汪孟航，朱洪偉，何民輝，溫永俊，程世鵬

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所，特種經(jīng)濟(jì)動物分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長春130112）

狂犬病病毒糖蛋白生物學(xué)功能研究進(jìn)展

汪孟航，朱洪偉，何民輝，溫永?。?，程世鵬

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所，特種經(jīng)濟(jì)動物分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長春130112）

摘 要：狂犬病是由狂犬病病毒（rabies virus，RABV）感染中樞神經(jīng)系統(tǒng)引起的致死性人畜共患傳染病。RABV糖蛋白存在于病毒表面，它既是病毒的主要保護(hù)性抗原，誘導(dǎo)體液免疫產(chǎn)生中和抗體和刺激T細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞免疫，又是病毒與細(xì)胞受體結(jié)合的結(jié)構(gòu)，在病毒致病性和嗜神經(jīng)性中發(fā)揮重要作用，與病毒毒力直接相關(guān)。作者歸納總結(jié)國內(nèi)外RABV糖蛋白結(jié)構(gòu)與功能研究進(jìn)展，并對糖蛋白中和抗體的檢測與評價(jià)進(jìn)行闡述。將為進(jìn)一步揭示RABV糖蛋白生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)，為糖蛋白中和抗體的診斷提供理論參考，為控制和消滅狂犬病做出相應(yīng)貢獻(xiàn)。

關(guān)鍵詞：狂犬??；糖蛋白；中和抗體

狂犬?。╮abies）是一種可感染人與所有溫血動物的烈性人畜共患傳染病，是迄今為止病死率最高的急性傳染病，感染者一旦發(fā)病，死亡率幾乎為100%。狂犬病的感染途徑主要是病獸或帶毒獸咬傷，主要的帶毒動物有犬、浣熊、臭鼬、蝙蝠和狐貍［1］?？袢〔《荆╮abies virus，RABV）是引發(fā)狂犬病的病原體，屬于彈狀病毒科（Rhabdoviridae）、狂犬病毒屬（Lyssavirus）、血清Ⅰ型病毒，1885年由Loues Pasteur首次分離。狂犬病病毒屬可以分為7種不同基因類型，分別是經(jīng)典狂犬病病毒（RABV）、DUVENHAGE病毒（DUVV）、拉各斯蝙蝠狂犬病病毒（LBV）、mokola病毒（MOKL）、歐洲蝙蝠病毒屬（EBLV，分為兩種：基因5型和基因6型，及澳大利亞蝙蝠病毒屬（ABLV）。RABV顆粒在電子顯微鏡下呈現(xiàn)子彈狀，直徑約為75nm，長度為100～300nm。RABV基因組為單股負(fù)鏈不分節(jié)段RNA，基因組大小為11 928或11 932bp，含有5種結(jié)構(gòu)基因，從3′端到5′端依次排列為N、P、M、G和L基因?；蚪M在聚合酶的作用下將5種結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄為初級mRNA，經(jīng)歷加帽、甲基化和多聚腺苷酸化后轉(zhuǎn)變?yōu)槌墒靘RNA，分別編碼核蛋白（N）、磷蛋白（P）、基質(zhì)蛋白（M）、糖蛋白（G）和大蛋白（L）。M蛋白形成病毒主要骨架結(jié)構(gòu)，維持病毒正常形態(tài)，還可以刺激增強(qiáng)病毒復(fù)制，且具有抑制病毒轉(zhuǎn)錄的作用。N蛋白緊密包裹著病毒RNA，構(gòu)成螺旋狀核衣殼結(jié)構(gòu)，避免基因組RNA遭到細(xì)胞核酸酶的破壞，且有研究證實(shí)病毒基因組RNA的轉(zhuǎn)錄與復(fù)制受控于N基因的表達(dá)。P蛋白與L蛋白不僅參與組成核衣殼，更在病毒的復(fù)制與轉(zhuǎn)錄中發(fā)揮著重要作用，研究證實(shí)N蛋白未與P蛋白、L蛋白相互作用時(shí)，病毒的復(fù)制與轉(zhuǎn)錄就會出現(xiàn)減少現(xiàn)象［1］。G蛋白是唯一存在于RABV表面的蛋白，它既是RABV的主要保護(hù)性抗原，能誘導(dǎo)機(jī)體體液免疫產(chǎn)生中和抗體和刺激T細(xì)胞作用產(chǎn)生細(xì)胞免疫，又是RABV與細(xì)胞受體結(jié)合的結(jié)構(gòu)，在病毒致病性和嗜神經(jīng)性中發(fā)揮重要作用，與病毒毒力直接相關(guān)。鑒于G蛋白在病毒結(jié)構(gòu)蛋白中的重要地位，作者將歸納總結(jié)國內(nèi)外RABV糖蛋白結(jié)構(gòu)與功能的相關(guān)研究，并對糖蛋白中和抗體的檢測與評價(jià)進(jìn)行闡述，為進(jìn)一步揭示RABV糖蛋白的生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)。

