李玉霞，楊玉霞，孫玉英，劉 松，王廣東

(南京農(nóng)業(yè)大學 園藝學院，南京 210095)

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蕙蘭CfCIN基因克隆及其功能分析

李玉霞，楊玉霞，孫玉英，劉 松，王廣東*

(南京農(nóng)業(yè)大學 園藝學院，南京 210095)

以蕙蘭(CymbidiumfaberiRolfe)為試驗材料，采用RT-PCR技術克隆了TCP家族的CIN同源基因，開放閱讀框長1 161 bp，編碼386 個氨基酸，將其命名為CfCIN(GenBank 登錄號為KJ956809)。為進一步分析CfCIN的功能，構建了植物表達載體，采用農(nóng)桿菌介導法轉化非洲紫羅蘭葉片，獲得了轉化植株并對轉基因植株進行了性狀分析。結果顯示：與野生型非洲紫羅蘭葉片相比，轉基因植株的葉片更大，由圓形變?yōu)槁褕A形，葉緣由平整光滑變?yōu)橛腥笨糖疑韵蚝缶砬~脈明顯，葉柄紅，花器官形狀變化不明顯。研究表明，CfCIN可能參與調(diào)控植物葉片的形態(tài)建成。

蕙蘭；CfCIN；基因克?。晦D化；非洲紫羅蘭

TCP 蛋白質是植物特有的含有一個TCP結構域的一類轉錄因子[1]，它們廣泛存在于從藻類到高等植物的基因組中，與細胞的增殖和生長有關[2-5]。TCP結構域命名來源于TeosinteBranched1(TB1)、Cycloidea(CYC)和ProliferatingCellFactors(PCFs)的第一個英文字母[1]，凡具有這個結構域的基因都稱為TCP結構域基因。TCP基因家族根據(jù)TCP結構域的差異性可分為2個亞族，一類以PCF1和PCF2為代表，一類以CIN和CYC/TB1為代表，后者可再細分為CYC/TB1分支和CIN分支[6]。其中CYC/TB1分支基因只在被子植物中存在，其大多數(shù)成員編碼的蛋白質具有保守的 TCP 結構域、R 區(qū)(精氨酸富集)和 ECE(谷氨酸-半胱氨酸-谷氨酸)結構[7-8]，它們在植株的分枝特性[9-10]和花的對稱性[1-2, 11]方面發(fā)揮重要作用。與CYC/TB1分支不同，CIN分支成員編碼的蛋白質結構差異較大，除均具有TCP 結構域外，部分具有R區(qū)或miR319靶序列，或者兩者均不具有[6]。目前，CIN分支在物種中的功能研究相對較少，在金魚草、擬南芥和番茄中，CIN同源基因限制了葉緣原基的細胞增殖。在金魚草和擬南芥突變體中，葉片細胞持續(xù)分離影響了葉片的形狀、大小和卷曲程度[12-16]。在番茄中，突變體葉緣不斷生長導致復葉的小葉更大[17]。而在單子葉植物中對其功能的研究尚未見相關報道。

蕙蘭(CymbidiumfaberiRolfe)是觀賞價值較高的蘭屬植物，是中國栽培歷史悠久和范圍廣泛的蘭花之一。蕙蘭葉帶形、直立性強、葉姿雄偉，瓣型奇特、唇瓣發(fā)達，有別于其它已對CIN和CYC/TB1分支基因進行過詳細研究的物種。研究蕙蘭CIN和CYC/TB1分支基因，對認識該類基因的功能多樣性以及培育葉形和株形改良的花卉新品種具有重要意義。

本研究的初衷是以單子葉植物蕙蘭為材料，從其花器官中克隆TCP基因家族中調(diào)控花對稱性的CYC分支基因，而通過序列分析發(fā)現(xiàn)所克隆基因中除CYC之外，有一個TCP基因屬于CIN分支成員，因此擬通過轉化試驗進一步驗證CIN分支基因的功能，已明確該基因是否對植物葉片形態(tài)建成及花發(fā)育等具有調(diào)控作用。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

試驗于2012～2014年在南京農(nóng)業(yè)大學進行。蕙蘭幼嫩花蕾取自南京農(nóng)業(yè)大學園藝學院觀賞植物生物技術課題組資源圃。用于轉化的非洲紫羅蘭為在16 h光照，白天25℃、夜晚20℃條件下生長4周至長出幼嫩葉片的無菌苗。

