孫玉祝，陳江楠，夏兆飛（中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，北京海淀100193）

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寵物食品中沙門(mén)菌的檢測(cè)方法概述

孫玉祝，陳江楠，夏兆飛
（中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，北京海淀100193）

沙門(mén)菌是一種人畜共患病病原菌，如果污染寵物食品，將嚴(yán)重威脅到人類(lèi)和伴侶動(dòng)物的健康安全。寵物食品營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量豐富，有利于沙門(mén)菌等有害微生物的生長(zhǎng)繁殖。選擇適當(dāng)?shù)臋z測(cè)方法，加強(qiáng)對(duì)寵物食品監(jiān)督力度，可以一定程度上有效地降低沙門(mén)菌污染的風(fēng)險(xiǎn)，保障人類(lèi)和伴侶動(dòng)物的健康。

適用于檢測(cè)寵物食品中沙門(mén)菌方法很多，可以概括分為傳統(tǒng)微生物學(xué)、分子生物學(xué)以及免疫學(xué)等方法。但是，為了滿(mǎn)足寵物食品快速檢測(cè)的需要，逐漸引入試紙條、試劑盒以及自動(dòng)化檢測(cè)儀等快速檢測(cè)方法。文章將主要就上述檢測(cè)技術(shù)的原理和應(yīng)用進(jìn)行介紹，比較它們?cè)趯櫸锸称窓z測(cè)中的實(shí)用性以及優(yōu)缺點(diǎn)，希望為寵物食品中沙門(mén)菌檢測(cè)提供參考。

1　沙門(mén)菌污染及危害

沙門(mén)菌污染已經(jīng)成為世界范圍內(nèi)寵物食品安全問(wèn)題關(guān)注的重點(diǎn)。由美國(guó)食品和藥品管理局（FDA）官方網(wǎng)站發(fā)布的信息獲知，美國(guó)2014年的10起犬貓食品召回事件中，就有6起是因?yàn)閼岩晌廴净虼_認(rèn)污染了沙門(mén)菌。新西蘭學(xué)者T L Wong等[1]對(duì)新西蘭本土生產(chǎn)及分別從澳大利亞、中國(guó)和泰國(guó)進(jìn)口的寵物咬膠進(jìn)行了檢測(cè)，不同產(chǎn)地的產(chǎn)品中都檢測(cè)出了沙門(mén)菌，檢出率分別為6.7%、14%、4.1%和3.7%。國(guó)內(nèi)目前暫時(shí)缺乏相關(guān)數(shù)據(jù)，但卻有在魚(yú)粉等飼料原料中檢測(cè)出沙門(mén)菌的報(bào)道[2]。

沙門(mén)菌可以通過(guò)寵物食品感染伴侶動(dòng)物和人，嚴(yán)重威脅人類(lèi)的健康。動(dòng)物和人感染沙門(mén)菌后，通常會(huì)表現(xiàn)出嘔吐、腹瀉或血痢以及發(fā)燒等嚴(yán)重癥狀，甚至?xí)霈F(xiàn)反復(fù)感染。2006年至2008年間，美國(guó)曾暴發(fā)人類(lèi)感染沙門(mén)菌的事件，后經(jīng)調(diào)查證實(shí)是由沙門(mén)菌污染了寵物食品而引起[3]。

2　沙門(mén)菌的檢測(cè)方法

2.1傳統(tǒng)微生物學(xué)方法傳統(tǒng)微生物學(xué)方法是通過(guò)給予細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，適宜的溫度和足夠長(zhǎng)的培養(yǎng)時(shí)間，使細(xì)菌分裂增殖到可檢測(cè)數(shù)量，并利用細(xì)菌形態(tài)、菌落、生化以及血清學(xué)等特點(diǎn)進(jìn)行鑒別的方法。寵物食品樣品中可能含有大量腸桿菌科的細(xì)菌而沙門(mén)菌含量較少，或樣本中沙門(mén)菌受損，直接選擇性增菌容易產(chǎn)生假陰性，所以該方法檢測(cè)沙門(mén)菌需要預(yù)增菌。該方法是沙門(mén)菌檢測(cè)的一種標(biāo)準(zhǔn)方法，也適合用于其他檢測(cè)方法檢測(cè)效果的評(píng)價(jià)。但是從開(kāi)始接種到最終鑒定操作復(fù)雜，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，并不能很好地滿(mǎn)足寵物食品樣本批量快速檢測(cè)的需要。