1 RABV糖蛋白

G蛋白存在于病毒顆粒表面，其抗原位點(diǎn)可識別宿主細(xì)胞的受體并與之結(jié)合，在病毒致病性和嗜神經(jīng)性中發(fā)揮重要作用。G蛋白基因只含有一個ORF，共含有1 675、2 059或2 069個核苷酸，編碼序列長1 575bp。在RABV 5種結(jié)構(gòu)基因中G蛋白基因的變異率最大，同一基因型不同地區(qū)的同源性為80%～100%，不同基因型間的同源性只有50%～75%［2］。G蛋白由524個氨基酸組成，前19個氨基酸構(gòu)成疏水性信號肽，成熟過程中信號肽被切除，最終含有505個氨基酸，相對分子質(zhì)量為56ku，等電點(diǎn)為6.7。

成熟G蛋白從結(jié)構(gòu)上分為3個部分：膜外區(qū)，即1－439位氨基酸，該區(qū)攜帶有RABV主要抗原決定位點(diǎn)，具有強(qiáng)大的免疫原性和抗原性，在受體識別和膜融合過程中發(fā)揮著重要作用；跨膜區(qū)，即440－461位氨基酸，該區(qū)參與G蛋白在病毒脂質(zhì)雙分子層膜上的固定；膜內(nèi)區(qū)，即462－505位氨基酸，該區(qū)位于病毒包膜內(nèi)，并與基質(zhì)蛋白與核蛋白相互作用有關(guān)。G蛋白功能區(qū)單一氨基酸的保守與穩(wěn)定有利于蛋白完整功能的體現(xiàn)，如成熟G蛋白第36位蘇氨酸被脯氨酸替代后，RABV中和抗體無法中和該突變毒株；第39位絲氨酸被蘇氨酸替代后，G蛋白的空間構(gòu)象發(fā)生改變；第461位半胱氨酸殘基的棕櫚酸化，可將G蛋白在脂質(zhì)雙分子層膜上固定，穩(wěn)定G蛋白空間構(gòu)象并保持其完整功能［3］。另外還發(fā)現(xiàn)了一種存在于病毒細(xì)胞培養(yǎng)液中的可溶性G蛋白（Gs），在抗原性上Gs與G蛋白相差不大，但Gs無法正常結(jié)合于病毒顆粒包膜，該病毒顆粒也無法具備正常的感染能力，甚至激發(fā)動物機(jī)體產(chǎn)生的中和抗體都出現(xiàn)減少現(xiàn)象，只有G蛋白的1／15左右，這些改變是由于在結(jié)構(gòu)上Gs的C末端跨膜區(qū)缺失58個氨基酸殘基［4］。

