王 瓊 肖冬冬 趙陽 周 哲 周 娟 王 忠 張 明 盧慕峻

皮下預(yù)制膀胱脫細(xì)胞基質(zhì)-絲素蛋白雙層支架修復(fù)大鼠膀胱的實驗研究

王 瓊 肖冬冬 趙陽 周 哲 周 娟 王 忠 張 明 盧慕峻

目的觀察膀胱脫細(xì)胞基質(zhì)-絲素蛋白（Bladder acellular matrix graft-silk fibroin，BAMG-SF）雙層支架經(jīng)皮下預(yù)制處理后，修復(fù)大鼠膀胱擴(kuò)大術(shù)后膀胱缺損的效果。方法取BAMG-SF置于大鼠皮下，分別經(jīng)1 d、3 d、7 d和14 d后，行組織學(xué)染色，評價其體內(nèi)情況；實驗分4組：單純BAMG-SF組，BAMG-SF皮下預(yù)制3 d組、預(yù)制7 d組、預(yù)制自體組織組（BAMG-SF皮下預(yù)制7 d后去除BAMG-SF，保留周圍結(jié)締組織），分別修復(fù)大鼠膀胱擴(kuò)大術(shù)模型，術(shù)后4周行HE、Masson及相關(guān)免疫組化染色，評價其修復(fù)情況。結(jié)果皮下預(yù)制7 d，即有大量細(xì)胞長入；皮下預(yù)制14 d，材料可被自身組織包裹；皮下預(yù)制3 d組的血管及肌肉修復(fù)程度均優(yōu)于其他組，自體組織組未見結(jié)石形成。結(jié)論BAMG-SF雙層支架材料可用于膀胱缺損修復(fù)，皮下預(yù)制3 d組織修復(fù)效果最好，而自體組織組可以避免結(jié)石形成。

膀胱脫細(xì)胞基質(zhì)絲素蛋白皮下預(yù)處理膀胱擴(kuò)大術(shù)模型

由腫瘤、結(jié)核等原因引起的膀胱大面積缺損一直是臨床的難題。胃腸道替代膀胱是目前最常用的方法，該方法不僅造成供區(qū)的創(chuàng)傷，也存在著諸多并發(fā)癥。近年來，隨著組織工程技術(shù)的發(fā)展，大量人工合成材料已用于修復(fù)大面積膀胱缺損[1-4]。通過物理交聯(lián)方法可將來源于膀胱的膀胱黏膜下脫細(xì)胞基質(zhì)（Bladder acellular matrix graft，BAMG）和來源于蠶繭繅絲絲素蛋白（Silk fibroin，SF）復(fù)合為膀胱脫細(xì)胞基質(zhì)-絲素蛋白（Bladder acellular matrix graftsilk fibroin，BAMG-SF）雙層支架，其中BAMG為去除細(xì)胞、抗原等成分的膀胱組織，其表面光滑，結(jié)構(gòu)相對致密，有利于尿路上皮貼附，且能有效阻止尿液滲透至腹腔；而SF結(jié)構(gòu)疏松，孔隙性大，且具有良好的柔韌性、緩釋性等，有利于周圍細(xì)胞的長入[5]。BAMG-SF作為一種新的支架，已被證明可以用于大面積膀胱缺損修復(fù)[6]，但其修復(fù)過程中存在形成過多膀胱結(jié)石等問題仍無法得到解決。將生物材料腹腔內(nèi)預(yù)制后可以明顯增加膀胱修復(fù)過程中血管和肌肉的修復(fù)，但材料腹腔預(yù)制過程復(fù)雜，且花費時間長，是其明顯的缺陷[1]。

本實驗中，我們將BAMG-SF先行皮下預(yù)制，皮下預(yù)制不同時間后取出，進(jìn)行組織學(xué)分析，觀察材料體內(nèi)預(yù)處理后的情況；對比單純BAMG-SF支架、皮下預(yù)處理不同時間的BAMG-SF、BAMG-SF預(yù)制取出后的周圍自體組織修復(fù)大面積膀胱缺損的差異，以期得到膀胱修復(fù)更有效的實驗條件，以及減少結(jié)石形成的方法。

