李云玲，田保明，楊 妍，毋瑞華，師恭曜，位 芳

(鄭州大學 生命科學學院，河南 鄭州 450001)

同源多倍化對擬南芥減數(shù)分裂前期Ⅰ過程的影響

李云玲，田保明，楊 妍，毋瑞華，師恭曜，位 芳*

(鄭州大學 生命科學學院，河南 鄭州 450001)

為研究同源多倍化對擬南芥減數(shù)分裂前期Ⅰ過程的影響，以哥倫比亞生態(tài)型(Columbia)二倍體擬南芥為試驗材料，經(jīng)0.2%秋水仙素加倍處理，利用流式細胞儀和細胞學方法鑒定倍性，獲得同源多倍體擬南芥；分析同源多倍體擬南芥的形態(tài)特征，利用熒光顯微觀察不同倍性擬南芥的減數(shù)分裂前期Ⅰ過程，并利用熒光定量PCR技術(shù)分析與減數(shù)分裂前期Ⅰ過程相關(guān)的基因的表達變化。結(jié)果表明，與二倍體擬南芥相比，在細胞學水平上，不同倍性擬南芥的減數(shù)分裂過程基本一致；在分子水平上，多倍化對擬南芥減數(shù)分裂產(chǎn)生一定影響，同源重組相關(guān)基因的表達量呈現(xiàn)上調(diào)或下調(diào)的變化，且功能相關(guān)或有相互作用關(guān)系的基因的表達量變化趨勢相似。

多倍化； 擬南芥； 減數(shù)分裂； 同源重組； 前期Ⅰ

多倍化是植物進化的一種重要推動力量。近年來，關(guān)于多倍體的研究也相繼展開，但同源多倍體的研究相對滯后。同源多倍化后其中的基因組迅速擴張發(fā)生部分或全部重復，在對減數(shù)分裂中染色體行為產(chǎn)生影響的同時，也涉及到大范圍的分子和生理調(diào)整，最終調(diào)控植物的進化。基因組加倍顯著影響基因的表達[1]，研究表明，多倍化后各個生物合成途徑相關(guān)基因的表達都發(fā)生變化，如新陳代謝、光合作用、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、細胞生長與維持、信號和衰老、抗逆性以及植物激素調(diào)控等[2-5]。

同源重組是指減數(shù)分裂中同源染色體DNA發(fā)生交換的過程，與同源染色體的聯(lián)會和配對有密切聯(lián)系，這些過程均由一系列基因共同調(diào)控協(xié)調(diào)完成，基因的缺失或改變都會對這些過程造成影響。在擬南芥減數(shù)分裂過程中，許多與之相關(guān)的基因在功能上都得到了證實，SPO11-1和SPO11-2相互作用，并與PRD1和PRD2形成異源復合體，共同誘發(fā)減數(shù)分裂期DNA雙鏈斷裂；MSH4參與形成修復復合體對DNA斷裂缺口進行修復，為等位基因的同源重組提供了保證。RAD50和NBS1以復合物的形式作用于重組過程中DNA雙鏈斷裂修復[6-7]，ZIP4[8-9]、PTD[10-11]和MLH3[12]均參與同源重組修復過程，此外，MUS81也是重組過程必需的蛋白[13-14]。同源多倍化是推動植物進化的主要動力，也是基因組加倍的重要途徑，對植物生殖繁衍具有重要意義。減數(shù)分裂期同源重組是植物變異和遺傳多樣化的重要源泉，因此，本研究分析了多倍化對減數(shù)分裂和同源重組相關(guān)基因的影響，旨在為多倍體植物遺傳資源育種提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

將哥倫比亞生態(tài)型(Columbia)二倍體擬南芥(Arabidopsisthaliana)種子點播在MS培養(yǎng)基中，置于(20±2)℃、16 h光照/8 h黑暗的光照培養(yǎng)室中萌發(fā)并生長。取生長2周左右的材料用0.2%秋水仙素暗處理莖尖3～4 h，無菌水沖洗后轉(zhuǎn)移至營養(yǎng)土中培養(yǎng)。分株收種。

1.2 方法

1.2.1 同源四倍體鑒定

1.2.1.1 流式細胞儀法 取生長1個月左右的擬南芥幼齡葉片，置于250 μL的抽提緩沖液中，用刀片切碎釋放細胞，加750 μL Cy-Stain熒光染色液，冰床上放置30 s至1 min，用流式細胞儀測定DNA含量，判斷植物倍性。