G蛋白是RABV結(jié)構(gòu)蛋白中唯一能刺激機(jī)體產(chǎn)生中和抗體的蛋白抗原，其蛋白抗原性主要依賴于空間構(gòu)象表位，主要的抗原位點(diǎn)有GⅠ區(qū)、GⅡ區(qū)和GⅢ區(qū)。GⅠ區(qū)既包含空間構(gòu)象抗原表位，又包含線性抗原表位，該抗原位點(diǎn)相對獨(dú)立，位于226－231位氨基酸區(qū)段。GⅡ區(qū)抗原保守性較高，具有典型的不連續(xù)性空間構(gòu)象抗原表位，兩個主要抗原表位區(qū)34－42（GⅡb）和198－200（GⅡa）通過二硫鍵相互連接，構(gòu)成G蛋白空間構(gòu)象。GⅢ區(qū)是G蛋白中最主要的抗原位點(diǎn)，包含一段連續(xù)的空間構(gòu)象表位，位于330－338位氨基酸區(qū)段。具有空間構(gòu)象的GⅡ和GⅢ區(qū)不僅是RABV特異性中和抗體的主要結(jié)合位點(diǎn)，而且在蛋白折疊與運(yùn)輸中具有重要作用。目前，G蛋白上還發(fā)現(xiàn)了其他的線性中和抗原位點(diǎn)GⅤ區(qū)，該位點(diǎn)免疫原性較弱，位于261－264位氨基酸區(qū)段，該區(qū)在不同RABV毒株中高度保守。除了線性位點(diǎn)以外，G蛋白還存在有依賴于單一氨基酸的抗原位點(diǎn)，如位于251位氨基酸的GⅣ區(qū)；位于264位氨基酸的GⅥ區(qū)，GⅥ區(qū)存在于GⅤ區(qū)內(nèi)部［5］。

G蛋白是病毒基因組結(jié)構(gòu)蛋白中唯一的糖基化蛋白，蛋白中糖基化位點(diǎn)和數(shù)目隨不同毒株而改變。一般情況下，具有N－X－T蛋白結(jié)構(gòu)的糖基化效率普遍高于N－X－S蛋白結(jié)構(gòu)，蘇氨酸位點(diǎn)的糖基化效率可比絲氨酸位點(diǎn)高出2～3倍。在成熟G蛋白中發(fā)現(xiàn)了3個主要的糖基化位點(diǎn)：第37位氨基酸糖基化位點(diǎn)，該位點(diǎn)糖基化作用較弱，多數(shù)存在于RABV基因Ⅰ型當(dāng)中。第158或247位氨基酸糖基化位點(diǎn)，該位點(diǎn)分布較集中，但并不普遍存在，同樣多數(shù)存在于基因Ⅰ型病毒當(dāng)中。第319位氨基酸糖基化位點(diǎn)，該位點(diǎn)是RABV最主要的糖基化位點(diǎn)，存在于目前所有已知的RABV中，試驗(yàn)證明利用基因工程手段敲除該位點(diǎn)，病毒G蛋白的免疫原性出現(xiàn)減弱現(xiàn)象，并且推測該位點(diǎn)可能與G蛋白的正確折疊和運(yùn)輸密切相關(guān)［2］。糖基化結(jié)構(gòu)的存在對RABV G蛋白發(fā)揮其完整的生物學(xué)功能和病毒識別具有至關(guān)重要的作用。

2 糖蛋白的生物學(xué)功能

2.1糖蛋白與宿主免疫的關(guān)系

RABV G蛋白是病毒基因組結(jié)構(gòu)蛋白中的主要保護(hù)性抗原，具有B細(xì)胞、T細(xì)胞識別位點(diǎn)，能夠誘導(dǎo)宿主細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞免疫和體液免疫應(yīng)答，刺激宿主分泌中和性抗體。G蛋白上的B細(xì)胞表位識別位點(diǎn)主要位于GⅡ區(qū)和GⅢ區(qū)，刺激機(jī)體產(chǎn)生具有保護(hù)作用的IgG免疫球蛋白。假如利用基因工程手段敲除小鼠的B細(xì)胞基因，抑制抗病毒中和性抗體的產(chǎn)生，那么疫苗就不能保護(hù)宿主抵抗RABV的攻擊。將RABV G蛋白基因克隆入其他病毒載體構(gòu)建的狂犬病毒工程疫苗，可成功刺激機(jī)體產(chǎn)生中和抗體，抵抗病毒攻擊。在細(xì)胞免疫應(yīng)答方面，G蛋白上的T細(xì)胞抗原表位既包含有空間構(gòu)象型，也包含有線性型，能夠有效的刺激T淋巴細(xì)胞誘導(dǎo)免疫應(yīng)答。激發(fā)的CD8＋T細(xì)胞能夠直接對靶細(xì)胞進(jìn)行殺傷，殺死發(fā)生病變的神經(jīng)細(xì)胞，進(jìn)而清除中樞神經(jīng)系統(tǒng)中狂犬病毒顆粒，最終引起免疫性病理現(xiàn)象的發(fā)生［6］。但是，CD8＋T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答在抗病毒中并不起主要作用，并且其殺傷性具有潛在的危險(xiǎn)性，所以應(yīng)盡量誘導(dǎo)宿主機(jī)體產(chǎn)生B細(xì)胞免疫反應(yīng)和CD4＋T細(xì)胞免疫反應(yīng)。Sato等［7］通過比較基因缺失病毒與完整病毒基因的表達(dá)水平來驗(yàn)證G蛋白的作用，該項(xiàng)研究分析了3種不同重組病毒的轉(zhuǎn)基因表達(dá)水平與病毒轉(zhuǎn)錄，證實(shí)G基因缺失后病毒轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平升高，但是缺失病毒出現(xiàn)免疫原性下降現(xiàn)象，且G蛋白具有細(xì)胞毒性作用。Hu等［8］利用G蛋白基因嵌入痘病毒載體制備重組病毒，證實(shí)可誘導(dǎo)免疫動物的體液免疫產(chǎn)生中和抗體和刺激T細(xì)胞作用產(chǎn)生細(xì)胞免疫。Huang等［9］利用5型副流感病毒作為載體，表達(dá)狂犬病毒的G蛋白，作為狂犬病預(yù)防和治療的手段，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該重組病毒可使小鼠免受病毒感染至少6d，有潛力作為一種新型預(yù)防狂犬病的方法。類似的疫苗技術(shù)已經(jīng)在美國及歐洲廣泛使用，有效控制了該地區(qū)野生動物狂犬病的流行。