1 材料與方法

1.1 材料

BAMG取自3月齡豬膀胱，新鮮膀胱用PBS沖洗3遍，去除膀胱周圍脂肪及結(jié)締組織，機(jī)械方法去除膀胱黏膜層肌層及漿膜層，僅留下黏膜下層；PBS清洗3遍，十二烷基硫酸鈉（Sodium dodecyl sulfate，SDS）室溫下震蕩洗滌2 d，0.2%TritonX-100室溫下震蕩脫細(xì)胞處理7 d后，75%乙醇內(nèi)儲存?zhèn)溆?；SF由上海交通大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院由蠶繭中提取，將蠶繭裁剪為1 cm×1 cm大小后置于90℃、0.5%碳酸鈉溶液中1 h去除絲膠，60℃飽和溴化鋰溶液中直至絲素完全溶解，透析袋中透析3 d后得到絲素溶液。

1.2 方法

1.2.1 BAMG-SF雙層支架的制備及掃描電鏡觀察

將脫細(xì)胞處理后的BAMG經(jīng)雙蒸水沖洗10余遍后，鋪在六孔板底部，將配好的絲素蛋白溶液（2% w/v）滴在BAMG上，厚度約3 mm，物理加熱法交聯(lián)，-20℃凍干后得到BAMG-SF雙層支架。將雙層支架裁剪成10 mm×10 mm大小，環(huán)氧乙烷消毒后備用。BAMG-SF噴金處理后，掃描電鏡觀察。

1.2.2 實驗動物及分組

16只4周齡SD雄性大鼠（上海交通大學(xué)附屬第九人民醫(yī)院實驗動物中心提供），其中4只用于皮下預(yù)制，觀察不同預(yù)處理時間后BAMG-SF的包裹情況，余12只平均分為4組：單純BAMG-SF組，皮下預(yù)制3 d組，皮下預(yù)制7 d組，皮下預(yù)置7 d后去除BAMF-SF的自體組織組。

1.2.3 皮下預(yù)處理

大鼠腹腔麻醉，俯臥位，備皮消毒后，背部1 cm長切口，血管鉗分離皮膚與皮下組織，將消毒好的BAMF-SF的SF面朝上置于大鼠皮下，5-0聚丙烯線縫合切口。皮下預(yù)制1 d、3 d、7 d及14 d后，取出BAMG-SF及周圍組織行組織學(xué)檢察。

1.2.4 材料的選擇與預(yù)處理

單純BAMG-SF組：環(huán)氧乙烷消毒后備用即可；皮下預(yù)制3 d組：BAMG-SF皮下預(yù)制3 d后，麻醉大鼠，切開背部皮膚，完整游離并取出BAMG-SF及其周圍組織，剪刀去除SF面多余的脂肪及結(jié)締組織，保留最近SF面的一層光滑的膠原纖維，4℃生理鹽水充分清洗后備用，常規(guī)5-0聚丙烯線縫合皮膚及皮下組織；皮下預(yù)制7 d組：按照上述方法皮下預(yù)制BAMG-SF 7 d；預(yù)制自體組織組：按照上述方法得到皮下預(yù)制7 d的被膠原纖維完全包裹的BAMG-SF后，輕輕切開，暴露出組織內(nèi)的BAMGSF，去除BAMG-SF及SF面膠原纖維，僅保留BAMG面單層膠原纖維，充分清洗后備用。

1.2.5 鼠膀胱擴(kuò)大術(shù)模型

麻醉大鼠，仰臥位，備皮消毒，切開下腹部皮膚，切口約1 cm，鈍性分離皮下組織及腹直肌，暴露膀胱，沿膀胱體部切去約40%～60%膀胱，正方形BAMG-SF以BAMG面朝膀胱內(nèi)腔（皮下3 d及7 d組亦BAMG面朝內(nèi)，自體組織組以膠原纖維較光滑面朝內(nèi)），5-0聚丙烯線將正方形材料四角與膀胱四角縫合固定以標(biāo)記修復(fù)區(qū)域，8-0可吸收線連續(xù)縫合材料與膀胱間缺口，由尿道向膀胱內(nèi)注射生理鹽水，明確無滲漏現(xiàn)象后關(guān)閉腹腔，常規(guī)縫合。

