暢麗芳

(吉林省五星動(dòng)物保健藥廠吉林長春130062)

犬致病性大腸桿菌分離與鑒定的臨床意義

暢麗芳

(吉林省五星動(dòng)物保健藥廠吉林長春130062)

為了探究犬致病性大腸桿菌的耐藥性，以對臨床上的用藥進(jìn)行指導(dǎo)，本研究使用鑒別性的培養(yǎng)基將大腸桿菌從有腹瀉癥狀的犬肛拭子病料中分離出來，而后運(yùn)用生理生化以及分子生物學(xué)鑒定法對分離出來的菌株進(jìn)行鑒定，并且檢測它的致病性以及對藥物的敏感性。研究結(jié)果顯示，9份病料都分離出了大腸桿菌共9株，這其中的7株大腸桿菌都有致病性，其他們對臨床上一些常見的藥物（16種）有程度不一的耐藥性，有2株耐受16種抗生素，這值得臨床上高度重視。這些大腸桿菌菌株對復(fù)方新諾明、氨芐西林以及四環(huán)素等早期使用的藥物耐藥性更強(qiáng)，而對頭孢西丁、阿米卡星以及磷霉素則較為敏感，所以建議使用這3種藥治療有腹瀉癥狀的犬。

犬；大腸桿菌；分離；耐藥性當(dāng)前，腹瀉已經(jīng)是威脅犬類健康的一種重大疾病，特別是由犬瘟熱以及犬細(xì)小病毒導(dǎo)致的大腸桿菌繼發(fā)性感染嚴(yán)重降低了患病犬的存活率而在這兩種病的發(fā)展以及傳播中繼發(fā)性的細(xì)菌感染起到了主要的作用。有研究顯示[1]，在此過程中，繼發(fā)性感染的主要細(xì)菌是大腸桿菌與沙門菌。而在我國，對于寵物的臨床治療工作中使用抗生素方面往往不謹(jǐn)慎不合理，使得大腸桿菌具有耐藥性且其耐藥性在不斷的變強(qiáng)。而寵物身體攜帶的耐藥性較強(qiáng)的菌在寵物和人接觸的過程中可能會(huì)傳染給人，進(jìn)而危害到人的健康。所以，分離和堅(jiān)定犬致病性大腸桿菌在臨床上有重要的意義。

1 材料和方法

1.1 采集樣品

從本動(dòng)物醫(yī)院采集出現(xiàn)腹瀉癥狀的犬9只，其中有5只犬是患有細(xì)小病毒病，2只是患了犬瘟熱，另外2只是普通腹瀉。使用滅過菌的棉拭子從每只犬的肛門處進(jìn)行糞便的采集工作，將采集物放置到試管中，加入適量的經(jīng)過滅菌處理的生理鹽水，而后將試管放置在搖床上進(jìn)行為期4 h的震蕩操作，而后放置備用。

1.2 主要試劑

營養(yǎng)肉湯（可用瓊脂替代），伊紅美蘭、麥康凱以及三糖鐵培養(yǎng)基，藥敏紙片，大腸桿菌ATCC29213以及ATCC25922，金黃色葡萄球菌ATCC25923以及細(xì)菌生化反應(yīng)管

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

購買清潔級(jí)的ICR小鼠。

1.4 細(xì)菌的分離培養(yǎng)按照一定的比例稀釋采集得到的樣品，將稀釋液涂在麥康凱瓊脂平板上，在37℃的恒溫條件下培養(yǎng)48 h以后仔細(xì)查看菌落的生長狀況。從中挑呈粉紅色的單個(gè)的菌落接種到伊紅美蘭培養(yǎng)基中，在恒溫37℃的環(huán)境下培養(yǎng)48 h。仔細(xì)觀察菌落的生長情況，從中挑選單個(gè)的顏色呈紫黑色并且?guī)в薪饘俟鉂傻木渲谱骷?xì)菌的涂片，而后進(jìn)行革蘭氏染色，進(jìn)行顯微鏡檢測。