成熟G蛋白分子上約有3個糖基化位點(diǎn)，糖蛋白的糖基化程度與病毒免疫原性息息相關(guān)，且G蛋白分子上的某個氨基酸位點(diǎn)的糖基化可能會增強(qiáng)該蛋白分子的另一端位點(diǎn)糖基化的發(fā)生。試驗(yàn)證實(shí)Asn（247）位點(diǎn)糖基化可以增強(qiáng)Asn（319）位點(diǎn)糖基化的發(fā)生，促使機(jī)體產(chǎn)生更強(qiáng)的免疫識別。若降低G蛋白的糖基化程度，則誘導(dǎo)產(chǎn)生的中和抗體含量將大大減少［10］，其原因可能是G蛋白被糖基化修飾后，使得抗原表位更加突出于表面，增強(qiáng)其免疫原性。

2.2糖蛋白與宿主細(xì)胞受體的關(guān)系

RABV侵染宿主細(xì)胞的過程中，需要與宿主細(xì)胞表面受體結(jié)合并識別，其中病毒表面囊膜G蛋白具有介導(dǎo)該結(jié)合過程的最主要作用。煙堿乙酰受體（NachR）是眾多RABV細(xì)胞受體中第一個被發(fā)現(xiàn)的，主要存在于肌肉細(xì)胞的突觸后膜，有研究顯示，動物機(jī)體肌細(xì)胞中的煙堿乙酰受體含量越高，該動物對RABV就越易感，兩者呈正相關(guān)。RABV G蛋白具有的四肽空間結(jié)構(gòu)Asn194Ser195Arg196Gly197中，Arg196殘基上的氨基和Asn194殘基的羧基組成的空間構(gòu)象與NachR空間構(gòu)象有較高相似度，進(jìn)一步表明G蛋白具有結(jié)合煙堿型受體的結(jié)構(gòu)。利用蛋白質(zhì)序列同源性分析，以及活性結(jié)合NachR試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)RABV G蛋白和蛇毒箭毒樣神經(jīng)毒素蛋白具有同源性，其中G蛋白的第184－214位氨基酸與蛇毒神經(jīng)毒素蛋白的環(huán)形結(jié)構(gòu)同源性最高，進(jìn)一步的試驗(yàn)表面金環(huán)蛇神經(jīng)毒素單克隆抗體可對狂犬病毒與NachR的結(jié)合產(chǎn)生抑制作用［11］。然而研究人員發(fā)現(xiàn)，RABV仍然可以感染缺乏NachR的細(xì)胞系，進(jìn)一步利用蛇毒處理降低細(xì)胞感染比例也沒有達(dá)到預(yù)想效果，這表明除了煙堿乙酰受體還涉及到其他受體分子。

