馬周文，秘一先，魯學(xué)思，廖斌太，郭志強，師尚禮

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 草業(yè)學(xué)院/草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點實驗室/甘肅省草業(yè)工程實驗室/中-美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展研究中心，甘肅 蘭州 730070)

低溫脅迫對紫花苜蓿生理指標(biāo)的影響

馬周文1，秘一先2，魯學(xué)思2，廖斌太2，郭志強2，師尚禮1

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 草業(yè)學(xué)院/草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點實驗室/甘肅省草業(yè)工程實驗室/中-美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展研究中心，甘肅 蘭州 730070)

以俄羅斯雜花苜蓿和3個紫花苜?？购废禐樵囼瀸ο?，通過0℃，4℃低溫脅迫處理，以22℃(室溫)為對照，測定3個紫花苜?？购废登o、葉的可溶性糖(SS)、游離脯氨酸(FP)、丙二醛(MDA)、可溶性蛋白(SP)的含量和超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫梅(CAT)、抗壞血酸地氧化物酶(APX)、谷胱甘肽過氧化物酶(GPX)的活性。以明確低溫脅迫對紫花苜蓿的生理影響，及各項生理指標(biāo)變化有效作用閾值與紫花苜?？购褪苣芰Φ南嚓P(guān)程度，篩選出了對紫花苜蓿抗寒性指示作用較敏感的生理指標(biāo)及其有效作用閾值。結(jié)果表明：溫度閾值上限SS為0℃，F(xiàn)P為4℃，SP為0℃，MDA為4℃，SOD、CAT、APX及GPX活性低溫處理下的變化差異不顯著，表明這些生理指標(biāo)在低溫脅迫時反應(yīng)不敏感。

紫花苜蓿；抗寒性；閾值

紫花苜蓿(Medicagosativa)為豆科苜蓿屬多年生草本，是全世界栽培歷史悠久、面積最大、經(jīng)濟(jì)價值高的牧草，素有“牧草之王”的美稱，其適應(yīng)性廣、產(chǎn)量高、適口性好，可消化粗蛋白質(zhì)含量、維生素含量和動物必須氨基酸含量高，在我國畜牧業(yè)產(chǎn)業(yè)發(fā)展及生態(tài)環(huán)境治理和沙化、退化、鹽漬化治理等方面具有重要作用[1-2]。由于低溫引起的凍害使紫花苜蓿生產(chǎn)蒙受巨大的經(jīng)濟(jì)損失，因此，紫花苜?？购匀醯膯栴}已經(jīng)成為苜蓿產(chǎn)業(yè)發(fā)展的主要制約因素。有研究報道，紫花苜蓿在冬季最低氣溫超過-20℃的地區(qū)越冬困難，易發(fā)生凍害[3]。在我國北方地區(qū)，冬季氣溫偏低，紫花苜蓿易發(fā)生凍害甚至死亡，因而抗寒能力差已成為影響我國北方苜蓿生產(chǎn)的關(guān)鍵問題。

國內(nèi)外對紫花苜蓿在低溫脅迫條件下的抗寒性機理及其應(yīng)用方面的研究日益受到重視，已有研究表明，牧草的耐寒性受多個基因控制，而基因表達(dá)受溫度、光周期和土壤微環(huán)境等環(huán)境因素的影響[4]。近年來，紫花苜蓿抗寒性的研究多集中在對低溫脅迫下各生理指標(biāo)變化來確定其抗寒能力，也有將相關(guān)生理指標(biāo)綜合起來評定植物抗寒性強弱的研究[5-7]。在4 ℃低溫條件下，苜蓿通過維持較高水平的SOD、POD 活性和提高脯氨酸絕對含量等保護(hù)機制來適應(yīng)低溫脅迫，減輕低溫傷害[6]。

為了更加精確地通過抗寒性生理指標(biāo)的有效作用值來評價抗寒性，試驗通過確定各項生理指標(biāo)變化有效作用閾值與紫花苜?？购褪苣芰Φ南嚓P(guān)程度，篩選出對紫花苜?？购灾甘咀饔幂^敏感的生理指標(biāo)及其有效作用閾值。