1.2.1.2 染色體計數(shù)法 取剛剛露白的花序立即放入卡諾固定液(乙醇∶冰乙酸=3∶1)中固定3～4 h；檸檬酸緩沖液和無菌水分別清洗2～3次，37 ℃酶解(酶液成分：纖維素酶∶果膠酶=1∶1)5～6 h，將酶解后的花序轉(zhuǎn)移至干凈載玻片上，用解剖針搗碎釋放花粉母細胞，經(jīng)40 μm過濾網(wǎng)過濾、離心富集，制備成細胞懸液，滴片烘干后，經(jīng)50 μg/mL的PI染色，進行觀察。

1.2.2 同源四倍體形態(tài)觀察和花粉活力鑒定 取同一時期2種倍性的擬南芥，對比觀察葉片、莖桿、花器等方面的生物學特征。

于上午10:00左右取主莖上剛剛露白的花朵置于干凈的培養(yǎng)皿中；在載玻片上滴1滴BK萌發(fā)液，用鑷子撥下花瓣露出花藥，在液滴上蘸粉至無明顯花粉落下；把載有花粉的玻片放到鋪有濕濾紙的培養(yǎng)皿中，蓋上皿蓋放入37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)3～4 h；用品紅染色蓋片鏡檢觀察。統(tǒng)計花粉萌發(fā)率。

1.2.3 二倍體和同源四倍體擬南芥減數(shù)分裂過程觀察 試驗方法同1.2.1.2。

1.2.4 擬南芥減數(shù)分裂重組相關(guān)基因的熒光定量分析

1.2.4.1 同源重組相關(guān)基因和內(nèi)參基因的引物設(shè)計 根據(jù)同源重組相關(guān)基因和內(nèi)參基因β-actin的CDS保守序列，用Vector NTI軟件設(shè)計引物，由上海生工生物工程股份有限公司合成。純度為ULTRAPAGE級。內(nèi)參基因及同源重組相關(guān)基因的qRT-PCR引物序列見表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.2.4.2 二倍體和同源四倍體擬南芥總RNA的提取和純化 選取在光照培養(yǎng)室中生長1個月左右的健康擬南芥植株，分別摘取5～10簇二倍體和同源四倍體材料的花序?；ㄐ騌NA的提取采用劉洋等[15]的方法進行。提取的總RNA用DNase Ⅰ處理排除DNA污染，并對提取的總RNA進行電泳分析。

1.2.4.3 cDNA的合成及qRT-PCR檢測 反轉(zhuǎn)錄使用晶彩生物公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒,獲得的cDNA作為qRT-PCR的反應模板。20 μL PCR反應體系：上下游引物各0.8 μL、cDNA 2.0 μL、2×SYBR qPCR Mix 10 μL，以ddH2O補足20 μL。PCR反應程序為: 94 ℃預變性2 min;94 ℃ 20 s,55～60 ℃ 20 s,72 ℃ 20 s,40個循環(huán); 72 ℃延伸2 min。每個樣品cDNA設(shè)置3個重復，用2-△△Ct法計算并統(tǒng)計各基因的相對表達量。

2 結(jié)果與分析

2.1 同源四倍體鑒定結(jié)果

流式細胞分析技術(shù)因其操作簡單、快速和檢測量大等特點，已廣泛應用于植物倍性鑒定。由圖1A、圖1B可知，二倍體擬南芥的主峰熒光強度位于7附近，同源四倍體擬南芥的主峰熒光強度位于10附近，與二倍體主峰值近似成2倍關(guān)系，初步判斷同源四倍體加倍成功。

染色體計數(shù)法是鑒定倍性較為可靠的一種方法。擬南芥基因組相對較小，二倍體擬南芥有10條染色體。由圖1a、圖1b可知，二倍體擬南芥中2n=10,四倍體擬南芥中2n=20，因此確定成功獲得同源四倍體擬南芥。

A、B分別為二倍體、同源四倍體擬南芥的流式細胞峰圖；a、b分別為二倍體(2n=10)、同源四倍體(2n=20)擬南芥的染色體(bar=10 μm)

2.2 二倍體和同源四倍體擬南芥形態(tài)觀察與花粉活力鑒定

多倍體植株大多在形態(tài)上與二倍體有明顯差異。如圖2所示，與二倍體擬南芥相比較，同源四倍體擬南芥花器較大，葉片肥厚，同源四倍體的葉片寬度增大，長度變小，葉形指數(shù)(長度與寬度之比)變小且葉片普遍有卷曲現(xiàn)象，植株整體變高變壯。

a葉片形態(tài)； b、c分別為四倍體、二倍體擬南芥的花器

由圖3可知，二倍體擬南芥的花粉活力為81.27%，同源四倍體擬南芥的花粉活力為76.55%，同源四倍體的花粉活力略低于二倍體。花粉由減數(shù)分裂形成，因此可知，同源四倍體的減數(shù)分裂過程無明顯異常，可產(chǎn)生正常配子。