神經(jīng)細(xì)胞黏附分子（NCAM）是RABV的新一類細(xì)胞受體，該受體的發(fā)現(xiàn)是通過不同細(xì)胞株相互比較發(fā)現(xiàn)的。利用特異性抗體或者硫酸素占據(jù)細(xì)胞表面上的神經(jīng)細(xì)胞黏附分子結(jié)合部位阻斷NCAM，將降低細(xì)胞感染狂犬病病毒比例。相反，通過轉(zhuǎn)染NCAM提高細(xì)胞表達(dá)量，該細(xì)胞的病毒易感性也隨之增大。進(jìn)一步研究表明，感染前將病毒分子與NCAM預(yù)處理，該病毒失去再感染BSR細(xì)胞的能力。動物試驗(yàn)結(jié)果一致，同劑量病毒分別感染野生鼠與缺少NCAM小鼠，缺乏鼠的死亡時(shí)間明顯延長［11－12］。RABV表面G蛋白具有吸附NCAM作用，占據(jù)NCAM位點(diǎn)后病毒增殖能力將受到影響。

此外，還有一些種類的狂犬病毒受體被不斷發(fā)現(xiàn)。神經(jīng)營養(yǎng)因子受體（p75NTR）被證實(shí)為RABV 1型與6型病毒受體，通過轉(zhuǎn)染p75NTR進(jìn)入RABV耐受BSR細(xì)胞株，該細(xì)胞株重新轉(zhuǎn)變?yōu)镽ABV易感細(xì)胞［13］。神經(jīng)營養(yǎng)因子受體與病毒G蛋白結(jié)合參與病毒的內(nèi)吞與運(yùn)輸。也有報(bào)道RABV吸附細(xì)胞膜表面的神經(jīng)節(jié)苷脂及磷脂，可感染非神經(jīng)組織細(xì)胞并繁殖［11］。

2.3糖蛋白與病毒致病性的關(guān)系

狂犬病的致病性與病毒對神經(jīng)的侵染能力有關(guān)，具有嚴(yán)格的神經(jīng)嗜性，能引起所有溫血動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)致死性感染。主要危害感染機(jī)體的神經(jīng)系統(tǒng)，病毒在神經(jīng)元細(xì)胞漿內(nèi)聚集、增殖形成包涵體，RABV能引起神經(jīng)遞質(zhì)分泌異常和離子通道功能異常。

RABV強(qiáng)毒株與馴化后的弱化毒株在神經(jīng)親嗜性程度上明顯不同，從外周感染部位侵犯中樞神經(jīng)系統(tǒng)（central nervous system，CNS）的能力不同。原因主要是病毒基因結(jié)構(gòu)中的糖蛋白（G蛋白）的不同，組織弱化毒株從外周侵犯CNS的能力喪失或有限，而強(qiáng)毒株具有高神經(jīng)親嗜性［14］。研究人員比較了RABV強(qiáng)毒株（SHBRV）與實(shí)驗(yàn)室弱化毒株（CVS－B2C）的臨床表現(xiàn)、致病性及病理變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SHBRV的毒力比CVS－B2C強(qiáng)100～1 000倍，CVS－B2C可在中樞神經(jīng)系統(tǒng)引起廣泛的炎癥，包括神經(jīng)細(xì)胞退行性病變、壞死和凋亡，淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞浸潤，膠質(zhì)細(xì)胞增殖等。相反，SHBRV感染小鼠大腦的病理變化非常輕微，凋亡細(xì)胞及CD3＋炎癥細(xì)胞數(shù)量顯著低于CVS－B2C感染小鼠［15］?？袢〉闹虏⌒耘c病毒對神經(jīng)的侵染能力有關(guān)，不同病毒株從外周部位進(jìn)入神經(jīng)系統(tǒng)的能力有明顯差異，這主要跟RABV G蛋白有關(guān)。Ghanem等［16］利用G蛋白與神經(jīng)細(xì)胞侵染能力的關(guān)系，將G基因缺失構(gòu)建重組病毒，使用現(xiàn)代光學(xué)追蹤法研究RABV在神經(jīng)元回路中的感染途徑。還有研究表明，RABV固定株（ERA、HEP、CVS）的致病性與位于G蛋白的Ⅲ位點(diǎn)抗原決定簇存在有關(guān)；在成年鼠內(nèi)不管接種劑量和接種途徑，由于G蛋白氨基酸的333位點(diǎn)的突變，使得Arg變成為Gln、Glu、Gly，RABV的致病力大大的降低［17］。Etessami等［18］研究表明，缺失G基因的重組RABV可以感染神經(jīng)元，但不能傳播到下一級神經(jīng)元；說明G蛋白在RABV狂犬病病毒從突觸前穿行到突觸后這一過程中扮演了一個很重要的角色。