1 材料和方法

1.1 試驗地概況

試驗于2014年5月21日在甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點實驗室進(jìn)行。

1.2 試驗設(shè)計

1.2.1 試驗材料 試驗材料共4份，其中俄羅斯雜花苜蓿(Medicagovaria)為對照(CK)，抗寒1號品系(M.sativa.cv.AlgidusⅠ)(簡寫為K1)、抗寒2號品系(M.sativa.cv.AlgidusⅡ)(簡寫為K2)、抗寒3號品系(M.sativa.cv.AlgidusⅢ)(簡寫為K3)，均由甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院提供。

1.2.2 試驗設(shè)計 2014年5月21日，使用育苗盆(口徑10 cm，深度9 cm)對供試材料沙培種植，設(shè)置3個溫度處理：22℃(對照，室溫)、4℃、0℃，每處理3次重復(fù)。即2014年6月28日19∶00置于15℃培養(yǎng)箱中進(jìn)行預(yù)冷處理5 h，之后分別在0℃、4℃下進(jìn)行低溫脅迫處理，對照組室溫為22℃，并于19日9∶00開始采集莖、葉鮮樣，所采樣品均用液氮速凍后于-80℃冰箱中保存，用以測定生理指標(biāo)。

1.3 各指標(biāo)的測定

可溶性糖(SS)含量的測定采用蒽酮法參照文獻(xiàn)[8]；游離脯氨酸(FP)含量的測定采用茚三酮法；丙二醛(MDA)含量的測定采用硫代巴比妥酸法參照文獻(xiàn)[9]；可溶性蛋白(SP)含量的測定采用考馬斯亮藍(lán)(G-250)法和酶系統(tǒng)(SOD、POD、CAT、GPX)活性的測定參考文獻(xiàn)[10]的方法。

2 結(jié)果與分析

2.1 低溫脅迫對紫花苜蓿FP含量的影響

低溫脅迫下，供試紫花苜蓿葉的FP含量均高于莖。K2和K3葉FP含量均隨溫度降低而增加，K1和CK葉FP含量均隨溫度降低呈先增加后降低的趨勢。22℃處理下，除K2莖FP含量為0.002 4 μg/g，顯著高于K1(P<0.05)之外，其他紫花苜蓿品系葉中FP含量差異不顯著；在4℃處理下，各紫花苜蓿葉和莖中FP含量較22℃處理均有所增加，葉中以俄羅斯雜花苜蓿(CK)FP含量最高(0.0047 μg/g)，顯著高于K2和K3(P<0.05)；在0℃處理下，各紫花苜蓿品系莖、葉FP含量變化均有差異，K1葉FP含量為0.002 0 μg/g，顯著低于其他紫花苜蓿(圖1)。

2.2 低溫脅迫對紫花苜蓿SP含量的影響

低溫脅迫下，各紫花苜蓿葉SP含量均高于莖。除K3外，其他紫花苜蓿葉SP含量均隨溫度降低而上升，K2和CK莖SP含量均隨溫度降低呈先降低后上升的趨勢，K1 葉和莖的SP含量在各處理間差異不顯著。22℃處理下，SP含量在各紫花苜蓿葉和莖中變化不顯著；在4℃處理下，各紫花苜蓿的SP含量較22℃處均有所增加，以K3葉SP含量最高，為4.919 mg/g，顯著高于K2(P<0.05)，但K2和K3莖中SP含量顯著低于CK；在0℃處理下，K2和CK葉SP含量較高，分別為6.179和5.682 mg/g，但各紫花苜蓿品系間差異不顯著，但K2 和CK葉SP含量顯著高于K1和K3(圖2)。

圖1 低溫脅迫下紫花苜蓿FP含量 Fig.1 Effect of low-temperature stress on FP in Alfalfa

2.3 低溫脅迫對紫花苜蓿SS含量的影響

隨著溫度的不斷降低，各紫花苜蓿葉SS含量均呈先下降后上升的趨勢，莖的SS含量普遍呈上升的趨勢。在22℃處理下，各紫花苜蓿葉SS含量變化不顯著，K3莖SS含量顯著低于其他紫花苜蓿(P<0.05)；在4℃處理下，各紫花苜蓿葉SS含量均低于在22℃和在0℃處理，K3和CK葉SS含量顯著低于K1和K2(P<0.05)，K3莖SS含量最高，但各紫花苜蓿品系莖SS差異不顯著；在0℃處理下，紫花苜蓿葉SS含量為：K2>K3>CK >K1(P<0.05)，莖SS含量以K2最高(圖3)。

