎn)錄因子StSte12的表達特性分析及其調(diào)控基因的篩選[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué),2013,46(8):1603-1609.

[12] Sanz M,Carrano L,Jiménez C,etal.Candidaalbicansstrains deficient in CHS7,a key regulator of chitin synthase Ⅲ, exhibit morphogenetic alterations and attenuated virulence[J].Microbiology,2005,151:2623-2636.

[13] Larson T M, Kendra D F, Busman M,etal.Fusariumverticillioideschitin synthases CHS5 and CHS7 are required for normal growth and pathogenicity [J]. Current Genetics,2011,57(3):177-189.

[14] Rispail N,Di Pietro A.FusariumoxysporumSte12 controls invasive growth and virulence downstream of the Fmk1 MAPK cascade [J]. Molecular Plant-Microbe Interactions,2009,22:830-839.

Effects of Carbon Sources on Regulation ofStSte12 to Mycelial Growth and Conidial Development ofSetosphaeriaturcica

ZHANG Yunfeng

(Department of Life Science,Tangshan Normal University,Tangshan 063000,China)

The wild type isolate andStSte12 RNAi positive transformants were cultured on media with glucose,lactose,sugar or soluble starch as carbon source,to analyze the effects of carbon sources on regulation ofStSte12 to mycelial growth and conidial development ofSetosphaeriaturcica,in order to clarify the function ofStSte12 and mechanisms of fungal pathogenicity.The results demonstrated thatStSte12 paid a key role in mycelial growth and conidial development ofS.turcica.With the decrease of gene expression ofStSte12, the mycelial growth ability was weakened, hypha color was lightened, mycelial growth speed was significantly attenuated and the conidial number was significantly decreased.The regulation ofStSte12 to mycelial growth was significantly affected by carbon sources, among which the effect of soluble starch was the strongest and the sugar was the weakest.Except lactose,the other three carbon sources had significantly effects on regulation ofStSte12 to conidial development ofS.turcica.

Setosphaeriaturcica;StSte12 gene; carbon sources; mycelial growth; conidial development

2015-06-12

國家自然科學(xué)基金項目(31271997)；河北省自然科學(xué)基金項目(C2014105067)；唐山師范學(xué)院團隊建設(shè)基金項目(2014E04)

張運峰(1982-)，男，河北石家莊人，講師，主要從事植物病理學(xué)研究。E-mail：yunfengzhang1982@126.com

S435.131

A

1004-3268(2016)01-0071-05