狂犬病強(qiáng)毒株在神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)復(fù)制，通過低表達(dá)G基因和阻礙促凋亡因子的產(chǎn)生；通過FasL及B7－H1途徑導(dǎo)致游走性T細(xì)胞死亡，同時(shí)還能保護(hù)神經(jīng)元的軸突和樹突免于凋亡和退行性病變，從而保持神經(jīng)元及神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的完整性，這種巧妙的免疫逃避策略使病毒在神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)成功繁殖［19］。Yang等［20］證實(shí)RABV引起天然免疫應(yīng)答中樹突狀細(xì)胞的激活，該過程依賴于病毒G蛋白的表達(dá)，街毒無法激活樹突狀細(xì)胞產(chǎn)生天然免疫是因?yàn)镚基因和與它相關(guān)的前導(dǎo)RNA的低水平表達(dá)。Li等［21］推測RABV街毒引起神經(jīng)功能異常是由于神經(jīng)突起變性和突觸結(jié)構(gòu)的破壞，研究發(fā)現(xiàn)腦內(nèi)接種RABVN2C株，銀染海馬切片顯示神經(jīng)元突起發(fā)生嚴(yán)重的破壞和紊亂。Jackson等在表達(dá)黃色熒光蛋白小鼠的足墊內(nèi)接種病毒來觀察神經(jīng)元突起的變化，在發(fā)病晚期，在大腦皮層第五層錐狀神經(jīng)元樹突和軸突出現(xiàn)串珠樣改變和腫脹。大量試驗(yàn)表明在RABV的感染模型中，神經(jīng)遞質(zhì)包括乙酰膽堿［21－22］、五羥色胺［23］、γ氨基丁酸［24］的表達(dá)量存在異常。

3 RABV中和抗體的檢測與評價(jià)

RABV G蛋白存在于病毒顆粒表面，是病毒結(jié)構(gòu)蛋白中唯一能刺激機(jī)體產(chǎn)生中和抗體的蛋白，依靠其抗原性激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體是G蛋白的重要生物學(xué)功能之一。以下將對糖蛋白中和抗體的檢測與評價(jià)進(jìn)行闡述。

3.1中和抗體檢測方法

目前測定RABV中和性抗體水平的方法大致可分為兩種：抗原抗體結(jié)合檢測及病毒中和試驗(yàn)檢測?？乖贵w結(jié)合檢測方法所使用的抗原，包括全病毒、純化的多肽和模擬表位等類型，通過與RABV不同抗原位點(diǎn)結(jié)合能力進(jìn)行分析、測定血清或腦脊液（CSF）中的RABV中和抗體含量，并可測定中和抗體的親和力、活性及特異性。一般過程是將所用抗原結(jié)合到試管、平板、圓珠等固體表面，加入待測樣品，抗原抗體反應(yīng)，利用偶聯(lián)熒光標(biāo)記的二抗結(jié)合或底物反應(yīng)等酶顯色技術(shù)，檢出樣品中和性抗體的活性與含量。本方法的特點(diǎn)是既可檢測與RABV表面抗原結(jié)合的中和性抗體，也可測定與內(nèi)部蛋白抗原結(jié)合的抗體。病毒中和試驗(yàn)檢測方法是基于神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)，將標(biāo)準(zhǔn)活病毒與待測樣品中和抗體進(jìn)行中和反應(yīng)后，測定剩余病毒量，進(jìn)而對待測血清或CSF中RABV中和抗體的含量進(jìn)行評價(jià)的方法［25］。體外細(xì)胞培養(yǎng)物中的病毒中和機(jī)制，不僅依賴于RABV中和抗體與病毒抗原結(jié)合部位的相互作用，同時(shí)也受到神經(jīng)細(xì)胞上的表面受體影響。研究表明RABV侵染CNS，一般是通過與CNS細(xì)胞上的乙酰膽堿受體、神經(jīng)生長因子受體或神經(jīng)細(xì)胞粘附分子結(jié)合，而對于非CNS細(xì)胞的侵染，所結(jié)合的其他受體至今仍不清楚［26］。