1.2 方 法

1.2.1 DNA 和RNA 提取與cDNA合成 采用Trizol試劑盒(上海生工生物工程技術服務有限公司)提取蕙蘭花蕾總RNA，采用CTAB試劑(上海生工生物工程技術服務有限公司)提取轉基因非洲紫羅蘭植株的基因組DNA和總RNA。采用TaKaRa 公司PrimeScriptTM RT reagent Kit 反轉錄試劑盒合成cDNA。

1.2.2 序列克隆與分析 采用Trizol試劑法提取總RNA, 取2 μL RNA樣品于1.2%瓊脂糖凝膠上進行電泳(125 V，25 min)，GelRed熒光染料(Biotium公司)染色，用凝膠成像系統(tǒng)(Tanon GIS2500)進行觀察拍照，檢測RNA條帶的完整性。于Microtube 管中混合下列試劑：Total RNA 1 μL, Oligo (dT)18 Primer (50 μmol/L) 1 μL, RNase Free ddH2O 5 μL, 70 ℃水浴保溫10 min，迅速冰上冷卻超過2 min。瞬時離心，使模板RNA/引物的變性混合液聚集于Microtube管底。在上述Microtube管中加入下列反轉錄反應液：上述模板RNA/引物變性混合液7 μL, 5× M-MLV Buffer 2 μL, dNTPs Mixture (10 mmol/L) 0.5 μL, RNase Inhibitor (40 U/μL) 0.25 μL, RTase M-MLV (RHase H-，200 U/μL)0.25 μL, 共10 μL，42 ℃延伸1 h。70 ℃保溫15 min 后冰上冷卻，得到的cDNA置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

從GenBank 上下載已登錄的金魚草(AntirrhinummajusY16313)、擬南芥(ArabidopsisthalianaNP_567553)、水稻(OryzasativaNP_001044333)和非洲菊(GerberahybridaEU429303)等 TCP同源基因序列的保守區(qū)設計特異性引物ZJF和ZJR擴增TCP基因的保守區(qū)。

表1 引物序列及使用

通過PCR 擴增中間片段，根據(jù)所測中間片段序列(包含5′端)設計1個上游特異性引物F-3(表1)，根據(jù)蝴蝶蘭(PhalaenopsisamabilisPATC135086)TCP基因的3′端保守區(qū)域設計一個下游特異性引物R-3(表1)。94℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。

利用UNIQ-10 柱式DNA 膠回收試劑盒(上海生工生物工程技術服務有限公司)將擴增產(chǎn)物回收，凝膠電泳檢測后，采用Biomiga公司pEASY-T3 Cloning Kit 連接，轉化于DH5α感受態(tài)細胞，藍白斑篩選，經(jīng)菌液PCR 初步鑒定后送上海華大基因公司測序。 最后根據(jù)DNAMAN 5.0 軟件拼接序列獲得蕙蘭CfCIN完整開放閱讀框序列。根據(jù)拼接出的序列利用Primer Premier 5.0 設計開放閱讀框特異性引物QF和QR(表1)擴增CfCIN完整ORF，同樣將擴增產(chǎn)物回收、連接、轉化、篩選后測序。

利用NCBI網(wǎng)站進行基因的序列比對和最大開放閱讀框(Open Reading Frame，ORF)在線分析(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)，通過Blast進行氨基酸序列比對和保守域的查找分析(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi)，利用DNAMAN 5.0軟件對不同物種間氨基酸序列的同源性進行比對分析以及構建不同物種間的系統(tǒng)進化樹。

1.2.3 載體構建與非洲紫羅蘭轉化 測序正確的轉化子利用BglII和SpeI雙酶切，連接到含有Hyg抗性基因的pCambia1302 載體上，經(jīng)過酶切和測序(測序用載體引物CfCIN-F/CfCIN-R，表1)，檢測正確的重組質粒利用凍融法轉入農(nóng)桿菌LBA4404。