2.3 二倍體和同源四倍體擬南芥細胞學對比分析

同源重組發(fā)生在減數(shù)分裂前期，與減數(shù)分裂染色體聯(lián)會配對有密切關(guān)系。二倍體和同源四倍體擬南芥減數(shù)分裂過程大體一致。由圖4可見，同源四倍體擬南芥因染色體數(shù)目加倍，減數(shù)分裂前期簇擁在一起的染色體較多；從同源四倍體減數(shù)分裂前期的觀察可知，染色體間的著絲粒較多，即聯(lián)會配對活動頻繁。

a、b為二倍體減數(shù)分裂前期Ⅰ；c、d為同源四倍體減數(shù)分裂前期Ⅰ；*為核仁組織區(qū)； 箭頭代表配對的著絲粒

2.4 擬南芥減數(shù)分裂重組相關(guān)基因的表達分析結(jié)果

2.4.1 擬南芥總RNA的提取質(zhì)量鑒定 RNA的提取結(jié)果見圖5，提取的總RNA條帶清晰,其中的28S rRNA和18S rRNA條帶輪廓清晰且亮度較高，5S rRNA條帶較暗基本不可見，條帶均無明顯拖尾現(xiàn)象。由此可知，提取的RNA質(zhì)量良好，可用于后續(xù)試驗。

圖5 不同倍性擬南芥總RNA的電泳結(jié)果

2.4.2 減數(shù)分裂重組相關(guān)基因的表達情況 圖6所示，與二倍體相比，NBS1表達量極顯著上調(diào)，PRD2、RAD50表達量顯著上調(diào)，PRD1表達量上調(diào)(P>0.05)，MSH4表達量顯著下調(diào)。PRD1和PRD2為同源基因，且有部分功能重疊，因此有相近的變化趨勢；RAD50和NBS1同為MRN復合物的組成部分，部分次要功能相同但主要功能不同，所以二者表達量的變化趨勢不同，主要功能性強且參與多項重組相關(guān)功能的基因表達量變化明顯，功能性相對單一的表達量變化則不明顯。

圖6 不同倍性擬南芥減數(shù)分裂重組相關(guān)基因的表達分析

3 結(jié)論與討論

細胞學觀察結(jié)果表明，加倍后的同源四倍體擬南芥減數(shù)分裂過程與二倍體基本一致，能產(chǎn)生正常配子，這與花粉活力鑒定結(jié)果一致。但其中染色體的各種聯(lián)會配對活動更加頻繁，染色體行為發(fā)生變化會導致聯(lián)會配對重組相關(guān)基因的表達量也發(fā)生變化。

擬南芥中目前已發(fā)現(xiàn)的與雙鏈缺口形成有關(guān)的基因有5個，除了SPO11-1和SPO11-2基因還有PRD1、PRD2和PRD3，它們通過形成某種復合物來調(diào)控雙鏈缺口的形成[16-17]。PRD1基因在雙鏈缺口形成中的功能是其主要功能；PRD1還與DMC1有一定的相互作用關(guān)系，并最終影響重組的發(fā)生；而且，在酵母雙雜交系統(tǒng)中Atprd1 和Atspo11-1能相互作用,說明PRD1與SPO11-1也相互作用[18]。PRD2主要編碼卷曲螺旋蛋白MPS1，與減數(shù)分裂的紡錘體組裝有關(guān)，且參與某種調(diào)控雙鏈缺口形成的復合物的形成。四倍體擬南芥中二者相對表達量提高，說明加倍后雙鏈斷裂過程發(fā)生頻繁，且染色體相關(guān)的活動比紡錘體的活動量大，是減數(shù)分裂過程中的主要活動。

RAD50主要通過形成MRN復合物對雙鏈缺口作出反應并進行修復[19]。研究表明，RAD50的結(jié)構(gòu)當中有一個DNA接口，當它與DNA結(jié)合時，其功能作用點就發(fā)生改變，對于DNA雙鏈缺口修復就不重要了，轉(zhuǎn)而對端粒的維護有著重要作用[20-21]。同源四倍體的DNA含量加倍，RAD50與之結(jié)合參與端粒的維護，因此其含量增加，不與DNA直接結(jié)合的部分參與雙鏈缺口修復。NBS1在激活ATM和ATR方面發(fā)揮著唯一且重要的作用，ATM和ATR是對DNA雙鏈斷裂作出回應的2種蛋白[22-23]。RAD50參與形成MRN復合物，在DNA雙鏈斷裂修復中發(fā)揮作用；另外RAD50還具有協(xié)同端粒酶維護端粒的作用。NBS1相對表達量變化趨勢明顯于RAD50，是因為其功能性強且加倍后減數(shù)分裂前期雙鏈斷裂的活動更頻繁。

