宋達(dá)為黃睿湯慶超馬天翼羅玥琛王貴玉王錫山

?論著?

利用GEO數(shù)據(jù)庫分析結(jié)腸癌中EZH2及其相關(guān)基因的表達(dá)與意義

宋達(dá)為1，2黃睿1，2湯慶超1，2馬天翼1，2羅玥琛1王貴玉1，2王錫山3

目的探討果蠅Zeste基因增強(qiáng)子人類同源物（EZH2）在結(jié)腸癌的表達(dá)情況、評估對結(jié)直腸癌患者預(yù)后的意義，并分析預(yù)測與其相關(guān)的基因及細(xì)胞通路。方法通過GEO數(shù)據(jù)庫下載基因芯片GSE17538數(shù)據(jù)內(nèi)包含232例結(jié)直腸癌病例；結(jié)合R2平臺，篩選出與EZH2表達(dá)顯著相關(guān)的基因并進(jìn)行GO和KEGG通路分析；通過Kaplan-Meier法繪制生存曲線，研究EZH2與患者預(yù)后、生存之間的關(guān)系。結(jié)果232例結(jié)腸癌標(biāo)本中，EZH2的表達(dá)與年齡（χ2=4.426，P=0.035）、AJCC分期（χ2=8.259，P=0.041）和分化程度（χ2=7.301，P=0.026）有關(guān)，與性別（χ2=0.622，P=0.430）無關(guān)。全部檢測出與EZH2表達(dá)顯著相關(guān)基因共4 305個（其中正相關(guān)2 240個、負(fù)相關(guān)2 065個），對GO及KEGG通路分析后發(fā)現(xiàn)其中1 509個相關(guān)基因涉及細(xì)胞周期、RNA的轉(zhuǎn)錄、DNA復(fù)制等多個腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程。Kaplan-Meier法分析，EZH2的表達(dá)與患者的無病生存期有相關(guān)性（P＜0.05）。結(jié)論推測EZH2可成為研究患者預(yù)后的分子標(biāo)志物，為未來深入研究提供參考。

結(jié)直腸腫瘤；基因表達(dá)；EZH2；細(xì)胞周期；基因芯片

結(jié)直腸腫瘤是目前第3常見的惡性腫瘤。根據(jù)中國癌癥統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)，2015年結(jié)直腸癌的發(fā)病率和死亡率均位于第5位，并且發(fā)病率和死亡率均呈逐年上升趨勢［1］。結(jié)直腸癌的發(fā)生與發(fā)展是一個多步驟、多因素的過程。隨著近20年來，以核酸測序?yàn)榇淼母咄拷M學(xué)分析技術(shù)的日趨成熟，結(jié)直腸癌的分子機(jī)制研究取得了巨大的進(jìn)步，其中與表觀遺傳學(xué)相關(guān)的EZH2基因成為了研究的熱點(diǎn)基因之一。

EZH2為多梳蛋白抑制復(fù)合物2（polycomb repressive complex 2，PRC2）的催化活性亞基，位于7號染色體的q35區(qū)，由20個外顯子及19個內(nèi)顯子構(gòu)成［2］。EZH2是多樞基因（PcG）蛋白的重要組成部分，PcG蛋白在胚胎發(fā)育、腫瘤的發(fā)生發(fā)展和干細(xì)胞自我更新等方面有著重要的作用。PcG蛋白由兩個核心蛋白復(fù)合體PRC1和PRC2組成。PRC2屬于組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶，最早是在人類細(xì)胞和果蠅胚胎中純化和命名的。而人類和果蠅PRC2中存在一個十分相似的中央亞基成分，是一個保守的催化亞基，在人類中稱其為EZH2［3］。EZH2可以聯(lián)合多個因子共同協(xié)作，在包括乳腺癌［4］、前列腺癌［5］、胃癌［6］等癌癥形成中起到重要的作用。

本次研究通過提取NCBI中GEO數(shù)據(jù)庫中的數(shù)據(jù)，利用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法及R2分析平臺分析GEO數(shù)據(jù)庫中結(jié)腸癌基因芯片數(shù)據(jù)，對基本臨床信息、生存信息、相關(guān)基因及相關(guān)信號通路進(jìn)行分析。從而為EZH2因子在結(jié)直腸癌的進(jìn)一步研究機(jī)制提供線索和思路。