圖2 低溫脅迫下紫花苜蓿SP含量Fig.2 Effect of low-temperature stress on SP in Alfalfa

圖3 低溫脅迫下紫花苜蓿SS含量Fig.3 Effect of low-temperature stress on SS in Alfalfa

2.4 低溫脅迫對紫花苜蓿MDA含量的影響

隨著溫度不斷降低，K1葉MDA含量呈先上升后下降的趨勢，K2和K3呈先下降后上升的趨勢，CK呈持續(xù)上升的趨勢；除K3外，各紫花苜蓿莖MDA含量呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢。在22℃處理下，MDA含量在各紫花苜蓿間差異不顯著，以CK葉和K3莖最低，分別為0.155 1和0.199 0 μmol/L；在4℃處理下，以K2葉和莖中MDA含量均最低，但紫花苜蓿品系間差異不顯著；在0℃處理下，K3葉MDA含量為0.302 2 μmol/L，低于其他紫花苜蓿品系，K3莖MDA含量為0.180 9 μmol/L，顯著低于CK(P<0.05)(圖4)。

圖4 低溫脅迫下紫花苜蓿MDA含量Fig.4 Effect of low-temperature stress on MDA in Alfalfa

2.5 低溫脅迫對紫花苜蓿SOD含量的影響

低溫脅迫下紫花苜蓿葉的SOD活性高于莖。各紫花苜蓿葉的SOD活性隨溫度不斷降低呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢，處理間差異不顯著，但除0℃處理的CK葉SOD活性顯著高于22℃處理之外。K1和K2莖SOD活性隨溫度降低而降低，K3反之。其中，在22℃處理下，以CK的SOD活性最高，為393.9 μ/g，高于其他紫花苜蓿品系，紫花苜蓿品系葉和莖SOD活性變化差異不顯著；在4℃處理下，各紫花苜蓿品系葉和莖SOD活性變化差異不顯著；0℃處理較其他處理，SOD活性下降，以K1葉和CK莖SOD活性最低，分別為362.4和292.4 μ/g。

2.6 低溫脅迫對紫花苜蓿CAT含量的影響

低溫脅迫下，紫花苜蓿葉的CAT活性高于莖。CK葉及K2莖CAT活性隨溫度降低而降低，K2和K3葉CAT活性隨溫度降低呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢，K1葉與CK變化趨勢相似，即為先增加后降低的趨勢。在22℃處理下，各紫花苜蓿品系的葉和莖CAT 活性變化差異不顯著；在4℃處理下，K1葉CAT活性為34.29 μ/g/min，顯著高于其他紫花苜蓿品系。但各紫花苜蓿品系莖CAT活性變化差異不顯著；0℃處理下，各紫花苜蓿品系的CAT活性普遍低于22℃處理，但葉和莖CAT 活性變化差異不顯著(圖6)。

2.7 低溫脅迫對紫花苜蓿APX含量的的影響

低溫脅迫下，紫花苜蓿葉的CAT活性低于莖。K1和K3葉及莖的APX活性均隨溫度降低呈先增加后降低的趨勢，CK葉和K2莖APX活性隨溫度降低而升高。各紫花苜蓿品系的APX活性在處理間差異均不顯著。其中，在22℃處理下，以CK葉中APX活性最高，為1.560 μ/g；在4℃處理下，以K1莖APX活性最高，達(dá)4.105 μ/g；在0℃處理下，以K2莖的APX活性最高，達(dá)5.907 μ/g(圖7)。