CfCIN基因采用農(nóng)桿菌介導法轉化非洲紫羅蘭：取大小約為1.0 cm2的非洲紫羅蘭幼嫩葉片，接種于分化培養(yǎng)基(MS + 0.5 mg·L-16-BA + 0.02 mg·L-1NAA + 30 g·L-1蔗糖+ 6.5 g·L-1瓊脂，pH5.8)上，預培養(yǎng)2 d。預培養(yǎng)的葉片，放入農(nóng)桿菌懸浮菌液中震蕩侵染 30 min；吸干表面菌液，將侵染葉片接種于共培養(yǎng)培養(yǎng)基，分化培養(yǎng)基添加100 μmol·L-1乙酰丁香酮(AS)，暗培養(yǎng)3 d。以本實驗室確定的潮霉素(Hyg)濃度40 mg·L-1作為篩選壓，轉接葉片于篩選培養(yǎng)基[分化培養(yǎng)基 + 頭孢霉素(Cef) 500 mg·L-1+ Hyg 40 mg·L-1]，每20 d更新一次篩選培養(yǎng)基，直至長出抗性芽。當小苗長至2 cm左右時，轉至生根培養(yǎng)基(MS + 0.1 mg·L-1NAA + 30 g·L-1蔗糖+ 6.5 g·L-1瓊脂，pH5.8)中，待長出根系后移栽至溫室，長至開花。

1.2.4 轉基因非洲紫羅蘭的鑒定 采用CTAB法提取抗性植株的基因組DNA和總RNA，分別設計CfCIN基因的特異性引物CIN-F1、CIN-R1和CIN-F2、CIN-R2，進行PCR和RT-PCR檢測。驗證目的基因是否整合以及在轉錄水平的表達。將驗證成功的非洲紫羅蘭轉基因植株和野生型植株，同時移栽到蛭石∶草炭土∶珍珠巖=9∶3∶1的基質中，定植于南京農(nóng)業(yè)大學園藝學院溫室中，在25 ℃，自然光照條件下，觀察非洲紫羅蘭轉化植株和野生型植株的生長情況，對比葉形和花型特征。

2 結果與分析

2.1 CfCIN序列的獲得

對擴增產(chǎn)物分別進行回收、連接、轉化、篩選后測序，得到長534 bp中間序列(包含5′端；圖1，A)，Blast 在線對比發(fā)現(xiàn)含有TCP保守結構域，初步證實屬TCP基因家族。根據(jù)設計的3′端特異性引物，最終獲得873 bp 3′端cDNA 片段序列(圖1，B)。利用引物QF 和QR 特異性擴增出蕙蘭CfCIN完整開放閱讀框序列(圖1，C)，測序結果顯示ORF序列長為1 161 bp，不具有R區(qū)、ECE結構域及miR-NA319靶序列，推測其編碼的蛋白質由386個氨基酸殘基組成(圖2)。NCBI 在線分析同源性后，命名該基因為CfCIN(登錄號KJ956809)。

M. Marker圖1 蕙蘭CfCIN 基因中間片段(A)、3′ 端(B)及全長(C)擴增結果Fig.1 The PCR results of conservative fragments(A), 3′ fragments(B)and full-length of CfCIN (C)

方框部分代表TCP-domain圖2 蕙蘭CfCIN的ORF和推導氨基酸序列The TCP-domain is the boxFig.2 The ORF and amino acid sequence of CfCIN

2.2 CfCIN基因氨基酸序列同源比較

利用DNAman對蕙蘭CfCIN編碼氨基酸和其他物種TCP基因編碼氨基酸進行序列比對，發(fā)現(xiàn)該蛋白質與金魚草、番茄及黃瓜等植物蛋白質氨基酸序列相似性較高，且具有TCP基因家族共同特征，都含有一個相對較保守的TCP結構域(圖3)，說明該蛋白質屬于TCP蛋白質家族。

2.3 CfCIN與其他物種TCP 的系統(tǒng)進化樹分析

利用DNAMAN軟件將蕙蘭CfCIN基因與GenBank數(shù)據(jù)庫中已登錄的15種TCP氨基酸序列構建系統(tǒng)進化樹(圖4)，可見蕙蘭CfCIN與金魚草、番茄及黃瓜親緣關系最近，與金魚草AmCIN在進化上具有相同的起源，推測蕙蘭CfCIN同樣具有AmCIN參與葉形態(tài)發(fā)生的功能。

2.4 轉基因非洲紫羅蘭的獲得及驗證

CfCIN基因經(jīng)雙酶切從TA克隆中卸載，并且經(jīng)分子操作成功連接到了pCambia1302載體，所獲得的pC1302-CfCIN表達載體經(jīng)過測序和雙酶切，證實構建正確(圖5)。

經(jīng)潮霉素(Hyg)抗性篩選，共獲得32株抗性植株。分別利用CfCIN基因的特異性引物對隨機挑選的5株非洲紫羅蘭轉化植株進行PCR和RT-PCR擴增，結果表明CfCIN基因已轉入非洲紫羅蘭，并能在轉錄水平表達(圖6)。

