楊　柳，陳宇飛（吉林工商學(xué)院食品工程學(xué)院，吉林長(zhǎng)春130507）

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環(huán)導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（LAMP）技術(shù)在奶牛常見疾病診斷中的應(yīng)用

楊柳，陳宇飛
（吉林工商學(xué)院食品工程學(xué)院，吉林長(zhǎng)春130507）

奶牛養(yǎng)殖業(yè)作為新興產(chǎn)業(yè)和朝陽(yáng)產(chǎn)業(yè)，得到了快速發(fā)展，與此同時(shí)，奶牛各類疾病發(fā)病率尤其是普通病的發(fā)病率居高不下，嚴(yán)重影響著我國(guó)奶牛業(yè)的健康發(fā)展和乳品安全。徐孝宙等[1]對(duì)奶牛的疾病進(jìn)行調(diào)查研究，發(fā)現(xiàn)乳房炎、子宮內(nèi)膜炎、腐蹄病發(fā)病率高，為奶牛3大常見疾病。王君偉等[2]研究發(fā)現(xiàn)，在各種奶牛傳染病中，布?。ú剪斁。┡c結(jié)核病危害最為嚴(yán)重。

目前，奶牛疾病診斷常用的方法有細(xì)菌分離及生化鑒定法、免疫膠體金法等傳統(tǒng)檢測(cè)方法和PCR分子生物學(xué)檢測(cè)法[3-5]。傳統(tǒng)的細(xì)菌分離及生化鑒定法培養(yǎng)要求高，診斷難度大，所需時(shí)間長(zhǎng)；RCR檢測(cè)方法雖然敏感度較高，但是需要依賴昂貴復(fù)雜的精密儀器，難以在條件較差的基層推廣普及應(yīng)用[6]。因此，建立一種快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確的奶牛疾病診斷技術(shù)十分重要。

本文針對(duì)環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)在奶牛5種常見疾病診斷中的應(yīng)用情況進(jìn)行綜述，分析環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）技術(shù)在奶牛常見疾病診斷中應(yīng)用的優(yōu)勢(shì)，旨在為L(zhǎng)AMP技術(shù)在奶牛疾病診斷中更深入的應(yīng)用提供一定的參考。

1　環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)簡(jiǎn)介

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（loop-mediated isothermal am?plification，LAMP）是Notomi等在2000年建立的一種新的體外擴(kuò)增特異DNA片段的分子生物學(xué)技術(shù)[7]。

LAMP技術(shù)是在65℃恒溫條件下進(jìn)行核酸快速擴(kuò)增，利用兩條特異性內(nèi)引物和兩條特異性外引物識(shí)別靶基因上的六個(gè)區(qū)域，其DNA聚合酶具有鏈置換活性，幾十分鐘即可完成核酸擴(kuò)增[8]。

2　LAMP技術(shù)在奶牛常見疾病診斷中的應(yīng)用

2.1乳房炎診斷奶牛乳房炎是世界奶牛養(yǎng)殖業(yè)中發(fā)病率最高、流行最快，造成損失最大的疾病之一，在奶牛泌乳期發(fā)病率高達(dá)78%以上[9]。該病是由奶牛乳腺組織受到物理、化學(xué)、微生物刺激所發(fā)生的一種炎性反應(yīng)。主要影響奶牛泌乳機(jī)能，可導(dǎo)致產(chǎn)奶量減少，乳品質(zhì)下降。乳房炎的預(yù)防與治療難度很大，原因主要在于其致病菌的多樣性和易感牛、病原、環(huán)境之間的相互作用。

賀婷等[10]應(yīng)用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，建立了鏈球菌性乳房炎LAMP可視化檢測(cè)方法，對(duì)鏈球菌檢測(cè)的敏感性最高達(dá)到52 fg/μf，是普通PCR方法的10倍。