增菌和鑒定兩個(gè)過(guò)程是該方法的主要限時(shí)步驟。對(duì)這兩個(gè)步驟進(jìn)行改進(jìn)，可以明顯縮短檢測(cè)時(shí)間，增強(qiáng)傳統(tǒng)方法的實(shí)用性。免疫磁珠或疏水網(wǎng)膜進(jìn)行細(xì)菌富集可以有效縮短增菌所耗時(shí)間，但是如果樣本中沙門(mén)菌數(shù)量非常少，則易出現(xiàn)假陰性結(jié)果。顯色培養(yǎng)基、噬菌體以及電化學(xué)阻抗法等則是對(duì)鑒定步驟進(jìn)行改進(jìn)的方法。例如沙門(mén)菌在科瑪嘉沙門(mén)菌顯色培養(yǎng)基上會(huì)形成典型的紫色菌落。

2.2分子生物學(xué)方法分子生物學(xué)方法主要包括聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）、基因芯片、核酸探針以及環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，其中PCR技術(shù)應(yīng)用最廣。

2.2.1聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）PCR是一項(xiàng)在體外擴(kuò)增靶基因片段的技術(shù)。選取目的菌基因序列中特異性和保守性較高的靶基因，利用PCR技術(shù)對(duì)靶基因進(jìn)行擴(kuò)增，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)致病菌的檢測(cè)。沙門(mén)菌的invA基因簇編碼吸附和侵襲腸道上皮細(xì)胞表面侵襲蛋白，具有較高的屬特異性，可以作為檢測(cè)沙門(mén)菌的靶基因。根據(jù)國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道，invA基因編碼的侵襲蛋白是沙門(mén)菌的主要毒力因子，以invA基因序列為靶基因設(shè)計(jì)引物[4]，并采用PCR技術(shù)檢測(cè)寵物食品中的沙門(mén)菌，具有非常高的敏感性和特異性。此外，可應(yīng)用于PCR檢測(cè)的沙門(mén)菌屬特異性基因還有：編碼組氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)操縱子hut基因、16S rRNA基因、編碼鼠傷寒沙門(mén)菌腸毒素stn基因[5]及編碼連四硫酸鹽還原酶ttr基因[6]等。引物的特異性是PCR檢測(cè)的特異性和是否成功的關(guān)鍵，引物特異性低常常會(huì)導(dǎo)致檢測(cè)中的漏檢和誤檢。因此，使用PCR技術(shù)檢測(cè)寵物食品中沙門(mén)菌前，應(yīng)對(duì)設(shè)計(jì)或引用的引物進(jìn)行嚴(yán)格的驗(yàn)證。

傳統(tǒng)PCR技術(shù)操作程序包括目的菌的濃集（增菌）、模板制備、PCR擴(kuò)增以及產(chǎn)物檢測(cè)。PCR擴(kuò)增結(jié)果的判讀需要借助凝膠電泳，但是電泳檢測(cè)特異性卻并不是很高。此外，傳統(tǒng)PCR還具有步驟繁雜、易污染以及無(wú)法準(zhǔn)確定量等問(wèn)題。正是由于如上一些限制性因素，為了更好地實(shí)現(xiàn)PCR檢測(cè)技術(shù)的快捷性和特異性，發(fā)展出了很多改進(jìn)的PCR檢測(cè)技術(shù)。這些技術(shù)不同程度上對(duì)傳統(tǒng)PCR操作程序進(jìn)行了優(yōu)化。這些技術(shù)包括實(shí)時(shí)熒光定量PCR、Taqman PCR[4]、多重PCR、免疫捕獲PCR以及免疫磁珠分離PCR等。例如，Balachandran，P等[7]利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)實(shí)現(xiàn)對(duì)寵物食品中沙門(mén)菌的檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)方法無(wú)顯著差異，而且表現(xiàn)出了比標(biāo)準(zhǔn)PCR檢測(cè)速度快、可量化以及自動(dòng)化程度高等優(yōu)點(diǎn)。