1.2.6 組織學(xué)及免疫學(xué)觀察

將皮下預(yù)制1 d、3 d、7 d及14 d的BAMG-SF及其周圍組織取出后，多聚甲醛固定過夜，浸蠟，包埋后石蠟切片，HE及Masson染色評價材料細(xì)胞長入及包裹情況。將4組修復(fù)后膀胱于4周后取出，HE及Masson染色評價大體修復(fù)情況，CD34、α-SMA及SM22免疫組化染色評價血管修復(fù)及肌肉修復(fù)情況，每只膀胱切片選取6個視野，Image-Pro Plus6.0對每張照片進(jìn)行分析，每張照片陽性面積占總面積的比例即為陽性面積百分比，計算平均值，組內(nèi)及組間統(tǒng)計學(xué)差異分析。

1.2.7 結(jié)石成分分析

將修復(fù)4周后形成的膀胱結(jié)石送至上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院，應(yīng)用LIIR型紅外光譜自動分析系統(tǒng)，依據(jù)譜圖中的峰位、峰強(qiáng)和峰形對結(jié)石進(jìn)行成分鑒定。用蒸餾水將結(jié)石標(biāo)本沖洗干凈，室溫干燥后稱取重量，然后將結(jié)石粉碎成粒徑適宜的粉末，取適量粉末與光譜純KBR粉末按照1∶50的比例混合后研磨成粉狀，紅外光譜壓片法將粉末壓成1 mm的透明薄片，以分析儀進(jìn)行掃描分析。

1.2.8 統(tǒng)計學(xué)分析

SPSS l7.0軟件行統(tǒng)計學(xué)分析。數(shù)據(jù)以（x±s）表示。實驗組與對照組血管和肌肉修復(fù)的比較，采用t檢驗及方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 BAMG-SF大體觀及電鏡下觀

制備的BAMG-SF雙層支架外觀呈白色，SF面為疏松樣多孔隙結(jié)構(gòu)，BAMG面為致密樣層狀結(jié)構(gòu)。掃描電鏡觀察示SF孔徑為150 μm左右（圖1）。

圖1 BAMG-SF支架材料大體觀及掃描電鏡觀察Fig.1Gross and SEM observation of BAMG-SF

2.2 皮下預(yù)制后組織學(xué)觀察

BAMG-SF皮下預(yù)制1 d時僅SF面有部分細(xì)胞長入，支架內(nèi)部未見明顯細(xì)胞長入，BAMG面光滑（圖2A、E）；皮下預(yù)制3 d時不僅有大量細(xì)胞長入SF層，而且有一層藍(lán)色膠原纖維包裹SF面，支架內(nèi)部有細(xì)胞長入，但量較少，BAMG面光滑（圖2B、F）；皮下預(yù)制7 d時大量細(xì)胞長入SF面及支架內(nèi)部，SF面及BAMG面均被一層藍(lán)色膠原纖維包裹，且材料較前有所收縮（圖2C、G）；皮下預(yù)制14 d時大量細(xì)胞長入支架內(nèi)部，SF面及BAMG面被自身組織包裹，此組織既有藍(lán)色膠原纖維成分，又有紅色其他組織成分，此時材料較前明顯出現(xiàn)收縮（圖2D、H）。

圖2 皮下預(yù)制不同時間后組織學(xué)觀察Fig.2Histological observation of different time pretreated BAMG-SF

2.3 膀胱擴(kuò)大術(shù)及術(shù)后大體觀

各組修復(fù)4周后取材，除自體組織組外，其他組均有不同程度的結(jié)石形成，尤以7 d組為著（圖3）。

圖3 自體組織組膀胱擴(kuò)大術(shù)及術(shù)后大體觀Fig.3Bladder augmentation model of autologous group and gross observation 4 weeks after surgery

2.4 結(jié)石成分分析

通過紅外線光譜分析，3組結(jié)石成分均為六水磷酸銨鎂，屬于感染性結(jié)石，說明結(jié)石的形成與炎癥反應(yīng)有密切聯(lián)系（圖4）。