3.2不同檢測方法的應(yīng)用范圍

實(shí)際應(yīng)用中，選用適當(dāng)?shù)臋z測方法達(dá)到使用目的即可。抗原抗體結(jié)合檢測方法可以用于判斷中和性抗體的存在情況，免疫球蛋白的類型，也可用于機(jī)體產(chǎn)生中和抗體應(yīng)答的確認(rèn)。如以診斷RABV感染情況為目的，抗原抗體結(jié)合檢測技術(shù)應(yīng)為首選方法。該方法具有簡單、易用、安全、快速等特點(diǎn)，能夠簡便快捷的達(dá)到檢測需求。然而為了測定疫苗接種后的免疫效果，需要對血清中的中和抗體水平及活性進(jìn)行測定。盡管抗原抗體結(jié)合檢測技術(shù)有眾多優(yōu)點(diǎn)，但是通過中和試驗(yàn)測定出來的檢測結(jié)果真實(shí)性最高，最接近中和抗體的真實(shí)抗病毒能力，所以最佳選擇應(yīng)采用病毒中和試驗(yàn)檢測方法［27］。

3.3檢測方法的評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

1992年WHO狂犬委員會第八次報(bào)告中，第一次提出將中和抗體效價(jià)為0.5IU／mL作為全球公認(rèn)的保護(hù)效力臨界值。報(bào)告關(guān)于RABV疫苗接種，指出常與RABV活毒接觸的研究人員、醫(yī)院檢測人員、疫苗生產(chǎn)工作者等需要經(jīng)常檢測自身血清樣品的中和性抗體水平，一旦抗體滴度低于0.5IU／mL，需加強(qiáng)疫苗接種。但是，規(guī)定的中和抗體0.5IU／mL是RABV暴露后，疫苗接種的標(biāo)準(zhǔn)，并不是動物機(jī)體有效保護(hù)能力標(biāo)準(zhǔn)［28］。Aubert［30］的研究提出利用RFFIT檢測方法測定貓和狗的中和抗體水平，建議其保護(hù)性抗體水平臨界值分別是0.1IU／mL和0.2IU／mL。但是已清除RABV地區(qū)引進(jìn)外地貓和狗時(shí)，權(quán)威人士推薦RFFIT或者FAVN檢測結(jié)果保護(hù)性抗體水平臨界值為0.5IU／mL，該數(shù)值表明有足夠能力抵抗RABV的侵染［29－30］。狂犬病免疫球蛋白產(chǎn)品的國際參考標(biāo)準(zhǔn)包括：WHO狂犬病免疫球蛋白第一國際標(biāo)準(zhǔn)，WHO狂犬病免疫球蛋白第二國際標(biāo)準(zhǔn)，以及OIE犬類狂犬免疫球蛋白標(biāo)準(zhǔn)。1955年，首次建立了RABV免疫球蛋白的最初國際標(biāo)準(zhǔn)，每安瓿86.6mg凍干疫苗產(chǎn)品，其效力值最低規(guī)定為86.6IU。隨后，于1984年，規(guī)定效價(jià)值為59IU為WHO狂犬免疫球蛋白第一國際標(biāo)準(zhǔn)。1993年，將效價(jià)值30IU作為WHO狂犬免疫球蛋白的第二國際標(biāo)準(zhǔn)。確立效價(jià)值6.7IU作為OIE狂犬免疫球蛋白的國際標(biāo)準(zhǔn)。1997年，USFDA對WHO提供的兩種標(biāo)準(zhǔn)效價(jià)值進(jìn)行驗(yàn)證對比，2006年，堪薩斯州立大學(xué)狂犬病實(shí)驗(yàn)室再次進(jìn)行了驗(yàn)證，結(jié)果表明，1997年WHO第一國際標(biāo)準(zhǔn)的效價(jià)值相對于第二標(biāo)準(zhǔn)減少了2.5%，而在2006年卻減少了14%。雖然出現(xiàn)的差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但說明了使用不同參考標(biāo)準(zhǔn)對檢測結(jié)果的影響。另外，結(jié)果計(jì)算方式對血清樣品中和抗體效價(jià)進(jìn)行評價(jià)，將產(chǎn)生截然不同的效價(jià)值。Welch等［31］使用的標(biāo)準(zhǔn)臨界值分別為WHO推薦的0.5IU／mL和ACIP推薦的血清稀釋度1∶5，比較3種不同ELISA檢測方法與RFFIT檢測方法的檢測結(jié)果，利用RFFIT檢測方法驗(yàn)證ELISA檢測方法的穩(wěn)定性與特異性。當(dāng)使用ACIP的血清稀釋度1∶5測定出結(jié)果，換用WHO的0.5IU／mL時(shí)，出現(xiàn)了不同的檢測結(jié)果，證實(shí)了臨界值的選定對于疫苗免疫效果的評價(jià)的重要性［31］。