應(yīng)用PCR技術(shù)檢測(cè)寵物食品中得沙門(mén)菌還需要對(duì)樣本進(jìn)行預(yù)處理，排除PCR抑制劑。寵物食品殘?jiān)芭c基質(zhì)有關(guān)的抑制劑會(huì)干擾PCR檢測(cè)靈敏度。國(guó)外文獻(xiàn)報(bào)道[7]，通過(guò)低速離心、濾紙過(guò)濾、過(guò)濾捕獲（例如，疏水網(wǎng)膜法），以及免疫磁珠捕獲等方式對(duì)樣本進(jìn)行預(yù)處理，可以去除樣本中的寵物食品殘?jiān)突|(zhì)，顯著提高了沙門(mén)菌的PCR檢測(cè)敏感性。

2.2.2環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（LAMP）LAMP是采用可以特異性識(shí)別目的基因的四條引物，在恒溫條件下通過(guò)DNA聚合酶的催化作用對(duì)目的基因進(jìn)行快速擴(kuò)增。孫園園等[8]以沙門(mén)菌的fim Y蛋白基因序列為目的片段設(shè)計(jì)了4條特異性引物，并對(duì)各種條件進(jìn)行優(yōu)化，成功建立了針對(duì)動(dòng)物飼料中沙門(mén)菌LAMP快速檢測(cè)方法。并對(duì)24份樣本重復(fù)3次檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果與飼料國(guó)標(biāo)結(jié)果一致。該方法具有特異性強(qiáng)、比PCR檢測(cè)敏感性高、檢測(cè)速度快和不易受干擾等特點(diǎn)。此外，該方法還可以利用氧化硅為載體，實(shí)現(xiàn)對(duì)寵物食品中沙門(mén)菌等多種有害微生物的多重檢測(cè)[9]。

2.3免疫學(xué)方法免疫學(xué)方法是在抗原抗體特異性反應(yīng)的原理基礎(chǔ)上建立起來(lái)的一系列檢測(cè)方法，常用于沙門(mén)菌檢測(cè)的方法包括酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）、免疫層析技術(shù)以及乳膠凝集反應(yīng)，其中ELISA方法及其衍生方法應(yīng)用最廣。

ELISA是將抗原抗體特異性反應(yīng)與酶的高效催化活性的特點(diǎn)相結(jié)合而形成的一種固相酶聯(lián)免疫分析技術(shù)。利用ELISA技術(shù)檢測(cè)寵物食品中的沙門(mén)菌，主要是利用沙門(mén)菌抗原高特異性的單克隆或多克隆抗體。利用單克?。ɑ蚨嗫寺。┛贵w結(jié)合樣品中的沙門(mén)菌抗原，再加入酶標(biāo)抗體結(jié)合抗原抗體復(fù)合物，最終加入底物與酶發(fā)生反應(yīng)，就可以將沙門(mén)菌抗原顯色，實(shí)現(xiàn)對(duì)樣本中沙門(mén)菌的檢測(cè)。

早在20世紀(jì)70年代末，ELISA技術(shù)就被用于食品中沙門(mén)菌的檢測(cè)，隨著技術(shù)的不斷改進(jìn)，發(fā)展出很多傳統(tǒng)ELISA的衍生技術(shù)，顯著提高了對(duì)沙門(mén)菌等病原微生物的檢測(cè)靈敏度和檢測(cè)效率。這些衍生方法包括斑點(diǎn)酶聯(lián)免疫（Dot-ELISA）技術(shù)、熒光酶聯(lián)免疫分析技術(shù)、PCR-ELISA檢測(cè)技術(shù)以及雙夾心法ELISA等。Dot-ELISA技術(shù)[2]是采用硝酸纖維素（NC）膜代替?zhèn)鹘y(tǒng)的聚苯乙烯反應(yīng)板，具有吸附力強(qiáng)、操作方便、檢測(cè)快速等特點(diǎn)，可以同時(shí)檢測(cè)多種抗原。但是正式應(yīng)用前，需要進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化預(yù)試驗(yàn)確定適宜反應(yīng)條件。熒光酶聯(lián)免疫分析技術(shù)是在傳統(tǒng)ELISA基礎(chǔ)上發(fā)展而來(lái)，采用熒光底物代替?zhèn)鹘y(tǒng)生色底物，可借助儀器進(jìn)行結(jié)果判讀，提高了檢測(cè)的靈敏度，避免人工判讀誤差[10]。