圖5 低溫脅迫下紫花苜蓿SOD含量Fig.5 Effect of low-temperature stress on SOD in Alfalfa

圖6 低溫脅迫下紫花苜蓿CAT含量Fig.6 Effect of low-temperature stress on CAT in Alfalfa

2.8 低溫脅迫對紫花苜蓿GPX含量的影響

低溫脅迫下，紫花苜蓿葉的GPX活性高于莖。K1，K3和CK葉GPX活性均隨溫度降低呈先降低后上升的趨勢，K3和CK莖GPX活性隨溫度降低而降低。供試紫花苜蓿品系莖GPX活性在各處理間差異不顯著。在22℃處理下，各紫花苜蓿品系間葉和莖GPX活性差異不顯著，以K1葉中GPX活性最高，為2.383 μ/(g·min)；各紫花苜蓿葉的GPX活性在4℃處理時均低于22℃和0℃處理，以K2葉和莖GPX活性最高，分別為0.7917 μ/(g·min)和0.862 0 μ/(g·min)；在0℃處理下，以K1葉和K2莖GPX活性最高，分別為2.054 μ/(g·min)和0.860 3 μ/(g·min)。

圖7 低溫脅迫下紫花苜蓿APX含量Fig.7 Effect of low-temperature stress on APX in Alfalfa

圖8 低溫脅迫下紫花苜蓿GPX含量Fig.8 Effect of low-temperature stress on GPX in Alfalfa

2.9 紫花苜蓿生理指標(biāo)響應(yīng)低溫脅迫的閾值

低溫脅迫對紫花苜蓿的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量影響較大。綜合分析可知，隨溫度的不斷降低，紫花苜蓿的FP、MDA含量在4℃處理下含量增加幅度高于其他溫度處理，故4℃為FP、MDA耐受低溫脅迫的上限值；SS、SP含量在0℃處理下增加幅度高于其他溫度處理，故0℃為SS、SP耐受低溫脅迫的上限值(表1)。試驗中SOD活性、CAT活性及GPX活性隨溫度降低而降低，但低溫脅迫各處理間差異不顯著，表明SOD活性、APX活性及GPX活性指標(biāo)不能作為紫花苜蓿耐低溫的指示指標(biāo)。根據(jù)各材料的葉、莖增幅平均數(shù)得出：SS、SP、FP葉比莖對低溫脅迫更敏感，MDA、SOD、APX、GPX、CAT莖比葉對低溫脅迫更敏感。

3 討論

抗寒性是指植物體長期處在低溫寒冷環(huán)境中通過自身的自然選擇和遺傳變異而產(chǎn)生的抗寒能力。苜蓿對低溫脅迫的響應(yīng)及生理生化適應(yīng)性都是十分復(fù)雜的過程。主要表現(xiàn)在其體內(nèi)一些可溶性物質(zhì)的增加，保護(hù)原生質(zhì)體，使其不致在遇冷時凝固。同時，總脂肪含量、磷脂不飽和脂肪酸的含量也隨之增加，以保護(hù)酶的活性。此外，苜蓿體內(nèi)超常積累活性氧自由基，引起膜脂過氧化導(dǎo)致冷傷害。植物體內(nèi)SOD，CAT和POD等保護(hù)酶系統(tǒng)具有清除活性氧自由基的功能,以減輕活性氧對植物的傷害[11-14]。由于試驗設(shè)置的溫度梯度有限，所以只確定出紫花苜蓿對低溫耐受的敏感指標(biāo)的閾值上限。

表1 紫花苜蓿不同組織生理指標(biāo)響應(yīng)低溫脅迫的增幅

Table 1 Increase of physiological indexes to response to low-temperature stress in different tissues of alfalfa