資料與方法

一、一般材料

從NCBI的GEO數(shù)據(jù)庫（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo）中下載基因表達(dá)譜公共數(shù)據(jù)集GSE17538［7］，此數(shù)據(jù)集為包含EZH2表達(dá)數(shù)據(jù)的人類結(jié)腸腫瘤表達(dá)譜，包括232例結(jié)腸癌樣本。

二、方法

通過提取整理芯片內(nèi)的臨床信息，分析EZH2基因與年齡、性別、腫瘤分期、組織分化程度、生存數(shù)據(jù)之間的關(guān)系?；蛳嚓P(guān)性分析利用R2芯片分析平臺（http://r2.amc.nl）進(jìn)行運(yùn)算，并通過GO及 KEGG通路分析工具對與EZH2相關(guān)的基因和通路進(jìn)行分析。統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件為SPSS 20.0，對于組間比較采用χ2檢驗(yàn)及獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；生存數(shù)據(jù)處理采用Kaplan-Meier法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、EZH2在數(shù)據(jù)集中的基本表達(dá)

數(shù)據(jù)集樣本232例患者中全部包含EZH2表達(dá)信息，按照中位數(shù)，將全部樣本分為高表達(dá)組（n=115）及低表達(dá)組（n=117）。數(shù)據(jù)集的232位患者基本信息如下（表1），經(jīng)過統(tǒng)計(jì)學(xué)分析發(fā)現(xiàn)EZH2的表達(dá)與年齡（χ2=4.426，P=0.035）、AJCC分期（χ2=8.259，P=0.041）和分化程度（χ2=7.301，P=0.026）有關(guān)，與性別（χ2=0.622，P=0.430）無關(guān)。

表1 EZH2基因與臨床信息的相關(guān)性分析（例）

二、EZH2與患者預(yù)后的關(guān)系

利用R2數(shù)據(jù)平臺，通過Kaplan-Meier法進(jìn)行生存分析。結(jié)果顯示（圖1），在數(shù)據(jù)集中EZH2的表達(dá)水平與患者無病生存期顯著相關(guān)（P=0.019），高表達(dá)患者的無病生存期要顯著長于低表達(dá)患者。與患者的總生存時間沒有明顯差異。

圖1 EZH2表達(dá)水平與患者預(yù)后之間的關(guān)系

三、EZH2相關(guān)基因分析

利用R2平臺分析，對232個樣本中的基因芯片結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，全部檢測出與EZH2表達(dá)顯著相關(guān)基因共4 305個（其中正相關(guān)2 240個、負(fù)相關(guān)2 065個），前10正負(fù)相關(guān)基因展示如下（表2）。

表2 與EZH2表達(dá)成正負(fù)相關(guān)的基因

四、基因通路分析

通過KEGG分析，發(fā)現(xiàn)與EZH2相關(guān)的4 305基因中，共有1 650個基因涉及17個信號通路（P＜0.01），主要包括細(xì)胞周期、RNA的轉(zhuǎn)錄、DNA復(fù)制、剪接體形成、蛋白酶體形成等分子機(jī)制，由于涉及基因較多僅列出部分基因（表3）；通過GO分析，EZH2和其相關(guān)基因與細(xì)胞周期、RNA結(jié)合、胚胎發(fā)育等分子機(jī)制有密切的相關(guān)性（表4）。

討 論

結(jié)直腸癌是目前最常見的消化道腫瘤之一。根據(jù)美國癌癥協(xié)會（American Cancer Society，ACS）最新發(fā)布的數(shù)據(jù)，2016年美國的結(jié)直腸癌的預(yù)計(jì)新發(fā)例數(shù)為134 490例，其中男性為70 820例，占男性全部預(yù)計(jì)新發(fā)癌癥例數(shù)的8%，女性為63 670例，占女性全部預(yù)計(jì)新發(fā)例數(shù)的8%。結(jié)直腸癌相關(guān)的預(yù)計(jì)死亡例數(shù)為49 190例，位于所有癌癥死亡例數(shù)的第三位［8］。隨著結(jié)直腸癌發(fā)生、發(fā)展機(jī)制的研究的深入，結(jié)直腸癌治療特異性靶點(diǎn)的研究逐漸成為熱點(diǎn)，其中EZH2基因在近年來引起了研究者的關(guān)注。