2.4快速檢測(cè)試紙條和試劑盒常見(jiàn)可用于寵物食品中沙門(mén)菌的檢測(cè)的試紙有β-萘酚辛酸酯試紙和API試紙。β-萘酚辛酸酯試紙[11]是依據(jù)沙門(mén)菌屬可以產(chǎn)生特異性較強(qiáng)的辛酯酶解離辛酸酯類(lèi)化合物的特性而設(shè)計(jì)的。采用該方法檢測(cè)沙門(mén)菌具有快速、簡(jiǎn)單、直觀和經(jīng)濟(jì)等特點(diǎn)，但是β-萘酚辛酸酯化合物不夠穩(wěn)定容易分解，保質(zhì)期短，適合現(xiàn)制現(xiàn)用。API 20 E試紙是根據(jù)傳統(tǒng)腸道桿菌生化及發(fā)酵反應(yīng)設(shè)計(jì)而來(lái)，可用于寵物食品和飼料中沙門(mén)菌屬的檢測(cè)，具有檢測(cè)快速及操作簡(jiǎn)便（標(biāo)準(zhǔn)化）等特點(diǎn)，是細(xì)菌鑒定的國(guó)際金標(biāo)準(zhǔn)?？焖贆z測(cè)試劑盒主要是基于單抗酶聯(lián)免疫技術(shù)、熒光PCR以及實(shí)時(shí)PCR等原理設(shè)計(jì)，可以實(shí)現(xiàn)短時(shí)間內(nèi)批量產(chǎn)品的檢測(cè)，極大地降低人力和時(shí)間成本投入。

2.5自動(dòng)化檢測(cè)儀器自動(dòng)化檢測(cè)儀器主要是基于微生物的生化代謝、免疫屬性以及核酸特異性等特點(diǎn)而設(shè)計(jì)制造的。自動(dòng)化檢測(cè)儀器的出現(xiàn)減少人力和時(shí)間的投入，實(shí)現(xiàn)短時(shí)間內(nèi)批量樣品的檢測(cè)，符合現(xiàn)如今寵物食品批量化生產(chǎn)檢測(cè)的需要。現(xiàn)在常用的自動(dòng)化檢測(cè)儀器主要有全自動(dòng)微生物分析儀和生物傳感器。自動(dòng)化微生物分析儀還表現(xiàn)出省時(shí)、方便操作、可標(biāo)準(zhǔn)化、可追蹤性以及準(zhǔn)確度高等特點(diǎn)。

2.5.1全自動(dòng)微生物分析儀全自動(dòng)分析儀因設(shè)計(jì)原理不同可以分為以下幾類(lèi)：（1）基于微生物生化反應(yīng)原理設(shè)計(jì)，例如VITEK微生物鑒定儀和TEMPO全自動(dòng)微生物定量分析儀。于曉婕等[11]采用TEMPO分析儀對(duì)烘干雞肉（寵物食品）微生物污染情況進(jìn)行檢測(cè)，并與傳統(tǒng)標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行比較，兩者符合度程度在97%以上；（2）基于酶聯(lián)免疫技術(shù)，例如全自動(dòng)熒光酶聯(lián)免疫檢測(cè)系統(tǒng)（VIDAS），黃嫦嬌等[10]采用VIDAS系統(tǒng)對(duì)食品中沙門(mén)菌進(jìn)行檢測(cè)，并與傳統(tǒng)標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行比較，體現(xiàn)出檢測(cè)快速、特異性以及敏感性高等特點(diǎn)；（3）以微生物特異的基因組為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)，例如全自動(dòng)微生物基因指紋分析儀。與傳統(tǒng)方法相比，利用全自動(dòng)微生物分析儀檢測(cè)寵物食品中沙門(mén)菌具有很多如上所述的優(yōu)勢(shì)，但是不可避免的一個(gè)問(wèn)題就是高昂的儀器成本，這將會(huì)成為阻礙自動(dòng)化儀器在中小型寵物食品制造企業(yè)普及的主要障礙。

