曹　前

（四川省儀隴縣農(nóng)牧業(yè)局，南充　　637600）

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野生二粒小麥后代LMW-GS編碼基因克隆與序列分析

曹前

（四川省儀隴縣農(nóng)牧業(yè)局，南充637600）

通過(guò)PCR擴(kuò)增的方法，從穩(wěn)定遺傳的野生二粒小麥高世代后代中分離低分子量谷蛋白基因。并且對(duì)核苷酸和氨基酸序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析，以期為探索SNPs變異在遺傳育種中的特性提供參考，為實(shí)現(xiàn)分子層面小麥品質(zhì)育種奠定理論基礎(chǔ)。

小麥 低分子量谷蛋白 基因克隆 序列分析

野生二粒小麥具有高蛋白質(zhì)含量、豐富的貯藏蛋白組成等優(yōu)良性狀，是被期望為全球小麥的可持續(xù)生產(chǎn)貢獻(xiàn)其全方位多樣性的優(yōu)異物種［1］。然而，遺憾的是，其豐富的遺傳多樣性在普通小麥種已被降低達(dá)70%左右［2］。該研究旨在對(duì)野生二粒小麥為父本，栽培小麥為母本的遠(yuǎn)緣雜種高世代，進(jìn)行LMW-GS基因的分子克隆和序列分析，探討野生二粒小麥LMW-GS基因向普通小麥的導(dǎo)入與表達(dá)能力，篩選具有含有野生二粒小麥LMW-GS的遺傳種質(zhì)。

1 材料和方法

1.1 材料

（川農(nóng)16×野生二粒小麥D97）F11的2 n=42的穩(wěn)定株系7-40、7-209；（川農(nóng)16×野生二粒小麥D97）F11與內(nèi)麥9號(hào)雜交F2 的株系Q-F2系列；并以親本川農(nóng)16為對(duì)照。

1.2 方法

采用改進(jìn)2×CTAB方法對(duì)小麥葉片進(jìn)行基因組DNA提?。?］。運(yùn)用基因組DNA的PCR擴(kuò)增、轉(zhuǎn)化、克隆，最后進(jìn)行測(cè)序分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 LMW-GS基因核酸推導(dǎo)與氨基酸序列分析

保守的N-端區(qū)，其基本組成如METSCIPGL，其中SCIPGL部分突變率較高，其決定了小麥LMW-GS屬于何種類(lèi)型，所克隆的基因序列絕大多數(shù)為L(zhǎng)MW-m型，包括亞基型有SCIPGL，SCISGL，PCIPGL，PCHPWL，SHIPSL，SRVPGL等6種， 其 中PCHPWL，SHIPSL，SRVPGL極其罕見(jiàn)；LMW-i型亞基出現(xiàn)1次，未見(jiàn)LMW-s型亞基。從而推導(dǎo)這3種類(lèi)型的LMW-GS谷蛋白亞基在小麥中的分布極不均衡。

重復(fù)區(qū)較長(zhǎng)，多肽類(lèi)型較為豐富，重復(fù)區(qū)不含半胱氨酸。所克隆LMW-GS序列的重復(fù)區(qū)都富含脯氨酸（P）和谷氨酰胺（Q），其主要重復(fù)片段有QQFPQQ、QQQPLFQQ、QQPFSQQQ、QQPPFSQQQ、QQPPFLQQQ、PPFSQQQQ、QQQPSFSQQ、PLFSQQQQ等重復(fù)單元；該區(qū)域的變異程度較高，主要由于重復(fù)單元數(shù)量不同所致，這也決定了LMW-GS基因長(zhǎng)度的變異。

2.2 LMW-GS半胱氨酸殘基（Cys）的數(shù)目及位置

LMW-GS家族成員半胱氨酸殘基（Cys）相對(duì)保守，一般在8個(gè)左右。該研究通過(guò)分析LMW-GS蛋白質(zhì)編碼序列，發(fā)現(xiàn)該26個(gè)基因中半胱氨酸殘基（Cys）特異性變異出現(xiàn)了6個(gè)不同位置共15次由其它氨基酸替換為半胱氨酸（Cys）。發(fā)現(xiàn)了6條具有額外半胱氨酸殘基（Cys），具有9個(gè)半胱氨酸（殘基Cys）的亞基序列；同時(shí)發(fā)現(xiàn)2條半胱氨酸殘基（Cys）缺失型亞基序列，來(lái)自母本CN16，其Cys殘基缺失了1個(gè)。

所獲得的LMW-GS氨基酸序列中，半胱氨酸殘基（Cys）變異在N-端相對(duì)較少，只出現(xiàn)了2個(gè)半胱氨酸殘基（Cys）被替換的序列；而大部分變異出現(xiàn)在信號(hào)肽區(qū)和C-端。其中，在信號(hào)肽區(qū)出現(xiàn)了6個(gè)半胱氨酸殘（Cys）基替換其他氨基酸的序列。C-端最為豐富，主要表現(xiàn)為半胱氨酸（Cys）替換其他氨基酸，如半胱氨酸（Cys）替換甲硫氨酸（M）2個(gè)、半胱氨酸（Cys）替換精氨酸（R）2個(gè)、半胱氨酸（Cys）替換甘氨酸（G）3個(gè)。

3 討論

半胱氨酸殘基（Cys）變異對(duì)小麥品質(zhì)影響的可能性推測(cè)，該研究克隆出的氨基酸序列中，6個(gè)LMW－m型氨基酸序列信號(hào)肽區(qū)第16位為半胱氨酸（C），其余序列為色氨酸（S），其變異極為罕見(jiàn)；在N－端也出現(xiàn)了半胱氨酸（C）向組氨酸（H）和精氨酸（R）的稀有突變；從氨基酸極性和親水性分析雖不影響信號(hào)肽的性質(zhì)，但不能排除Cys殘基在氨基酸聚合時(shí)二硫鍵可能會(huì)對(duì)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)起改變作用，從而影響蛋白質(zhì)構(gòu)造，進(jìn)而可能影響小麥的品質(zhì)。

［1］ gianibelli M C，Larroque O R，MacRichie F，Wrigley C W. Biochemical，genetic，and molecular characterization of wheatglutenin and its component subunits. Cereal Chemstry，2001，（78）：635～646

［2］ Jaradat A. Ecogeography，genetic diversity，and breeding value of wild emmer wheat（Triticum dicoccoides K?rn ex Asch. & Graebn.）Thell. Australian Journal of Crop Science，2011，5，（9）：1 072～1 086

［3］ 顏澤洪. 山羊草屬物種高分子量谷蛋白基因的分子克隆. 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)博士論文，2001