1.5 PCR鑒定

按照煮沸法來進(jìn)行PCR模板的制備工作，首先挑取單個(gè)的菌落接種到營養(yǎng)肉湯中，37℃恒溫環(huán)境下培養(yǎng)一夜，取1 mL的培養(yǎng)物在每分鐘10 000轉(zhuǎn)的離心機(jī)上離心1 min，棄掉上清液并加200μL超純水，進(jìn)行重懸并15 min的沸水浴，每分鐘10 000轉(zhuǎn)的離心機(jī)上進(jìn)行2分鐘離心后上清液就是DNA模板。

在PCR反應(yīng)體系中加入足量的引物、DNA模板、PCR Mix以及超純水，在一定的條件下進(jìn)行反應(yīng)，得到的產(chǎn)物在2%的瓊脂糖凝膠電泳上進(jìn)行檢測。將大腸桿菌ATCC29213和金黃葡萄球菌ATCC25923分別作為陽性和陰性的對照物。

1.6 小鼠致病性試驗(yàn)

將經(jīng)過鑒定的9株大腸桿菌接種在營養(yǎng)肉湯中，37℃恒溫下培養(yǎng)一夜，進(jìn)行離心操作以后加入等量的經(jīng)過滅活的生理鹽水進(jìn)行重懸，而后進(jìn)行梯度稀釋并計(jì)數(shù)菌落。把細(xì)菌的濃度調(diào)到107 CFU/mL左右，接種在每只平均重量在20 g左右的小鼠的腹腔中，劑量為每只接種0.2 mL，每10只分成一組。對照組則給小鼠接種相同劑量的經(jīng)過滅菌處理過的生理鹽水。隔離喂養(yǎng)接種的小鼠，觀察和記錄其發(fā)病和死亡的情況。一旦發(fā)現(xiàn)死亡的小鼠馬上進(jìn)行解剖在無菌條件下取肝及脾在麥康凱平板上劃線培養(yǎng)[2]。

1.7 藥敏試驗(yàn)

利用制片擴(kuò)散法對9株大腸桿菌對于16種抗生素的敏感性進(jìn)行檢測。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌分離培養(yǎng)

采集到的9份樣品中分離出9株細(xì)菌，它們在麥康凱培養(yǎng)基上出現(xiàn)邊緣整齊的直徑在1～2 mm的圓形菌落，四周為粉紅色而中心呈深紅色。在伊紅美蘭培養(yǎng)基上出現(xiàn)邊緣整齊的圓形菌落，呈現(xiàn)紫黑色并伴有金屬光澤。進(jìn)行革蘭氏染色后鏡檢可以看見中等大小兩端鈍圓且無芽孢，呈紅色多分散的桿菌。這與大腸桿菌的培養(yǎng)結(jié)果相符。

2.2 PCR鑒定

分離出的9株菌與大腸桿菌ATCC29213一樣都能擴(kuò)增出262bp的目的基因，而金黃色葡萄球菌則沒有擴(kuò)增。說明分離出來的9株菌是大腸桿菌。

2.3 小鼠致病性試驗(yàn)

接種生理鹽水的對照組小鼠沒有任何癥狀，十分健康。而實(shí)驗(yàn)組小鼠中，接種5、7號(hào)菌株的小鼠無異常癥狀。其他小鼠在接種后2 h出現(xiàn)拉稀癥狀，且出現(xiàn)厭食、昏睡以及扎堆等癥狀，還有部分出現(xiàn)抽搐以及癱瘓的癥狀。第2～3天有死亡小鼠出現(xiàn)。解剖后在無菌條件下取肝脾在培養(yǎng)基上劃線重新分離得到了紅色的大腸桿菌。9菌株中有7株是致病性的大腸桿菌，2株未引起病變可能是犬腸道內(nèi)的正常菌群里的大腸桿菌。