2.5.2生物傳感器生物傳感器通常是由生物受體（bioreceptors）和變頻系統(tǒng)（transducing system）兩部分構(gòu)成。生物受體是生物分子識(shí)別原件，可以與待檢物質(zhì)（如沙門(mén)菌）發(fā)生生物化學(xué)反應(yīng)，變頻系統(tǒng)也可以稱(chēng)作信號(hào)轉(zhuǎn)換系統(tǒng)，可以將生物受體與待檢物質(zhì)的反應(yīng)信號(hào)轉(zhuǎn)換成可進(jìn)一步處理的電信號(hào)或光學(xué)信號(hào)。通?？梢苑譃榭贵w或抗原、酶、核酸（DNA）、細(xì)胞或細(xì)胞結(jié)構(gòu)以及噬菌體五大類(lèi)。實(shí)際應(yīng)用的生物傳感器中以酶、抗體和核酸三類(lèi)生物受體為主。例如，Yang Song等[12]建立以切口酶（一種限制性?xún)?nèi)切酶）為輔助的生物傳感器，E Delibato等[6]建立以沙門(mén)菌的單克隆抗體和多克隆抗體作為生物受體的免疫傳感器；Xiaoyuan Ma等[13]建立以適體（與靶分子特異性結(jié)合的寡核苷酸序列）為生物受體的電化學(xué)生物傳感器。這幾種傳感器都實(shí)現(xiàn)對(duì)寵物食品中沙門(mén)菌的檢測(cè)，表現(xiàn)出較高的敏感性和特異性，并具有檢測(cè)快速和操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)。此外，也有學(xué)者將電化學(xué)阻抗技術(shù)引入生物傳感器中，檢測(cè)結(jié)果也表現(xiàn)出了較高的敏感性。

3　結(jié)語(yǔ)與展望

雖然僅僅依靠檢測(cè)手段并不會(huì)從根本上降低寵物食品中的沙門(mén)菌等微生物含量，但卻能輔助生產(chǎn)者實(shí)現(xiàn)對(duì)寵物食品原料供應(yīng)、生產(chǎn)、存儲(chǔ)以及運(yùn)輸?shù)拳h(huán)節(jié)的科學(xué)管理和監(jiān)控，從根本上降低寵物食品中沙門(mén)菌等有害微生物污染的風(fēng)險(xiǎn)。傳統(tǒng)微生物學(xué)方法是檢測(cè)沙門(mén)菌的標(biāo)準(zhǔn)方法，然而檢測(cè)耗時(shí)就成為該技術(shù)在實(shí)際應(yīng)用中的“瓶頸”。鑒于此，分子生物學(xué)技術(shù)、免疫學(xué)技術(shù)、快速檢測(cè)試劑（盒）以及自動(dòng)化檢測(cè)儀器等檢測(cè)技術(shù)手段的引入，豐富寵物食品中沙門(mén)菌的檢測(cè)方法，滿(mǎn)足寵物食品工業(yè)批量準(zhǔn)確快速檢測(cè)的需要。隨著技術(shù)的不斷更新，我們相信會(huì)有越來(lái)越多的先進(jìn)技術(shù)會(huì)被用于寵物食品中沙門(mén)菌的檢測(cè)，寵物食品中沙門(mén)菌的檢測(cè)技術(shù)也將更精確、簡(jiǎn)便和快捷，提升寵物食品安全，為伴侶動(dòng)物和人類(lèi)健康提供保障。

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通訊作者：夏兆飛，E-mail：drxia@126.com

作者簡(jiǎn)介：孫玉祝（1988-），男，碩士，主要從事小動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)和內(nèi)科學(xué)研究，E-mail：vetsunyuzhu@126.com

收稿日期：2014-12-17

中圖分類(lèi)號(hào)：S852.61+2

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：B

文章編號(hào)：0529- 6005（2016）01- 0087- 03