治丁銘　劉　巖　趙鴻飛　李　凡　張　朕　張　卓

(長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)，吉林　長(zhǎng)春　130117)

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針刺對(duì)大鼠心肌組織細(xì)胞因子的影響

治丁銘劉巖趙鴻飛1李凡2張朕張卓3

(長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)，吉林長(zhǎng)春130117)

摘要〔〕目的探討針刺腎俞、心俞、內(nèi)關(guān)穴治療慢性心力衰竭(CHF)的機(jī)制。方法將30只雄性Wistar大鼠分為對(duì)照組、卡托普利治療組(25 mg/kg,1次/d)、針刺治療組(針刺腎俞、心俞、內(nèi)關(guān)穴，30 min/d)。復(fù)制CHF模型，2 w后，取大鼠心臟左室組織，采用酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法檢測(cè)大鼠血清腫瘤壞死因子(TNF)-α、SP法檢測(cè)大鼠心肌TNF-α、免疫組化SABC法檢測(cè)大鼠心肌白細(xì)胞介素(IL)-6表達(dá)水平，同時(shí)觀察大鼠心肌組織形態(tài)學(xué)改變。結(jié)果卡托普利治療組、針刺組心肌中TNF-α、IL-6水平低于對(duì)照組(P<0.05或P<0.01)；卡托普利治療組和針刺組TNF-α、IL-6水平無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論針刺和卡托普利治療均可通過(guò)降低炎癥細(xì)胞因子改善心室重塑，而針刺治療與卡托普利治療效果無(wú)顯著差異，可一定程度替代或作為西藥治療的有益補(bǔ)充，神經(jīng)體液調(diào)節(jié)可能是其發(fā)揮治療作用的機(jī)制。

關(guān)鍵詞〔〕針刺；慢性心力衰竭；腫瘤壞死因子-α；白細(xì)胞介素-6

1吉林省中醫(yī)藥管理局2吉林省人民醫(yī)院骨科

3柳河縣衛(wèi)生和計(jì)劃生育局

第一作者：治丁銘(1983-)，女，碩士，講師，主要從事心血管疾病文獻(xiàn)與臨證治療研究。

各種病因引起的心肌細(xì)胞損傷將會(huì)導(dǎo)致心室重塑。持續(xù)不斷的心室重塑最終發(fā)展至心力衰竭〔1〕。Blankesteijn等〔2〕研究發(fā)現(xiàn)急性心肌梗死12 h出現(xiàn)免疫炎癥反應(yīng)，其在心力衰竭的發(fā)生中發(fā)揮重要作用。有研究證實(shí)，針刺俞穴可減少心肌缺血再灌注的損傷，對(duì)免疫系統(tǒng)和心血管系統(tǒng)有良好的調(diào)節(jié)作用〔3〕。本實(shí)驗(yàn)從免疫和炎癥的角度，對(duì)試驗(yàn)動(dòng)物心肌組織腫瘤壞死因子(TNF)-α和白細(xì)胞介素(IL)-6水平進(jìn)行監(jiān)測(cè)，初步探討針刺對(duì)慢性心力衰竭(CHF)大鼠治療的機(jī)制。

1材料

1.1動(dòng)物健康SPF級(jí)，Wistar雄性大鼠30只，體質(zhì)量200～250 g，由吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。

1.2試劑和藥物大鼠(IL)-6免疫組化試劑盒購(gòu)于上海彩佑實(shí)業(yè)有限公司；大鼠TNF-α酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)檢測(cè)試劑盒購(gòu)于上海嵐派生物科技有限公司；SABC免疫組化試劑盒(博士德公司，武漢)；羊抗大鼠TNF-α多抗(R&D，美國(guó))；卡托普利(12.5 mg，批號(hào)：H31022986)，由中美上海施貴寶制藥有限公司生產(chǎn)；小動(dòng)物呼吸機(jī)RWD407(深圳市瑞沃德生命科技有限公司)；OLYMPUS生物顯微鏡(日本OLYMPUS公司)。