2.5 轉CfCIN基因非洲紫羅蘭植株的表型分析

本研究所用的野生型非洲紫羅蘭葉片為圓形，正面全被毛，背部帶紫色，稍肉質，葉緣平整光滑，葉脈不明顯，葉柄稍紅(圖7, A, C～E)。利用農(nóng)桿菌介導法，將CfCIN基因導入非洲紫羅蘭植株中，以觀察外源基因對異源物種葉型的影響。

從獲得的32株轉化植株中隨機挑選10株，分別從每一株轉化植株中隨機挑選3片葉片，對其葉片形態(tài)進行觀察。發(fā)現(xiàn)與野生型非洲紫羅蘭葉片相比，轉化非洲紫羅蘭葉片的結構受到不同程度的影響。主要有以下幾種表型變化：葉片更大，由圓形變?yōu)槁褕A形，葉緣由平整光滑變?yōu)橛休^淺的缺刻且稍向后卷曲，葉脈更明顯，葉柄更紅(圖7, A, B, F～H)。轉化植株與野生型植株在溫室自然光照條件下生長至開花，觀察其花器官特征，發(fā)現(xiàn)轉化植株與野生型植株花器官結構基本相同，均會出現(xiàn)單瓣和重瓣表型(可能受光照等環(huán)境條件影響)，但轉化植株與野生型植株相比花瓣數(shù)有增加的趨勢，且花瓣多不規(guī)則，卷曲程度明顯，少量花器官內(nèi)部又分化出多層花瓣，部分花器官花藥頂部分化出不完整花瓣(圖7, I)，這些變化表明CfCIN基因除了影響非洲紫羅蘭葉片的表型，使葉片形態(tài)發(fā)生了一定程度的改變，同時對花器官發(fā)育也具有一定的影響，但CfCIN單個基因影響較弱，未能明顯改變?nèi)~形和花型，可能需要與其他基因共同作用參與葉片和花器官的發(fā)育過程。

圖3 CfCIN 編碼氨基酸序列與其它植物的TCP序列比對分析Fig.3 Alignment of amino acid sequence of CfCIN with TCP sequence from other plants

圖4 CfCIN的系統(tǒng)進化樹分析Fig.4 The phylogeny of plant TCP polypeptides

圖5 CfCIN的PCR 擴增(A)及重組質粒pC1302-CfCIN(B)酶切結果Fig.5 PCR amplification of CfCIN(A)and identification of the construct by digestion of pC1302-CfCIN with Bgl Ⅱ and Spe I(B)

M. Marker; WT. 野生型非洲紫羅蘭; 1～5. 轉基因非洲紫羅蘭圖6 CfCIN基因的PCR(A)和RT-PCR(B)檢測結果M. Marker; WT. Wild type Saintpaulia ionantha; 1-5. Transgenic S. ionanthaFig.6 PCR (A) and RT-PCR (B) results of CfCIN

A. 野生型與轉化非洲紫羅蘭; B. 野生型(WT)與轉化非洲紫羅蘭葉片(a. 明顯葉脈; b. 缺刻葉緣; c. 卷曲葉緣); C～H.野生型(C～E)和轉化非洲紫羅蘭不同株系(F～H)的開花狀態(tài); I. 野生型(WT)與轉化植株的花器官對比。標尺=1 cm圖7 轉CfCIN基因非洲紫羅蘭葉片和花器官的特征A. Wild type(WT) and transgenic plant; B. Leaf of wild type(WT)and transgenic plants (a. Obvious veins; b. Nicked leaf margin; c. Curly leaf margin); C-H. Flowering of wild type(C, D, E)and transgenic plants(F, G, H); I. Single flower of wild type(WT)and transgenic plants. Bar=1 cmFig.7 Characters of leaf and flower of wild type and transgenic plant in S. ionantha