2.4 藥敏試驗(yàn)

藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，在7株致病性的大腸桿菌里，6及8號(hào)菌株對全部的抗生素（16種）都表現(xiàn)出了耐藥性，且有超過半數(shù)的菌株都對慶大霉素、阿莫西林、四環(huán)素、氨芐西林、哌拉西林以及磺胺異惡唑和復(fù)方新諾明出現(xiàn)耐藥性。而對阿米卡星、磷霉素、頭孢西丁則較為敏感。

3 討論

導(dǎo)致犬發(fā)生腹瀉的因素十分的復(fù)雜，臨床上可將主要的病因劃分為細(xì)菌性和病毒性，而細(xì)菌性的病原體又分為大腸桿菌、彎曲桿菌等[3]，最常見的則是大腸桿菌導(dǎo)致的腹瀉。病毒性腹瀉中常見的有犬瘟熱以及犬細(xì)小病毒病，二者的誘因又是以大腸桿菌和沙門菌為主。本實(shí)驗(yàn)中的7株致病菌導(dǎo)致小鼠出現(xiàn)嚴(yán)重程度不一的腹瀉以及死亡。

研究結(jié)果顯示，分離得到的大腸桿菌對早期使用的包括復(fù)方新諾明、氨芐西林以及四環(huán)素在內(nèi)的抗生素有極其強(qiáng)的耐藥性，而對于磺胺類藥物和慶大霉素也有較強(qiáng)的耐藥性，這與以往的一些報(bào)道相符。分離得到的菌株對頭孢西丁、阿米卡星和磷霉素都比較敏感，故而建議首先選擇這3種藥治療犬腹瀉癥。

分離得到的菌株表現(xiàn)出的耐藥性比較嚴(yán)重，甚至有多重買藥性的表現(xiàn)，有4株菌對超過10種以上的藥都有耐藥性，且有2株菌對本次試驗(yàn)選用的16種藥都有耐藥性，這應(yīng)當(dāng)引起廣泛的重視。因?yàn)榇竽c桿菌自身帶有耐藥的質(zhì)粒，而且這一質(zhì)粒能夠在菌體之間傳遞，故而菌株極容易對藥物產(chǎn)生耐藥性[4]。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)誘發(fā)菌株的耐藥譜多種多樣的主要因素使寵物患病的時(shí)候不正確的用藥觀念和不合理的用藥做法[5]。故而，在臨床實(shí)踐上要謹(jǐn)慎的用藥，如果條件允許要先做藥敏試驗(yàn)，以保證疾病得到治療的同時(shí)避免細(xì)菌出現(xiàn)耐藥性的概率以及減少其傳遞?！?/p>

（編輯：趙曉松）

[1]胡曉辰,孫艷敏,郭鳳英,趙婷婷.犬源大腸桿菌的分離鑒定及藥敏試驗(yàn)[J].當(dāng)代畜牧,2015,18(3):42-44.

[2]趙相勝,孫洋,紀(jì)雪,劉軍,祝令偉,佟盼盼,馮書章.犬源大腸桿菌分離鑒定及耐藥性分析[J].中國人獸共患病學(xué)報(bào), 2014,30(3):268-272.

[3]崔耀明,宋笑顏,王玲飛,劉保光,田亞凱,胡功政.犬源大腸桿菌分離株對四環(huán)素類藥物耐藥性的檢測[J].江西農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2015,27(10):104-107.

[4]曹旭.淺談犬腹瀉的幾種常見原因和防治[J].山東畜牧獸醫(yī),2015,36(12): 30-31.

[5]高新菊,侯羽濃,姚大偉,丁陽,楊德吉.犬致病性大腸桿菌的分離與鑒定[J].畜牧與獸醫(yī),2014,46(11):87-89.

10.3969/j.issn.1008-4754.2016.12.044