1.3方法

1.3.1CHF模型復(fù)制30只雄性Wistar大鼠，隨機(jī)分為3組，每組10只1籠，標(biāo)記后飼養(yǎng)在恒溫、恒濕的飼養(yǎng)室內(nèi)，標(biāo)準(zhǔn)飼料和純凈水供其隨機(jī)取食。大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w后進(jìn)行模型復(fù)制。心衰大鼠模型采用冠狀動(dòng)脈結(jié)扎法。首先將Wistar大鼠腹腔麻醉，背部固定，行氣管插管，以小動(dòng)物呼吸機(jī)行正壓呼吸，在胸部4～5肋間開(kāi)胸，暴露心臟，在距主動(dòng)脈根部5 mm處(肺動(dòng)脈圓錐和左心耳)之間結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支，建立心衰模型，結(jié)扎后心室壁顏色變暗,心電圖檢查顯示ST段抬高伴肢體導(dǎo)聯(lián)R波高尖,即為結(jié)扎成功。建模成功后，腹腔注射青霉素40萬(wàn)U/只以預(yù)防感染。用心導(dǎo)管和超聲心動(dòng)圖確認(rèn)CHF模型復(fù)制成功后開(kāi)始治療。

1.3.2治療方法

1.3.2.1針刺依據(jù)華氏等研制的大鼠穴位圖譜作為大鼠穴位選擇的標(biāo)準(zhǔn)，選取大鼠內(nèi)關(guān)穴、心俞穴、腎俞穴進(jìn)行針刺，針刺采用30號(hào)1寸毫針，手法采用捻轉(zhuǎn)瀉法，捻轉(zhuǎn)幅度為3～4圈，捻轉(zhuǎn)頻率為3～4個(gè)/s往復(fù)，每次行針10～15，留針20～30 min，留針期間行針2～4次，每天治療1次。

1.3.2.2給藥卡托普利按體質(zhì)量折算(25 mg/kg)灌胃給藥，每天灌服1次，連續(xù)治療2 w。對(duì)照組只復(fù)制模型，不進(jìn)行治療。

1.3.3動(dòng)物處理治療2 w后將Wistar大鼠稱重，然后用1%戊巴比妥鈉按30 mg/kg的劑量腹腔注射進(jìn)行麻醉，麻醉后迅速摘取大鼠心臟組織并分別進(jìn)行標(biāo)本處理。

1.3.4TNF-α檢測(cè)血液TNF-α：抽取大鼠下腔靜脈血3 ml，3 000 r/min離心10 min，分離上清液。用ELISA法來(lái)測(cè)定大鼠血清TNF-α的濃度。心肌組織TNF-α：采用羊抗大鼠TNF-α多抗，采用SP法進(jìn)行檢測(cè)，棕色和黃色顆粒代表陽(yáng)性反應(yīng)部位。

1.3.5IL-6檢測(cè)采用免疫組化SABC 法(按說(shuō)明書(shū)操作)后用BH-2型OLYMPUS生物顯微鏡(日本OLYMPUS公司)觀察,并使用BI-2000微循環(huán)和醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行測(cè)量。在400倍顯微鏡下,每組觀察10張切片,每張切片隨機(jī)選取10個(gè)不連續(xù)的視野計(jì)算出單位視野中的IL-6免疫陽(yáng)性細(xì)胞個(gè)數(shù)(即數(shù)密度)及免疫陽(yáng)性細(xì)胞所占單位視野中的陽(yáng)性反應(yīng)總面積(即面密度)。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS19.0軟件進(jìn)行單因素方差分析和t檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1三組TNF-α水平比較與對(duì)照組〔(38.20±2.11)ng/ml〕相比，針刺組、卡托普利組血清TNF-α〔(34.37±2.75)ng/ml，(35.07±2.59)ng/ml〕顯著下降(P<0.05或P<0.01)。心肌組織免疫組化染色顯示，對(duì)照組TNF-α蛋白呈陽(yáng)性染色，針刺組和卡托普利組蛋白染色較對(duì)照組弱。