EZH2首次發(fā)現(xiàn)是1996年，Hobert等［9］發(fā)現(xiàn)了與果蠅Zeste基因增強(qiáng)子相似的蛋白。2003年Hillier等［10］在研究中證實(shí)人EZH2基因的位置。作為多樞基因核心家族的成員，EZH2可編碼組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶，通過兩種方式介導(dǎo)靶基因的沉默：（1）通過催化H3K27（組蛋白H3賴氨酸27）三甲基化；（2）通過聯(lián)合DNA甲基轉(zhuǎn)移酶，使靶基因CpG島區(qū)DNA甲基化。研究發(fā)現(xiàn)，EZH2在多種腫瘤發(fā)展的生物學(xué)行為中起著重要的作用［11-12］。但是在結(jié)直腸腫瘤的研究中，EZH2基因的作用機(jī)制并不明確，通過生物信息學(xué)的研究，我們可以對EZH2相關(guān)的作用機(jī)制及信號通路，為今后的研究起借鑒作用。

從本次實(shí)驗(yàn)的232樣本中可以看出，EZH2的表達(dá)與年齡、AJCC分期和分化程度有關(guān)，與性別無關(guān)。根據(jù)Kaplan-Meier生存曲線分析，EZH2對于患者的無病生存期有預(yù)測作用，高表達(dá)患者的無病生存期要顯著長于低表達(dá)患者。芯片內(nèi)有32例患者的無病生存信息缺失，可能對結(jié)果有一些影響。但從結(jié)果可以看出，EZH2在結(jié)直腸癌中是一個保護(hù)性因素。但結(jié)果與一些實(shí)驗(yàn)的結(jié)果有沖突，因?yàn)閭鹘y(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為，EZH2在結(jié)直腸癌中呈高表達(dá)，屬致癌基因［13］。在細(xì)胞表型試驗(yàn)中，通過抑制EZH2表達(dá)可以抑制細(xì)胞的遷移及侵襲，抑制細(xì)胞的生長［14］。實(shí)驗(yàn)結(jié)果的原因可能有兩點(diǎn)：（1）由于本芯片數(shù)據(jù)集主要是mRNA水平的檢測，與實(shí)際的蛋白表達(dá)是有差別的；（2）EZH2基因在結(jié)直腸癌進(jìn)展的不同階段所起的作用并不相同。

通過R2平臺分析，在本數(shù)據(jù)集中共包含54 676個基因，檢測出與EZH2表達(dá)顯著相關(guān)基因共4 305個（其中正相關(guān)2 240個、負(fù)相關(guān)2 065個），占所有基因數(shù)的7.8%，這也證明了EZH2在本組數(shù)據(jù)庫樣本人群中，起到了重要關(guān)聯(lián)作用。本文僅分別列出與EZH2正負(fù)相關(guān)的10個基因，為進(jìn)一步研究起到指導(dǎo)作用。之后對這4 305個基因進(jìn)行KEGG分析和GO分析，可以看出，EZH2參與多個生物學(xué)行為過程，包括RNA的轉(zhuǎn)錄、DNA復(fù)制、剪接體形成、蛋白酶體形成、胚胎形成等。從兩種分析方法結(jié)果來看，EZH2及其相關(guān)基因與細(xì)胞周期表現(xiàn)出了密切的相關(guān)性，而其中主要涉及的基因包括CDK家族、ANAPC家族、CDC家族等。2011年Zeng等［15］在研究中發(fā)現(xiàn)CDK1及CDK2可以促進(jìn)EZH2的磷酸化來影響細(xì)胞的分化。2016年，Sun等［16］人的研究顯示，在卵巢癌中抑制EZH2的功能會抑制CDK1及CDK2的表達(dá)。但是目前在結(jié)直腸領(lǐng)域，EZH2與CDK家族之間的相關(guān)研究較少，這為今后研究EZH2相關(guān)機(jī)制提供了思路。