3 討 論

迄今，已經(jīng)在多個物種中發(fā)現(xiàn)并克隆了TCP結構域基因。作為一個多基因家族，TCP基因家族成員在單子葉和雙子葉植物中分布極其廣泛，推測在進化過程中，各個成員可能在不同時期被招募來控制不同的發(fā)育途徑，從而開始功能的進化，執(zhí)行不同的功能。通過對已有TCP家族基因功能的研究發(fā)現(xiàn)，TCP基因在多種植物中與花器官發(fā)育、腋芽生長和莖葉發(fā)育等過程密切相關，它的不同成員在不同物種中參與了不同形態(tài)發(fā)生和發(fā)育過程[1, 3, 9, 18-20]。本研究從蕙蘭中克隆到一個CIN分支成員CfCIN，僅具有TCP保守區(qū)域，編碼含有386個氨基酸的完整開放閱讀框，綜合氨基酸序列同源性比對及系統(tǒng)進化樹分析，CfCIN與金魚草AmCIN在進化上具有相同的起源，可能同樣具有AmCIN參與調(diào)控植物葉形態(tài)發(fā)生的功能。

目前，CIN分支成員控制葉片形態(tài)發(fā)生的功能已經(jīng)在雙子葉植物如金魚草[13]、擬南芥[14]、番茄[17]中有研究報道，且以在擬南芥中研究最多。在擬南芥中已發(fā)現(xiàn)包含TCP2～5、10、13、17、24等8個CIN成員。其中TCP2～4、10和24等5個成員的編碼區(qū)域都含有miR319作用序列，在miR319的超表達突變體jaw-D中，這5個基因表達量顯著下調(diào)，與野生型相比，突變體表現(xiàn)出葉片褶皺、葉緣卷曲等表型。有趣的是，單獨的過表達TCP2或TCP4沒有表現(xiàn)出明顯的表型，推測是miR319靶序列可以降解這類基因，而對TCP基因內(nèi)部的miR319進行人為突變，阻遏其降解基因的轉錄后，35S:mTCP2、35S:mTCP4表現(xiàn)為杯狀子葉及狹長葉片等表型[14]。Schommer 等[16]也同樣證實了這點，發(fā)現(xiàn)具有miR319靶序列的CIN同源基因的單突變體無明顯的表型，而雙突變體TCP2，TCP4及三突變體TCP2、TCP4、TCP10均具有類似jaw-D的表型，并且突變基因數(shù)量越多，表型越明顯。認為具有靶序列miR319的CIN小組成員受到其強烈調(diào)控，而不具有靶序列miR319的CIN分支基因的單突變體表型明顯[17, 21-22 ]。本研究得到的CfCIN不具有miR319靶序列，沒有受到其強烈調(diào)控，因此在CfCIN過表達的轉基因非洲紫羅蘭植株中，發(fā)現(xiàn)其葉片的大小、形狀及卷曲度均發(fā)生了輕微的改變，但對花型變化影響較小，這與之前研究結果一致。表明CfCIN可能參與調(diào)控蕙蘭葉片形態(tài)建成，但可能需要與其他基因協(xié)同作用，研究結果對深入研究TCP基因的功能及培育葉形性狀改良的花卉新品種具有一定的參考價值。

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(編輯:宋亞珍)

Isolation and Functional Verification ofCfCINinCymbidiumfaberi

LI Yuxia, YANG Yuxia, SUN Yuying, LIU Song, WANG Guangdong*

(College of Horticulture, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China)

Flower bud ofCymbidiumfaberiwas chosen as experiment material for gene cloning. ACIN-like gene of TCP family was amplified through RT-PCR technique and named asCfCIN(GenBank accession number KJ956809). The Open Reading Frame (ORF) ofCfCINis 1 161bp in length and encodes a protein with 386 amino acids. To investigate the specific functions ofCfCIN, we constructed the expression vector and introduced it intoSaintpauliaionanthabyAgrobacterium-mediated method. Phenotypic analysis showed that the leaves of transgenic plants were bigger and changed from circular to oval. Margin of leaves changed from flat and smooth to slightly notched and back curly. Leaf veins were obvious and petioles were redder than wild type plants. There was no obvious difference in flower shape between the transgenic plants and wild type plants. These result indicated thatCfCINmight participate leaf development.

Cymbidiumfaberi;CfCIN; gene cloning; transformation;Saintpauliaionantha

1000-4025(2016)12-2354-07

10.7606/j.issn.1000-4025.2016.12.2354

2016-10-16;修改稿收到日期:2016-12-09

國家自然科學基金(31372101)

李玉霞(1988-), 女, 碩士研究生, 主要從事園林植物與觀賞園藝研究。E-mail: 2011104128@njau.edu.cn

*通信作者:王廣東, 博士, 副教授, 主要從事觀賞植物生物技術研究。E-mail: gdwang@njau.edu.cn

Q785;Q789

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