2.2三組IL-6水平比較顯微鏡觀察結(jié)果顯示,三組大鼠的心肌細(xì)胞中均可見(jiàn)IL-6免疫陽(yáng)性細(xì)胞的存在,心肌細(xì)胞胞質(zhì)中都含有特異性的棕黃色陽(yáng)性反應(yīng)顆粒。組間數(shù)密度比較，對(duì)照組(4.68±0.23)高于針刺組和卡托普利組〔(4.12±0.32)，(4.26±0.37)〕(P<0.05或P<0.01)，而針刺組和卡托普利組無(wú)顯著差異(P>0.05)；組間面密度比較,對(duì)照組(10.41±0.62)高于卡托普利組(9.35±0.28)和針刺組(9.10±0.61)(P<0.01),而針刺組和卡托普利組之間差異不顯著。

2.3心肌顯微結(jié)構(gòu)改變光鏡下見(jiàn)對(duì)照組心肌細(xì)胞排列紊亂，局灶性壞死，纖維化，間質(zhì)增生，瘢痕形成，殘余部分心肌細(xì)胞肥大。針刺組及卡托普利組大鼠心肌組織改變情況較對(duì)照組有不同程度的改善。

3討論

心力衰竭是臨床常見(jiàn)的病理狀態(tài)，為多心血管病的末期表現(xiàn)之一，可分為急性或CHF，左心、右心或全心衰竭。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外的學(xué)者開(kāi)始關(guān)注細(xì)胞因子在CHF發(fā)病中的作用，越來(lái)越多的臨床和基礎(chǔ)試驗(yàn)表明，細(xì)胞因子在CHF發(fā)病中發(fā)揮著重要的作用。TNF-α是由激活的巨噬細(xì)胞分泌的炎性因子，具有多種生物學(xué)效應(yīng)，心力衰竭時(shí)血清TNF-α可見(jiàn)升高。Levine等〔4,5〕先后發(fā)現(xiàn)輕中度心力衰竭患者TNF-α即開(kāi)始升高，惡病質(zhì)患者血中TNF-α水平可見(jiàn)升高，且TNF-α升高與心功能分級(jí)和死亡率呈正相關(guān)。Kitaoka 等〔6〕觀察發(fā)現(xiàn)心力衰竭患者的TNF-α等血清表達(dá)水平與心力衰竭程度呈正相關(guān)，Yokoyama等〔7〕發(fā)現(xiàn)，TNF-α能加速心肌細(xì)胞蛋白質(zhì)的合成，并能減慢心肌細(xì)胞蛋白質(zhì)分解，使肌動(dòng)蛋白合成數(shù)量，同時(shí)TNF-α還能改變細(xì)胞外基質(zhì)，導(dǎo)致心肌肥厚。

IL-6是主要血管內(nèi)皮細(xì)胞和單核巨噬細(xì)胞生成的主要炎癥反應(yīng)性介質(zhì)，可參與、可介導(dǎo)許多疾病的發(fā)生和發(fā)展。Feldman等〔8〕研究發(fā)現(xiàn)，IL-6和功能不全、心肌肥厚、肺水腫等心力衰竭的臨床癥狀有關(guān)。Bryant等〔9〕研究發(fā)現(xiàn)，IL-6能刺激心肌成纖維細(xì)胞快速增生,促進(jìn)心肌蛋白質(zhì)加速分解,誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡而損害心功能。TNF-α、IL-6可長(zhǎng)期影響心肌重塑，參與CHF的病理生理過(guò)程。通過(guò)治療TNF-α、IL-6等細(xì)胞因子的變化可推測(cè)治療方法可能的作用機(jī)制。

本研究提示心力衰竭時(shí)心臟本身是合成釋放TNF-α和IL-6 的重要來(lái)源之一。心臟合成釋放TNF-α和IL-6再反過(guò)來(lái)作用于心臟，再次引發(fā)或加重心力衰竭。這也說(shuō)明，炎癥因子在CHF發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用。