圖4 紅外光譜結(jié)石成分分析Fig.4Component analysis of calculus using infra-red spectrum

2.5 組織學(xué)及免疫學(xué)觀察

各組修復(fù)4周后，尿路上皮均有不同程度的修復(fù)。Masson染色發(fā)現(xiàn)，皮下7 d組修復(fù)區(qū)域僅藍(lán)色膠原纖維修復(fù)，而其他組尤其是修復(fù)邊緣區(qū)域還有一定程度的紅色肌肉樣組織成分再生（圖5）。

A-D：HE染色；E-H：Masson染色；A、E：單純BAMG-SF組；B、F：皮下預(yù)制3 d組；C、G：皮下預(yù)制7 d組；D、H：自體組織組（AH標(biāo)尺：2 mm；紅箭頭：修復(fù)邊緣區(qū)域；黑箭頭：修復(fù)中心區(qū)域）A-D:HE staining;E-H:Masson staining;A,E:simple BAMG-SF group(control group);B,F:3 days group;C,G:7 days group;D, H:autologous group(bar of A-H:2 mm;red arrow:marginal area of reconstruction;black arrow:centre area of reconstruction)

圖6 血管及平滑肌再生的免疫組化評價Fig.6Immunohistochemical evaluations of blood vessel and smooth muscle regeneration

CD34免疫組化發(fā)現(xiàn)3 d組的血管修復(fù)明顯優(yōu)于其他各組（P＜0.01），而其他各組間無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。SM22免疫組化（肌樣細(xì)胞）和α-SMA免疫組化（肌樣細(xì)胞及肌成纖維細(xì)胞）發(fā)現(xiàn)，在修復(fù)中心區(qū)域，各組間SM22的表達(dá)無明顯差異（P＞0.05），而α-SMA的表達(dá)單純支架組與皮下7 d組明顯高于另兩組（P＜0.01）；單純支架組和皮下7 d組，與皮下3 d組和自體組織組之間無顯著差異（P＞0.05）；在修復(fù)邊緣區(qū)域，各組間α-SMA的表達(dá)沒有統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05），而SM22的表達(dá)皮下3 d組明顯高于其他3組（P＜0.01），自體組織組與單純支架組之間無明顯差異（P＞0.05），但高于皮下7 d組（P＜0.01）。同組之間不同區(qū)域陽性表達(dá)比較發(fā)現(xiàn)，僅皮下3 d組和皮下7 d組的邊緣區(qū)域與中心區(qū)域SM22表達(dá)有明顯差異（P＜0.01）；各組同組之間不同區(qū)域內(nèi)的α-SMA的表達(dá)均沒有統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）（圖6）。

3 討論

在組織工程研究中，膀胱修復(fù)一直以來是一大難題。多種人工材料及生物材料包括殼聚糖、膀胱黏膜下基質(zhì)，小腸黏膜下基質(zhì)等的應(yīng)用改善了膀胱修復(fù)的效果[7-9]。如何在最短的時間內(nèi)達(dá)到最好的修復(fù)效果，以及如何減少因機(jī)體對材料的排異而引起的結(jié)石形成，是組織工程膀胱修復(fù)實驗中需要不斷探索的問題。