MSH4是減數(shù)分裂特異基因，通常在減數(shù)分裂前期Ⅰ表達，與同源重組的起始過程以及同源染色體交叉形成有關(guān)[24]。一般情況下，MSH4通過與其他幾個基因組裝形成ZMM蛋白復合體行使各種功能。在Shodhan等[24]的研究中發(fā)現(xiàn)，若敲除MSH4或MSH5基因，減數(shù)分裂過程中同源染色體形成二價體的數(shù)量顯著減少。本研究中同源四倍體擬南芥該基因的表達量減少，說明減數(shù)分裂過程中二價體減少，即會有新的染色體構(gòu)型出現(xiàn)。對同源四倍體白菜的減數(shù)分裂過程研究發(fā)現(xiàn)，除了有終變期染色體構(gòu)型多樣的現(xiàn)象外，其減數(shù)分裂過程及各時期的染色體行為與二倍體基本一致，減數(shù)分裂完成，生成的四分體結(jié)構(gòu)正常，沒有出現(xiàn)三分體或微核的現(xiàn)象[25]，本試驗結(jié)果與之相符。

此外，相關(guān)研究表明，與二倍體擬南芥相比，同源四倍體和異源四倍體減數(shù)分裂過程中同源重組頻率顯著提高[26]，這一研究結(jié)果與本研究結(jié)果基本一致。因此推測，多倍化能誘導減數(shù)分裂染色體行為異常及基因表達量的改變，從而影響多倍體植物相關(guān)生物學性狀的改變。

[1] 李朋波,李召虎,華金平.植物多倍化對基因組的沖擊及對植物的影響[G]//中國棉花學會2006年年會暨第七次代表大會論文匯編.保定:中國棉花學會,2006:91-94.

[2] Comai L.The advantages and disadvantages of being polyploid[J].Nature Reviews Genetics,2005,6(11):836-846.

[3] Chen Z J,Ni Z.Mechanisms of genomic rearrangements and gene expression changes in plant polyploids[J].Bioessays,2006,28(3):240-252.

[4] Adams K L,Wendel J F.Polyploidy and genome evolution in plants[J].Current Opinion in Plant Biology,2005,8(2):135-141.

[5] Shaked H,Kashkush K,Ozkan H,etal.Sequence elimination and cytosine methylation are rapid and reproducible responses of the genome to wide hybridization and altopolyploidy in wheat[J].The Plant Cell,2001,13(8):1749-1759.

[6] 謝文軍,史典義,蔡澤熙,等.聯(lián)會復合體的組成、功能及遺傳控制[J].遺傳,2012,34(2):167-176.

[7] 劉曉林,于佳,范云六,等.擬南芥減數(shù)分裂重組發(fā)生的遺傳學研究[J].中國農(nóng)業(yè)科技導報,2008,10(2):22-28.

[8] Shen Y,Tang D,Wang K,etal.ZIP4 in homologous chromosome synapsis and crossover formation in rice meiosis[J].Journal of Cell Science,2012,125(11):2581-2591.

[9] Yelina N E,Ziolkowski P A,Miller N,etal.High-throughput analysis of meiotic crossover frequency and interference via flow cytometry of fluorescent pollen inArabidopsisthaliana[J].Nature Protocols,2013,8(11):2119-2134.

[10] Lu P,Wijeratne A J,Wang Z,etal.ArabidopsisPTD is required for typeⅠcrossover formation and affects recombination frequency in two different chromosomal regions[J].Journal of Genetics and Genomics,2014,41(3):165-175.

[11] Macaisne N,Vignard J,Mercier R.SHOC1 and PTD form an XPF-ERCC1-like complex that is required for formation of classⅠcrossovers[J].Journal of Cell Science,2011,124(16):2687-2691.

[12] Sonntag Brown M,Lim E,Chen C,etal.Genetic analysis ofmlh3 mutations reveals interactions between crossover promoting factors during meiosis in baker's yeast[J].G3(Bethesda),2013,3(1):9-22.

[13] Schwartz E K,Wright W D,Ehmsen K T,etal.Mus81-Mms4 functions as a single heterodimer to cleave nicked intermediates in recombinational DNA repair[J].Molecular and Cellular Biology,2012,32(15):3065-3080.