彭清潔等[11]以FIP、BIP為內(nèi)引物，以F3、B3為外引物對(duì)牛支原體DNA進(jìn)行恒溫?cái)U(kuò)增，建立了牛支原體引起奶牛乳房炎的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增方法，給牛支原體病的臨床診斷帶來(lái)了極大的方便。

2.2子宮內(nèi)膜炎診斷奶牛子宮內(nèi)膜炎是最常見的一種奶牛生殖器官疾病，是造成奶牛不孕不育的主要因素之一，是降低奶牛飼養(yǎng)戶利益的重要原因，是制約奶牛事業(yè)發(fā)展的大敵。

奶牛子宮內(nèi)膜炎現(xiàn)檢出的主要病原菌包括化膿性鏈球菌、大腸桿菌、葡萄球菌、變形桿菌、乳鏈球菌、綠膿桿菌、化膿性棒狀桿菌等。

唐婕等[12]建立了能引起多種動(dòng)物，如豬、牛、羊、禽和人類感染，出現(xiàn)乳房炎、子宮內(nèi)膜炎的化膿隱秘桿菌，曾被稱為化膿棒狀桿菌、化膿放線菌的LAMP檢測(cè)方法。

2.3腐蹄病診斷奶牛腐蹄病是一種急性高度接觸性傳染病，發(fā)生在反芻動(dòng)物趾間，患有腐蹄病的奶牛通常表現(xiàn)為精神萎靡、食欲減退、產(chǎn)奶量下降，嚴(yán)重者將會(huì)面臨淘汰。奶牛腐蹄病占奶牛疾病的40%以上，患腐蹄病奶牛的淘汰率占總淘汰率的19%，因此加強(qiáng)該病的預(yù)防尤為重要[13]。

多數(shù)學(xué)者認(rèn)為，奶牛腐蹄病的主要病原體是壞死桿菌和節(jié)瘤擬桿菌，該病的發(fā)生主要是由壞死桿菌和節(jié)瘤擬桿菌共同感染而引起的[14]。

Sun[15-17]等利用白細(xì)胞毒素基因作為擴(kuò)增靶基因，建立了檢測(cè)奶牛腐蹄病壞死桿菌的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增方法（Fn-LAMP）和節(jié)瘤擬桿菌環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增方法（Dn-LAMP）。

兩種方法不需特殊的儀器和昂貴的檢測(cè)試劑，在電子恒溫水浴鍋內(nèi)1 h即可完成奶牛腐蹄病壞死桿菌和節(jié)瘤擬桿菌的檢測(cè)，結(jié)果肉眼可見。Fn-LAMP和Dn-LAMP檢測(cè)能力為1 CFU/ mL，與PCR法相比，符合率為92.0%。研究結(jié)果顯示，F(xiàn)n-LAMP和Dn-LAMP給合可用于奶牛腐蹄病的流行病學(xué)調(diào)查。

2.4布魯菌病診斷布魯菌病是重要人獸共患慢性傳染病[17]，被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）列為必須通報(bào)的傳染病之一，我國(guó)將其列為二類動(dòng)物疫病[2]。

許鄒亮等[18]建立了布魯菌環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增可視化檢測(cè)方法，該方法最低檢出限為17 fg，與B4/ B5PCR方法進(jìn)行比較，這兩種方法的結(jié)果符合率為85.0%，且LAMP方法的敏感性高于B4/B5PCR。

藺國(guó)珍[19]建立了布魯菌快速檢測(cè)LAMP方法，從奶樣和血樣中檢出6個(gè)種的布魯菌病原，所能檢測(cè)出的最低限度為9 fg/μL，較PCR方法高出10倍。

2.5結(jié)核病診斷奶牛結(jié)核病是由分支桿菌屬牛分枝桿菌引起的一種慢性消耗性傳染病，由于該病也感染人，所以是人獸共患病。

陳偉[20]針對(duì)結(jié)核分枝桿菌和牛分枝桿菌共有的基因序列RV3877設(shè)計(jì)特異性引物，能檢測(cè)出結(jié)核分枝桿菌與牛分枝桿菌，并且有很高的特異性，靈敏度達(dá)到16個(gè)菌/模板。