在中醫(yī)上，CHF屬于“胸痹”、“心痛”、“心悸”等范疇。心氣不足、胸陽(yáng)不振、血行閉阻等是常見(jiàn)中醫(yī)學(xué)病因，針灸可調(diào)整臟腑功能，疏通經(jīng)脈、振奮陽(yáng)氣，符合CHF治療益心氣、振心陽(yáng)、通心脈的治療原則。李子勇等〔10〕研究顯示，針刺能改善CHF患者的血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)，降低氨基末端腦鈉肽前體(NT-pro-BNP)水平，降低急性生理與慢性健康狀況(APACHEⅡ)評(píng)分。 心俞是心的背俞穴，具有調(diào)理氣血、養(yǎng)心安神、寧心定志之功效，為歷代中醫(yī)名家治心胸病癥之要穴。對(duì)急性心肌缺血大鼠模型研究顯示，針刺心俞可影響血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)及改善心臟活動(dòng)性質(zhì)，針刺心俞及配穴后可使心肌張力降低，促進(jìn)心肌肥大的退縮〔10〕。內(nèi)關(guān)穴是手厥陰心包經(jīng)之絡(luò)穴，同時(shí)是八脈交會(huì)穴之一。有寬胸理氣、寧心安神、調(diào)補(bǔ)陰陽(yáng)氣血、緩急止痛、疏通經(jīng)脈的功效。腎俞穴具有宣肺通氣、疏調(diào)上焦之效，是肺的背俞穴。針刺腎俞穴能改善肺功能，增加肺通氣量，中醫(yī)上，肺與心關(guān)系密切，肺主氣，心主血，那么肺與心的關(guān)系即為氣血關(guān)系，所以腎俞也用于與氣血關(guān)系最為相關(guān)的心血管系統(tǒng)疾病。

參考文獻(xiàn)4

1王愛(ài)民,王立君.心室重塑的研究進(jìn)展〔J〕.疑難病雜志，2008;7(2)：123-5.

2Blankesteijn WM,Creemers E,Lutgens E,etal.Dynamic of cardiac wound healing following myocardial infarction:observation in genetically altered mice〔J〕.Acta Physiol Scand,2001;173(1):75-82.

3呂君玲,李佰承,冷俊艷，等.針刺治療心肌缺血研究進(jìn)展與思路〔J〕.四川中醫(yī)，2014;32(6)：182-5.

4Levine B,Kalman J,Mayer A,etal.Elevated circulating levels of tumor necrosis factor in severe chronic heart failure〔J〕.N Engl J Med,1990;323(4):236-41.

5Torre-Amione G,Kapadia S,Benedict C,etal.Proinflammatory cytokine levels in patients with depressed left ventricular ejection fraction:a report from the studies of left ventricular dysfunction(SOLVD)〔J〕.J Am Coll Cardiol,1996;27(5):1201-6.

6Kitaoka H，Kubo T，Okawa M. Plasma adiponectin levels and left ventricular remodeling in hypertrophic cardiomyopathy〔J〕.Int Heart J，2010;51:51.

7Yokoyama T，Nakano M，Bendnarczyk JL，etal.Tumor necrosis factor-α provokes ahypertrophic growth response in adult cardiac myocytes〔J〕.Circulation，1997;95(5):1247-52.

8Feldman AM,Combed A,Wagnet D,etal.The role of tumor necrosis factor in the pathophysiology of heart failure〔J〕.J Am Coll Cardiol,2000;35:537-44.

9Bryant D,Backer L,Richardson J,etal.Cardiac failure intransgenic mice with myocardial expression of tumor necrosis factor-α〔J〕.Circulation,1998;97:1375-81.

10李子勇，老錦雄，潘清潔.針刺對(duì)慢性心力衰竭患者血流動(dòng)力學(xué)及心功能的影響〔J〕.上海針灸雜志，2012;7：480-2.

〔2015-06-24修回〕

(編輯曲莉/滕欣航)

通訊作者：張卓(1976-)，女，副教授，主要從事神經(jīng)系統(tǒng)疾病的診斷研究。

基金項(xiàng)目：吉林省中醫(yī)藥管理局科技項(xiàng)目(No.2014-J11;No.2014-2C4)

中圖分類號(hào)〔〕R541.4〔

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A〔

文章編號(hào)〕1005-9202(2016)01-0019-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.01.008