劉　晶，楊桂連，王春鳳，姜延龍

（吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院 吉林省動(dòng)物微生態(tài)制劑工程研究中心，吉林 長(zhǎng)春 130118）

乳酸菌作為DNA疫苗載體的研究進(jìn)展

劉晶，楊桂連，王春鳳，姜延龍

（吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院 吉林省動(dòng)物微生態(tài)制劑工程研究中心，吉林 長(zhǎng)春 130118）

乳酸菌（lactic acid bacteria，LAB）屬于革蘭陽(yáng)性、兼性厭氧菌，其基因組中GC含量較低，是一類可以利用碳水化合物發(fā)酵產(chǎn)生乳酸的一類菌的總稱，包括腸球菌、乳桿菌、乳球菌、明串珠菌、片球菌、鏈球菌和雙歧桿菌等眾多種屬，被廣泛地應(yīng)用于食品發(fā)酵、醫(yī)藥生產(chǎn)、保健藥物及飼料添加劑等工業(yè)，美國(guó)食品和藥品監(jiān)督管理局（FDA）將乳酸菌認(rèn)定為安全的食品級(jí)微生物[1]。乳酸菌最重要的特點(diǎn)是具有高度安全性，已成為一種新型載體[2]，替代了像病原微生物、脂質(zhì)體和微粒子等各種細(xì)菌的弱毒菌株之類的載體。

1　乳酸菌表達(dá)系統(tǒng)的特點(diǎn)

乳酸菌作為一種原核表達(dá)系統(tǒng)，在保證機(jī)體安全的前提下，能夠發(fā)揮持續(xù)且高效的免疫力。Pouwels等人[3]的試驗(yàn)表明，乳酸桿菌表達(dá)系統(tǒng)可將外源蛋白表達(dá)于菌體細(xì)胞內(nèi)，且能誘發(fā)針對(duì)該抗原的局部或全身黏膜免疫應(yīng)答，并表明乳酸桿菌作為活菌的疫苗抗原載體能夠表現(xiàn)出較高的安全性。LAB之所以能作為極具應(yīng)用前景的理想抗原呈遞載體，原因有以下幾點(diǎn)：（1）易培養(yǎng)，且某些菌種可構(gòu)建出新的表達(dá)載體系統(tǒng)；（2）遺傳操作方法簡(jiǎn)便、重復(fù)性好且效率高；（3）能保障基因工程產(chǎn)品的相對(duì)安全性，構(gòu)建出可供直接口服的食品級(jí)表達(dá)系統(tǒng)；（4）具有高度可調(diào)控的啟動(dòng)子系統(tǒng)，能表達(dá)毒素基因；（5）外源蛋白在細(xì)胞內(nèi)外均可獲得良好的表達(dá)效果；（6）能夠有效引起機(jī)體的免疫反應(yīng)和免疫耐受，且持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)；（7）乳酸菌安全，表達(dá)的外源蛋白無(wú)需進(jìn)行純化，就可直接連同菌體一起服用。

2　DNA疫苗

DNA疫苗又稱核酸疫苗或基因疫苗，是在分子生物學(xué)技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的第3代新型疫苗，其生產(chǎn)過(guò)程主要是借助基因重組技術(shù)，定向構(gòu)建含病原體抗原基因片段的重組DNA真核表達(dá)載體。

2.1DNA疫苗的優(yōu)點(diǎn)相對(duì)于原核表達(dá)，DNA疫苗最大的優(yōu)點(diǎn)是其可以在遞送病毒或寄生蟲(chóng)抗原的過(guò)程中，對(duì)抗原表位進(jìn)行翻譯后的糖基化加工，這對(duì)某些抗原表位的構(gòu)象非常重要，而原核表達(dá)系統(tǒng)中沒(méi)有糖基化過(guò)程，因此更適用于原核病原菌。

2.2DNA疫苗的不足 作為一種基因調(diào)控手段，DNA疫苗必需攜帶外源基因，外源基因?qū)霗C(jī)體后，存在激活宿主內(nèi)源性原癌基因或使宿主抑癌基因失活的可能性，并且疫苗具有較低的免疫原性[4]，還能引發(fā)機(jī)體產(chǎn)生抗DNA抗體，人們已檢測(cè)出DNA疫苗并沒(méi)有相關(guān)整合到宿主細(xì)胞的基因組[5]。

3　乳酸菌在DNA疫苗中的作用

乳酸菌屬于食品級(jí)的細(xì)菌，其本身可作為DNA疫苗載體，但無(wú)侵入能力，因此遞送DNA的能力不強(qiáng)；而一些弱致病菌如減毒沙門(mén)菌由于其可侵入到細(xì)胞中，可以更好的遞送DNA。因此可模擬病原菌的侵入過(guò)程，構(gòu)建侵入型重組乳酸菌，使其具有更好的遞送能力。

乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）是一種較為典型的乳酸菌，由于其沒(méi)有致病性，所以較安全。乳酸乳球菌可以大量產(chǎn)生并遞送抗原及細(xì)胞因子，最近已成為口服DNA疫苗的運(yùn)載工具。為了增加DNA的遞送能力，科研人員對(duì)乳酸菌進(jìn)行了改造以期獲得具有侵入能力的乳酸菌。金黃色葡萄球菌是一種具有侵入宿主細(xì)胞能力的病原菌，研究表明其細(xì)菌表面表達(dá)的纖連蛋白結(jié)合蛋白A（FnBPA）對(duì)其侵入能力至關(guān)重要[6]，因此在乳酸乳球菌中表達(dá)外源FnBPA后將使乳球菌本身獲得侵入細(xì)胞的能力。此外，一種被稱作pValac的新型質(zhì)粒也可在乳酸菌中進(jìn)行表達(dá)，進(jìn)而成為構(gòu)建真核DNA疫苗的一種載體，這種新型質(zhì)粒包括巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子（pCMV）和來(lái)自牛生長(zhǎng)激素（BGH）中的聚腺苷酸化序列（polyA）兩個(gè)部分?？蒲腥藛T將含有綠色熒光蛋白（GFP）的pValac質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染至PK15及Caco-2細(xì)胞中并獲得了表達(dá)[7]。由于乳酸乳球菌沒(méi)有定植能力，因此只能在黏膜水平上對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行加工傳遞[8]，并且乳酸乳球菌在體內(nèi)和體外[9]均能將功能完整的質(zhì)粒遞送到真核細(xì)胞中。為了進(jìn)一步提高乳酸菌的細(xì)胞侵入能力，科研人員在乳酸乳球菌中表達(dá)了外源蛋白FnBPA和InIA（產(chǎn)單核細(xì)胞內(nèi)化蛋白），并通過(guò)體內(nèi)試驗(yàn)和體外試驗(yàn)檢測(cè)FnBPA及InIA的表達(dá)情況。試驗(yàn)結(jié)果表明，外源侵入型蛋白的表達(dá)有效增強(qiáng)了乳酸菌的細(xì)胞侵入能力。Danie?la Pontes和Silvia Innocentin等人[10]已證明了表達(dá)FnBPA的乳酸菌菌株FnBPA+是體內(nèi)傳遞質(zhì)粒的最佳選擇載體，而且不管是在體內(nèi)的胃腸道中還是在體外細(xì)胞中，表達(dá)了FnBPA或InIA的乳酸乳球菌都能提高質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移效率[11]。

乳酸菌中另一典型的菌種則是乳桿菌屬中的植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum），此菌具有免疫調(diào)節(jié)作用，同時(shí)具有佐劑的特性[12]。之前有研究表明，植物乳桿菌能夠?qū)︶t(yī)學(xué)上重要的蛋白質(zhì)進(jìn)行改進(jìn)，并且能夠以多種方式對(duì)其進(jìn)行表面錨定。由于乳酸菌能夠?qū)DNA遞送到宿主細(xì)胞，因此為了提高乳酸菌遞送DNA的能力，Michon Christophe和 Katarzyna Kuczkowska等人[13]構(gòu)建了表面錨定表達(dá)針對(duì)DEC-205的重組單鏈抗體（aDec）的植物乳桿菌。DEC-205是位于樹(shù)突狀細(xì)胞（dendritic cells，DCs）表面的一個(gè)受體。其特異性抗體在乳桿菌表面表達(dá)能增強(qiáng)乳桿菌對(duì)DC的靶向作用及結(jié)合能力，從而提高cDNA向DC的傳遞能力。無(wú)論是在體外的細(xì)胞中還是在體內(nèi)的胃腸道中，aDec在菌種表面上的表達(dá)都能提高質(zhì)粒由乳酸菌進(jìn)入到樹(shù)突狀細(xì)胞的傳遞效率。

針對(duì)上述對(duì)乳酸乳球菌和植物乳桿菌的介紹，可見(jiàn)構(gòu)建一種侵入型的乳酸菌，使其作為DNA疫苗的載體，這對(duì)DNA疫苗傳遞載體的選擇至關(guān)重要。

4　乳酸菌作為DNA疫苗載體的優(yōu)勢(shì)

使用乳酸菌作為DNA疫苗載體具有以下幾點(diǎn)優(yōu)勢(shì)：（1）口服DNA疫苗載體能夠通過(guò)誘導(dǎo)局部的IgA免疫反應(yīng)產(chǎn)生特異性保護(hù)對(duì)抗食物過(guò)敏；（2）與裸質(zhì)粒DNA的免疫進(jìn)行對(duì)比，不需要進(jìn)一步的質(zhì)粒擴(kuò)增和純化，能夠降低成本和勞動(dòng)；（3）乳酸菌是食品級(jí)的細(xì)菌，與類似的傳遞病原體的系統(tǒng)相比，能傳遞只編碼所需抗原的基因；（4）可避免像減毒沙門(mén)細(xì)菌作為疫苗載體的一些缺點(diǎn)。

5　展望

自從乳酸菌的第一次報(bào)道至今已有20多年歷史，關(guān)于乳酸菌作為疫苗載體的許多研究均有報(bào)道。大多數(shù)研究者使用乳酸菌作為外源蛋白載體對(duì)人體進(jìn)行免疫，從而抵抗通過(guò)消化道和呼吸道黏膜進(jìn)入人體內(nèi)的病原體。由于DNA疫苗與傳統(tǒng)疫苗相比沒(méi)有主動(dòng)侵入性，是一個(gè)依賴載體的被動(dòng)俘獲過(guò)程，因此可模擬病原菌的侵入過(guò)程，從而能更好的將DNA遞送到細(xì)胞內(nèi)?？梢?jiàn)乳酸菌作為DNA疫苗載體具有很好的研究?jī)r(jià)值[14]，將會(huì)成為未來(lái)研究熱點(diǎn)。

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Q78文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

0529-6005（2016）07-0067-02

2015-08-10

國(guó)家863計(jì)劃項(xiàng)目（2013AA102806，2011AA10A215）；國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31272552，31272541）；吉林省科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目（20111816）；吉林省世行貸款農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全項(xiàng)目（2011-Y07）

劉晶（1991-），女，碩士生，研究方向動(dòng)物微生態(tài)與黏膜免疫學(xué)，E-ail：1558755144@qq.com

姜延龍，E-mail：yjiang81@126.com