BAMG-SF是一種新的復(fù)合支架，我們的前期實驗已證明其具有膀胱修復(fù)的可行性[6]。該材料的BAMG面結(jié)構(gòu)致密，具有很高的防水性，能夠促進(jìn)尿路上皮的快速長入[4]，SF面為多孔隙樣結(jié)構(gòu)，有益于周圍細(xì)胞長入，促進(jìn)組織修復(fù)[8]。我們已證明BAMG體內(nèi)預(yù)制7 d后其包裹物為肌成纖維細(xì)胞（Myofibrolast）[1]，肌成纖維細(xì)胞是含有肌動蛋白、肌球蛋白等肌肉蛋白的成纖維樣細(xì)胞，具有分泌細(xì)胞外基質(zhì)及收縮的功能，參與傷口的收縮及纖維化，其α-SMA染色陽性[10-11]，SM22α是一種新型的細(xì)胞分化標(biāo)記物，編碼一種22 KDa的收縮調(diào)節(jié)蛋白，作為一種肌動蛋白相關(guān)蛋白參與細(xì)胞骨架的形成和血管重塑[12-13]，尚無證據(jù)表明其表達(dá)于肌成纖維細(xì)胞[14]。因此，本實驗中，我們通過形態(tài)學(xué)觀察及兩種免疫染色將肌樣細(xì)胞與肌成纖維細(xì)胞區(qū)分，鏡下觀呈層狀排列的為肌成纖維細(xì)胞，而片狀排列的為肌樣細(xì)胞，α-SMA染色陽性的為肌層纖維細(xì)胞或較不成熟的肌樣細(xì)胞，SM22α染色陽性的提示為較為成熟的肌樣細(xì)胞。另外，由于肌成纖維細(xì)胞細(xì)胞的收縮性，研究發(fā)現(xiàn)長期膀胱修補后出現(xiàn)材料收縮的現(xiàn)象[1，6]。

本實驗中，我們探究了修復(fù)相同時間下不同預(yù)制條件的膀胱修復(fù)效果，發(fā)現(xiàn)除自體組外，其他組均有結(jié)石形成，且為感染性結(jié)石。感染性結(jié)石形成的必要條件是解脲酶微生物對尿素的分解，此過程產(chǎn)生的氨和二氧化碳，升高了尿液pH值，而不斷形成結(jié)石和結(jié)晶，細(xì)菌本身就成為結(jié)石的核[15]。BAMG-SF作為生物可降解材料，不可避免地會引起炎癥反應(yīng)，早期為嗜酸性粒細(xì)胞浸潤，后期為巨噬細(xì)胞浸潤，巨噬細(xì)胞不斷溶解、吞噬材料而逐漸將材料降解[6]，但自體組織則有效地規(guī)避了異物炎癥反應(yīng)。因此，我們認(rèn)為結(jié)石的形成與炎癥反應(yīng)存在一定的關(guān)系，與文獻(xiàn)報道相似[2，16]，而BAMG-SF的存在是引起原位炎癥反應(yīng)的重要原因[17-18]，可能由于炎癥細(xì)胞浸潤改變了尿液環(huán)境，促進(jìn)了結(jié)石形成，但仍需進(jìn)一步驗證。

在組織修復(fù)方面，我們發(fā)現(xiàn)各組均有較為理想的尿路上皮的修復(fù)，但在血管及肌肉修復(fù)方面存在一定的差異。在血管修復(fù)方面，3 d組血管的密度及直徑明顯要高于其他各組，而其他各組間無明顯差異，說明皮下預(yù)制3 d更有益于血管修復(fù)。在肌肉修復(fù)方面,同組之間，BAMG-SF組與自體組織組的邊緣區(qū)與中心區(qū)的修復(fù)無統(tǒng)計學(xué)差異，可以認(rèn)為其中心區(qū)和邊緣區(qū)肌層修復(fù)存在同步性，而3 d組邊緣區(qū)的SM22α修復(fù)要好于中心區(qū)域，說明其邊緣區(qū)肌層的修復(fù)要先于中心區(qū)，而7 d組邊緣區(qū)的SM22修復(fù)程度明顯要低于中心區(qū)，說明其中心區(qū)肌層修復(fù)要先于邊緣區(qū)，所有組內(nèi)邊緣區(qū)和中心區(qū)α-SMA表達(dá)均無明顯差異，說明肌層纖維細(xì)胞的長入不存在差別；組間比較發(fā)現(xiàn)，在邊緣區(qū)3 d組肌層SM22修復(fù)明顯高于其他各組，以7 d組最差；α-SMA染色發(fā)現(xiàn)各組肌成纖維細(xì)胞長入并無統(tǒng)計學(xué)差異，在中心區(qū)各組間肌層SM22修復(fù)沒有統(tǒng)計學(xué)差異，而α-SMA染色發(fā)現(xiàn)，BAMG-SF組與7 d組的肌成纖維細(xì)胞長入要高于另兩組，3 d組與自體組之間不存在統(tǒng)計學(xué)差異，也就是說BAMG-SF及7 d組在遠(yuǎn)期修復(fù)過程中可能會出現(xiàn)較為顯著的修復(fù)區(qū)域收縮現(xiàn)象。我們認(rèn)為，3 d組的肌層修復(fù)在中心區(qū)陽性表達(dá)率上與其他組無明顯差異，但從形態(tài)學(xué)上已經(jīng)出現(xiàn)片狀肌樣結(jié)構(gòu)，在邊緣區(qū)無論在形態(tài)學(xué)上抑或陽性表達(dá)率上,其修復(fù)效果均明顯優(yōu)于其他組；另外，肌成纖維細(xì)胞的浸潤在d天組和自體組明顯少于另兩組，或?qū)⒂欣谶h(yuǎn)期膀胱修復(fù)，減少修復(fù)區(qū)域的收縮，仍需進(jìn)一步實驗證明。