實(shí)現(xiàn)RABV中和性抗體檢測方法的標(biāo)準(zhǔn)化，能夠?qū)Σ煌瑢?shí)驗(yàn)室研究結(jié)果進(jìn)行比較，將對抗體特性和疫苗接種效果的評估具有深遠(yuǎn)意義。所以任何試驗(yàn)檢測結(jié)果，都需要標(biāo)注參考標(biāo)準(zhǔn)以及結(jié)果計(jì)算方式。

4 展 望

狂犬病作為歷史悠久的人畜共患病，致死率高，病程痛苦，對其致病機(jī)制缺乏明確的認(rèn)識，造成臨床上尚無有效的治療手段。研究RABVG基因在誘導(dǎo)機(jī)體體液免疫產(chǎn)生中和抗體和刺激T細(xì)胞作用產(chǎn)生細(xì)胞免疫的作用，RABVG基因與細(xì)胞受體的結(jié)合機(jī)制，RABVG基因在病毒致病性和嗜神經(jīng)性中發(fā)揮的重要作用，對于揭示RABV感染機(jī)體、引起神經(jīng)癥狀的致病機(jī)制奠定一定的理論基礎(chǔ)。動物體內(nèi)中和抗體水平的高低體現(xiàn)著機(jī)體抵抗病毒入侵的能力。RABV中和性抗體的研究，對于抑制RABV的傳播與患病動物的治療中，具有重要現(xiàn)實(shí)意義。

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（責(zé)任編輯 秦 彤）

中圖分類號：Q71

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1671－7236（2016）12－3349－07

doi：10.16431／j.cnki.1671－7236.2016.12.039

收稿日期：2016－05－16

基金項(xiàng)目：寵物疫病快速診斷與疫苗研究與示范（3313022）；狂犬病病毒糖蛋白干預(yù)神經(jīng)突觸體遞質(zhì)釋放循環(huán)功能的分子機(jī)制（31572505）

作者簡介：汪孟航（1990－），男，黑龍江齊齊哈爾人，碩士生，研究方向：動物病毒疫苗與分子免疫學(xué)，E－mail：wmhtcs＠163.com

通信作者：＊溫永?。?979－），男，內(nèi)蒙古呼和浩特人，副研究員，碩士生導(dǎo)師，研究方向：動物病毒疫苗與分子免疫學(xué)，E－mail：wenyongjun＠caas.cn

Advances in Biological Function of Rabies Virus Glycoprotein

WANG Meng－h(huán)ang，ZHU Hong－wei，HE Min－h(huán)ui，WEN Yong－jun＊，CHENG Shi－peng
（StateKeyLaboratoryforMolecularBiologyofSpecialEconomicAnimals，InstituteofWildEconomic AnimalsandPlants，ChineseAcademyofAgriculturalSciences，Changchun130112，China）

Abstract：Rabies is a lethal zoonotic infectious disease caused by rabies virus（RABV），which infected the central nervous system.The RABV glycoprotein exists on the surface of the virus particles，it is a major protective antigen which stimulate the body to produce the humoral immunity and cellular immunity；It is the identification of structure of the cell receptors；It plays an important role in the viral pathogenicity and tropism in the nerve，directly related to the virulence of virus.In this review，we summarized research progress of structure and function of RABV glycoprotein，and also reviewed the detection and evaluation of the neutralizing antibody.All these fundamental studies are important for the control and elimination of the RABV，to provide research basis for further revealing the biological function of RABV glycoprotein.

Key words：rabies；glycoprotein；neutralizing antibody