[14] Lukaszewicz A,Howard-Till R A,Loidl J.Mus81 nuclease and Sgs1 helicase are essential for meiotic recombination in a protist lacking a synaptonemal complex[J].Nucleic Acids Research,2013,41(20):9296-9309.

[15] 劉洋,何心堯,馬紅波,等.用CTAB-PVP法提取棉花各組織總RNA的研究[J].中國農(nóng)業(yè)大學學報,2006,11(1):53-56.

[16] Grelon M,Vezon D,Gendrot G,etal.AtSPO11-1 is necessary for efficient meiotic recombination in plants[J].The EMBO Journal,2001,20(3):589-600 .

[17] 張丞.調(diào)節(jié)擬南芥染色體同源重組起始過程中雙鏈缺口形成的新基因——AtDFO[D].上海:華東師范大學,2012.

[18] De Muyt A,Vezon D,Gendrot G,etal.AtPRD1 is required for meiotic double strand break formation inArabidopsisthaliana[J].The EMBO Journal,2007,26(18):4126-4137.

[19] Williams R S,Williams J S,Tainer J A.Mre11-Rad50-Nbs1 is a keystone complex connecting DNA repair machinery,double-strand break signaling,and the chromatin template[J].Biochemistry and Cell Biology,2007,85(4):509-520.

[20] Rojowska A,Lammens K,Seifert F U,etal.Structure of the rad50 DNA double-strand break repair protein in complex with DNA[J].The EMBO Journal,2014,33(23):2847-2859.

[21] Bleuyard J Y,Gallego M E,White C I.Meiotic defects in theArabidopsisrad50 mutant point to conservation of the MRX complex function in early stages of meiotic recombination[J].Chromosoma,2004,113(4):197-203.

[22] Kobayashi M,Hayashi N,Takata M,etal.NBS1 directly activates ATR independently of MRE11 and TOPBP1[J].Genes to Cells,2013,18(3):238-246.

[23] Hopfner K P.ATP puts the brake on DNA double-strand break repair:A new study shows that ATP switches the Mre11-Rad50-Nbs1 repair factor between signaling and processing of DNA ends[J].Bioessays,2014,36(12):1170-1178.

[24] Shodhan A,Lukaszewicz A,Novatchkova M,etal.Msh4 and Msh5 function in SC-independent chiasma formation during the streamlined meiosis ofTetrahymena[J].Genetics,2014,198(3):983-993.

[25] 崔群香,王倩,唐紅艷,等.普通白菜同源四倍體花粉母細胞減數(shù)分裂及其雄配子體發(fā)育研究[J].揚州大學學報(農(nóng)業(yè)與生命科學版),2012,33(4):56-60.

[26] Pecinka A,Fang W,Rehmsmeier M,etal.Polyploidization increases meiotic recombination frequency inArabidopsis[J].BMC Biol,2011,9:24.

Effects of Autopolyploidy on Meiotic ProphaseⅠinArabidopsisthaliana

LI Yunling,TIAN Baoming,YANG Yan,WU Ruihua,SHI Gongyao,WEI Fang*

(School of Life Sciences,Zhengzhou University,Zhengzhou 450001,China)

In the present study,the effects of autopolyploidy on meiotic prophaseⅠwas analyzed inArabidopsisthaliana(Columbia eco-type).A.thalianadiploids were treated with 0.2% colchicine,and then the flow cytometry and cytology were used to identify the autopolyploid progeny.The morphological characteristics of autopolyploidA.thalianawas analyzed,and meiotic prophaseⅠwas observed under fluorescent microscope.Meanwhile,the quantitative real-time PCR was applied to analyze the expression of several meiotic recombination related genes in diploid and autotetraploidArabidopsis.The results showed that,in comparison with diploids,cytologically the similar meiosis progress was observed in autopolyploidArabidopsis,and the gene expression was either up-regulated or down-regulated at the molecular level,and the changes of gene expression were mostly correlated with their specific functional roles during meiosis.

autopolyploidy;Arabidopsisthaliana; meiosis; homologous recombination; meiotic prophase Ⅰ

2015-07-28

國家自然科學基金項目(U1204308)

李云玲(1989-)，女，河南鶴壁人，碩士，主要從事植物分子細胞遺傳學研究。

*通訊作者：位 芳(1981-)，男，河南項城人，副教授，博士，主要從事植物遺傳學方面的教學與研究工作。 E-mail:fangwei@zzu.edu.cn

Q943

A

1004-3268(2016)01-0036-06