生理指標(biāo)葉22～4℃/%4～0℃/%平均值/%莖22-4℃/%4～0℃/%平均值/%SSK1-9．0954．3731．7328．687．5218．1K2-4．35170．3587．3519．8331．1225．475K3-17．03263．72140．375102．841．4952．165CK-11．58149．180．34-0．9826．8813．93FPK194．08-44．5169．295216．2513．625K242．4354．6248．525-3．83-33．2218．525K339．5214．7527．1352．96-6．064．51CK123．03-20．4271．72519．06-64．7141．885SPK1643．05-17．66330．3552．35-4．623．485K2131．8799．6115．735-87．61270．98679．29K3208．33-37．19122．76-86．741．2443．99CK2124．1180．041102．075-36．14131．7483．94MDAK1175-11．3693．18112．5111．76112．13K26．6720．8313．7590131．58110．79K3-1011．1110．55525-2826．5CK40128．5784．2853239．3935．695SODK1-4．672．773．72-21．81-3．2612．535K2-0．910．710．81-20．41-2．7511．58K30．48-0．190．335-16．23．439．815CK-4．82-3．324．07-14．081．217．645CATK1119．55-66．1992．87-13．0473．5443．29K2-42．2615．3928．825-36．05-31．8633．955K3-43．7855．149．44-79．39203．4141．395CK-31．26-7．5619．4141．19-35．7838．485APXK139．47-18．829．135235．92-63．58149．75K2-8．9280．7544．835139．21336．92238．065K320．47-21．7921．1321．68-22．9122．295CK4．1722．8213．495-5．415．645．525GPXK1-72．27210．8141．535334．03-30．52182．275K2-43．4-15．7829．59115．38-0．257．79K3-8．11101．5154．81-50．35-39．3544．85CK-69．02100．9284．97-1．07-49．3825．225

3.1 低溫脅迫對紫花苜蓿滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的含量

植物體內(nèi)與抗逆關(guān)系密切的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)主要有游離脯氨酸、可溶性蛋白和可溶性糖[15]。在低溫脅迫下，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)外平衡失調(diào)，滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)可以提高細(xì)胞液濃度，維持滲透壓等，提供生命活動所需要的養(yǎng)分，還可以產(chǎn)生新的功能蛋白、酶和生長激素來抵抗逆境脅迫，相互協(xié)同調(diào)節(jié)內(nèi)環(huán)境，提高植物抗寒性[16]。陶雅等[17]對3個紫花苜蓿品種游離脯氨酸含量動態(tài)變化分析表明，隨著溫度的降低或升高，苜蓿根部游離脯氨酸的含量上升或者下降，證明脯氨酸含量與苜?？购哂邢嚓P(guān)性。試驗表明，紫花苜蓿葉中脯氨酸含量隨著低溫處理時間呈先升高后降低的趨勢，且不同抗寒性品種間出現(xiàn)脯氨酸含量最大值的溫度不同。此外，脯氨酸與抗寒性之間的關(guān)系與所測定器官也有關(guān)。在相同低溫脅迫下，CK葉FP含量增加幅度高，證明CK對細(xì)胞膜透性調(diào)節(jié)能力較強，對滲透脅迫的抵御能力相對較強，其抗寒性相對較強?？扇苄缘鞍状x是反映植物抗寒性的一個重要指標(biāo)，它可以提高細(xì)胞持水力，保護(hù)原生質(zhì)膜結(jié)構(gòu)，提高細(xì)胞液濃度，從而降低冰點，提高植物抗寒性[16]。研究發(fā)現(xiàn)可溶性蛋白含量隨溫度降低而增加，在0℃處理下，SP含量增加幅度高于其他處理，故0℃可作為SP耐受低溫脅迫的上限值。相同低溫脅迫下，K2和CK葉和莖SP增加幅度高，證明這兩種紫花苜蓿對細(xì)胞膜透性調(diào)節(jié)能力較強，對低溫脅迫的抵御能力相對較強，其抗寒性相對較強。

簡令成等[18]研究報道，可溶性糖是植物抗寒初期主要依靠的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，當(dāng)抗寒力進(jìn)一步提高時，可溶性蛋白等其他物質(zhì)才起作用。同時，可溶性糖是光合作用和呼吸作用等生命活動的能源物質(zhì)，它可以增加細(xì)胞的保水能力，調(diào)節(jié)細(xì)胞水勢，降低細(xì)胞質(zhì)冰點，提高植物抗寒能力。研究證明[19-20]，植物受到低溫脅迫會增加可溶性糖總量含量。試驗表明，可溶性糖含量隨溫度降低而上升，其在0℃處理下增加幅高于22℃處理和4℃處理，且相同低溫脅迫下，K2和K3葉的SS含量增加幅度高于其他材料，證明K2和K3對細(xì)胞膜透性調(diào)節(jié)能力較強，對滲透脅迫的抵御能力相對較強，其抗寒性相對較強。