3　LAMP技術(shù)應(yīng)用于在奶牛常見疾病診斷中的優(yōu)勢(shì)

3.1診斷特異性強(qiáng)在奶牛常見疾病診斷方面，與傳統(tǒng)診斷方法以及PCR檢測(cè)方法相比，LAMP技術(shù)具有了更強(qiáng)的特異性。主要原因是：LAMP技術(shù)是利用2對(duì)引物（內(nèi)引物與外引物），與靶序列上的6個(gè)特異性部位進(jìn)行準(zhǔn)確結(jié)合發(fā)生擴(kuò)增反應(yīng)，如果6個(gè)區(qū)域中的任何區(qū)域與引物不匹配，則都不能進(jìn)行核酸擴(kuò)增。

3.2診斷靈敏度高賀婷[6]對(duì)奶牛鏈球菌性乳房炎可視化LAMP檢測(cè)方法進(jìn)行研究，得出LAMP對(duì)無(wú)乳鏈球菌、停乳鏈球菌和乳房鏈球菌DNA檢出限依次為52.6 fg/μf，48.9 fg/μf，3.55 fg/μf，敏感性為100%。唐婕等[12]對(duì)化膿性棒狀桿菌LAMP檢測(cè)方法的研究，靈敏度在DNA水平上可達(dá)112 fg。綜合各文獻(xiàn)數(shù)據(jù)，可得出結(jié)論：與PCR診斷方法相比，LAMP檢測(cè)靈敏度通常是常規(guī)PCR的10～100倍。

3.3診斷速度快許鄒亮等[18]對(duì)布魯菌環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增方法的研究，LAMP反應(yīng)在60 min完成。

綜合各文獻(xiàn)數(shù)據(jù)，可得出結(jié)論：LAMP技術(shù)用于奶牛疾病診斷的基本反應(yīng)可以在60～90 min內(nèi)完成，如果加入環(huán)引物，則能使反應(yīng)時(shí)間縮短為30～45 min。

3.4診斷更便捷在LAMP檢測(cè)體系中可加入鈣黃綠素?zé)晒馊玖希@樣試驗(yàn)的結(jié)果即可產(chǎn)生綠色熒光，使得目視檢測(cè)效果好。利用LAMP技術(shù)開發(fā)配套診斷試劑盒，只需對(duì)檢測(cè)原料進(jìn)行簡(jiǎn)單的DNA提取，就可以完成直接的擴(kuò)增和診斷。與PCR方法相比，LAMP診斷方法不需要購(gòu)買昂貴的儀器設(shè)備，只需配一臺(tái)普通的水浴鍋，就可以完成現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)，特別適用于基層、農(nóng)村、偏遠(yuǎn)山區(qū)進(jìn)行奶牛常見疾病的診斷。

4　結(jié)語(yǔ)

LAMP檢測(cè)技術(shù)非常適用于進(jìn)行奶牛常見疾病的實(shí)時(shí)定性檢測(cè)。相信隨著LAMP檢測(cè)技術(shù)的不斷完善，在不久的將來(lái)，它將逐漸取代傳統(tǒng)的診斷方法以及PCR檢測(cè)方法，推動(dòng)奶牛常見疾病診斷技術(shù)朝著更準(zhǔn)確、更廉價(jià)、更便捷的方向發(fā)展。

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中圖分類號(hào)：S823.8

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：0529-6005（2016）05-0064-02

收稿日期：2015-09-10

作者簡(jiǎn)介：楊柳（1975-），女，副教授，本科，主要從事畜產(chǎn)品加工及安全檢測(cè)研究，E-mail：yl0313@163.com

通訊作者：陳宇飛，E-mail：254447088@163.com