本實驗結(jié)果表明，在修復(fù)4周時，BAMG-SF雙層支架材料可用于膀胱修復(fù)，皮下預(yù)制3 d組血管及肌肉修復(fù)效果最好，且能在一定程度上減少肌成纖維細(xì)胞浸潤，而預(yù)制自體組織組可能通過減少炎癥反應(yīng)而避免結(jié)石形成。

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A Study on the Repair of Bladder by Pro-Producing Bladder Acellular Matrix Graft-Silk Fibroin in Rats

WANG Qiong1,XIAO Dongdong1,ZHAO Yang1,ZHOU Zhe1,ZHOU Juan1,WANG Zhong1,ZHANG Ming1,LU Mujun2.1 Department of Urology,Shanghai Ninth People's Hospital,Shanghai Jiaotong University School of Medicine,Shanghai 200011,China;2 Department of Urology and Andrology,Shanghai Renji Hospital,Shanghai Jiaotong University School of Medicine,Shanghai 200001,China.Corresponding author:LU Mujun(E-mail:lumujun@163.com);ZHANG Ming(E-mail:zhangm4911@163.com).

ObjectiveTo observe the role of subcutaneous pretreated bladder acellular matrix graft-silk fibroin(BAMG-SF) for bladder reconstruction in a rat bladder augmentation model.MethodsAfter BAMG-SF was implanted subcutaneously for 1 day,3 days,7 days and 14 days in 4 four-week-old female Sprague Dawley rat,the scaffold and tissues around it were harvested for histology evaluation.Set 4 groups(n=3):simple BAMG-SF(control group),BAMG-SF 3 days subcutaneous precondition(3 days group),BAMG-SF 7 days subcutaneous precondition(7 days group)and the autologous tissue around BAMG-SF 7 days subcutaneous precondition(autologous group).All groups were used to reconstruct bladder in a rat bladder augmentation model,the bladder was harvested for histology and immunology evaluation 4 weeks later.ResultsAfter BAMG-SF implanted subcutaneously for 7 days,a large number of cells were observed in BAMG-SF.After BAMG-SF implanted subcutaneously for 14 days,BAMG-SF was covered by autologous tissue.The reconstruction of vascular and muscle in 3 days group were better than other groups,only the autologous group had no stone found.ConclusionBAMGSF can be used for bladder repair,3-day group has the best effect on bladder reconstruction and autologous group can avoid stone formation effectively.

Bladder acellular matrix graft;Silk fibroin;Subcutaneous pretreatment;Bladder augmentation model

Q813.1+3

A

1673－0364（2016）06－0335－05

2016年8月30日；

2016年10月24日）

10.3969/j.issn.1673-0364.2016.06.002

國家自然科學(xué)基金項目（81370860）；上海交通大學(xué)“多學(xué)科交叉項目培育（醫(yī)工）”（YG2015QN02）。

200011上海市上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院泌尿外科（王瓊，肖冬冬，趙陽，周哲，周娟，王忠，張明）；200001上海市上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院泌尿外科（盧慕峻）。

盧慕峻（E-mail：lumujun@163.com），張明（E-mail：zhangm4911@163.com）。

注：王瓊，肖冬冬為共同第一作者。