3.2 低溫脅迫對紫花苜?？寡趸富钚缘挠绊?/p>

植物在低溫脅迫環(huán)境下，細(xì)胞膜系統(tǒng)受到損害，活性氧產(chǎn)生和清除的平衡受到破壞，自由基含量過多會影響細(xì)胞組分正常生命活動，保護(hù)酶系統(tǒng)積極響應(yīng)清除過多的自由基；但是隨著脅迫加重，超過保護(hù)酶系統(tǒng)清除能力，植物就會受傷害而死[21]。正常情況下，細(xì)胞內(nèi)的活性氧與防御系統(tǒng)之間保持著平衡[22]。

超氧化物歧化酶和過氧化物酶共同作用，將有毒的自由基活性氧還原成水和氧分子，過氧化氫酶對線粒體和膜脂過氧化產(chǎn)生的活性氧有清除作用。這3 種保護(hù)性酶與植物抗寒性密切相關(guān)，已被研究所證明[23]?？寡趸甘且粋€基本且重要的抗寒指標(biāo)，梁大偉等[24]研究了自然降溫對紅花玉蘭抗寒生理指標(biāo)的影響，結(jié)果表明，隨著溫度的降低CAT，POD和SOD 3 種酶活性逐漸增大，以利于清除體內(nèi)有害物質(zhì)，減輕低溫的傷害。張婷等[25]研究了低溫脅迫對核桃枝條的影響，對包括SOD 和POD 及CAT在內(nèi)的多個指標(biāo)進(jìn)行了測定，結(jié)合相對電導(dǎo)率的變化，得出抗氧化酶可以作為抗寒性評價關(guān)鍵指標(biāo)的結(jié)論。研究表明，抗氧化酶(SOD、CAT、APX、GPX)活性在處理間差異不顯著，說明抗氧化酶系統(tǒng)響應(yīng)低溫脅迫時，反應(yīng)不敏感。

4 結(jié)論

試驗研究表明，紫花苜蓿不同部位的各生理指標(biāo)響應(yīng)低溫脅迫的能力存在差異。紫花苜蓿葉生理指標(biāo)較莖反應(yīng)更敏感。

根據(jù)各生理指標(biāo)的變化趨勢，確定出紫花苜蓿對低溫耐受的敏感指標(biāo)的閾值上限，分別是SS為0℃，F(xiàn)P 4℃，SP為0℃，MDA為4℃。SOD、CAT、APX及GPX活性對低溫脅迫反應(yīng)不敏感。

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The effective physiological response and index thresholds of Medicago sativa to low temperature

MA Zhou-wen1,BI Yi-xian2,LU Xue-si2,LIAO Bin-tai2,GUO Zhi-qiang2,SHI Shang-li1

(CollegeofGrassalandlScience,GansuAgriculturalUniversity/KeyLaboratoryofGrasslandEcosystem，MinistryofEducation/PrataculturalEngineeringLaboratoryofGansuProvince/Sino-U.S.CentersforGrazinglandEcosystemSustainability,Lanzhou730070,China)

UsedMedicagosativasubsp.varia and three varieties of alfalfa (Medicagosativa) as the samples,we measured the SOD,CAT,APX and GPX activities in leaf and stem of these alfalfa under low temperature stress in order to select the available and sensitive index,and physiological threshold of SS,FP,SP,and MDA against the stress.The results showed that the upper temperature threshold of SS,FP,SP,MDA was 0℃,4℃,0℃ and 4℃,respectively.There was no significant difference in SOD,CAT,APX and GPX activities between 0℃and 4℃,indicating that those physiological indexes were not sensitive to low temperature stress.

Medicagosativa;hardiness;threshold value

2015-06-23；

2016-07-06

農(nóng)業(yè)部“牧草種質(zhì)資源保護(hù)(NB2130135)”項目資助

馬周文(1991-)，男，甘肅定西人，在讀本科。 E-mail：2534988508@qq.com 師尚禮為通訊作者。

S 541

A

1009-5500(2016)06-0060-08