表3 與EZH2相關(guān)基因的KEGG分析

表4 與EZH2相關(guān)基因的GO分析

通過公開平臺基因芯片數(shù)據(jù)分析方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)較傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)方法有數(shù)據(jù)量大、花費(fèi)小的特點(diǎn)，但數(shù)據(jù)信息多為mRNA水平的檢測，所以還需要進(jìn)行蛋白水平的驗(yàn)證。但是通過基因芯片的數(shù)據(jù)分析，可以對課題可行性進(jìn)行初步的探索，預(yù)測結(jié)果并提供理論證據(jù)。本實(shí)驗(yàn)中EZH2的表達(dá)與患者的無病生存期有明顯相關(guān)性，為下一步免疫組化驗(yàn)證提供了參考。綜上所述，EZH2可以作為研究患者預(yù)后的分子標(biāo)志物，為未來的研究提供了新的方向。

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Identification of EZH2-related key pathways and genes in colorectal cancer using bioinformatics analysis.

Song Dawei1,2,Huang Rui1,2,Tang Qingchao1,2,Ma Tianyi1,2,Luo Yuchen1,Wang Guiyu1,2,Wang Xishan3.1The Department of Colorectal Cancer,The Second Affliated Hospital,Harbin Medical University,Harbin 150086,China;2Colorectal cancer research institution,Harbin Medical University,Harbin 150086,China;3Department of Colorectal Surgery,National Cancer Center/Cancer Hospital,Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College,Beijing 100021,China

Wang Xishan,Email:wxshan1208@126.com;WangGuiyu,Email:guiywang@163.com

ObjectiveThe aim of this study was to investigate the prognosis value of the EZH2 expression and signatures during CRC and uncover their potential mechanisms in colorectal cancer.MethodsThe gene expression profles of GSE17538 were downloaded from GEO database.The GSE17 538 data-set contained 232 samples.The data was combined by the R2 platform to search the genes which are associated with a significant expression with EZH2.The gene ontology(GO)and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes pathway(KEGG)enrichment analyses were performed by R2 platform.The surival curves were estimated using the Kaplan-Meier method.ResultsIn 232 cases,the expression of EZH2 in colorectal carcinoma was associated with age(χ2=4.426,P=0.035),AJCC stage(χ2=8.259,P=0.041)and differentiation(χ2=7.301,P=0.026),except for sex(χ2=0.622,P=0.430);In total,4305 genes were identifed which are associated with a signifcant expression with EZH2,including 2240 up-regulated genes and 2065 down-regulated genes.GO analysis and KEGG pathway analysis results showed that these were signifcantly enriched in biological processes ,including proliferation in cell cycle,RNA transcription and DNA replication；Using the Kaplan-Meier method we found the expression of EZH2 is related with diseasefree survival.ConclusionEZH2 could be used as a potential prognostic marker and a therapeutic target in colorectal cancer.

Colorectal neoplasms;Gene expression;EZH2;Cell cycle;Gene microarray

2016-11-20）

（本文編輯：劉正）

10.3877/cma.j.issn.2095-3224.2016.06.004

黑龍江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院科研計(jì)劃項(xiàng)目（No.201504）；哈爾濱醫(yī)科大學(xué)科研基金（No.KYB2015-30）

150086 哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院結(jié)直腸腫瘤外科1；150086 哈爾濱醫(yī)科大學(xué)大腸癌研究所2；100021 北京，國家癌癥中心/中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院腫瘤醫(yī)院結(jié)直腸外科3

王錫山，Email：wxshan1208@126.com；王貴玉，Email：guiywang@163.com

宋達(dá)為,黃睿,湯慶超,等.利用GEO數(shù)據(jù)庫分析結(jié)腸癌中EZH2及其相關(guān)基因的表達(dá)與意義[J/CD].中華結(jié)直腸疾病電子雜志,2016,5(6):475-479.