陳　帥，王慧竹，王萬(wàn)超，崔喜秀

(1.吉林化工學(xué)院 化學(xué)與制藥工程學(xué)院，吉林 吉林 132022；2.沈陽(yáng)藥科大學(xué) 藥學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110016)

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酶聯(lián)半仿生法提取虎杖中白藜蘆醇工藝研究

陳帥1，2，王慧竹1，王萬(wàn)超1，崔喜秀1

(1.吉林化工學(xué)院 化學(xué)與制藥工程學(xué)院，吉林 吉林 132022；2.沈陽(yáng)藥科大學(xué) 藥學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110016)

摘要：目的：優(yōu)選虎杖中白藜蘆醇的酶聯(lián)半仿生法提取工藝.方法：以白藜蘆醇提取率為指標(biāo)，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，根據(jù)星點(diǎn)試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，選取加酶量、酶解時(shí)間、酶解溫度3個(gè)因素進(jìn)行試驗(yàn)，利用響應(yīng)面法優(yōu)選提取工藝.結(jié)果：優(yōu)選的提取工藝為加酶量1.7 mg·g-1，酶解溫度55 ℃，酶解時(shí)間107 min.在此工藝條件下白藜蘆醇提取率達(dá)5.91%，與預(yù)測(cè)值5.94% 較為接近.結(jié)論：采用響應(yīng)面法優(yōu)選的提取工藝合理可行，具有良好的預(yù)測(cè)性.

關(guān)鍵詞：酶聯(lián)半仿生法；虎杖；白藜蘆醇

虎杖(Polygonurn cuspidatum Sieb．et Zucc)為蓼科蓼屬多年生草本植物，藥用部位為根及根莖，具有祛風(fēng)利濕、散瘀定痛、止咳化痰等功效[1].作為一種重要的中藥材原料，虎杖被廣泛用于治療腹瀉、發(fā)燒、關(guān)節(jié)痹痛、高血脂等癥[2].虎杖中的有效成分主要有蒽醌類成分和二苯乙烯類成分，其中以白藜蘆醇為代表的二苯乙烯類成分是虎杖發(fā)揮作用的主要功效成分.雖然有學(xué)者通過化學(xué)合成或生物合成制得白藜蘆醇[3]，或者從天然產(chǎn)物花生、葡萄中提取出白藜蘆醇，但大多數(shù)研究還是將虎杖作為提取白藜蘆醇的主要原料[4].實(shí)際生產(chǎn)中白藜蘆醇多用有機(jī)溶劑提取，如甲醇、乙醇、丙酮、石油醚、乙酸乙酯等，其中乙醇為最常用溶劑[5-6]，但大部分白藜蘆醇苷被包裹在植物細(xì)胞壁內(nèi)，一般的有機(jī)溶劑難以破壞細(xì)胞壁，提取率較低，而酶解作用可以使細(xì)胞壁疏松、破裂，從而減小傳質(zhì)阻力，加速有效成分的釋放，進(jìn)而提高提取率、提高原料的利用價(jià)值[7].半仿生法是模擬口服給藥及藥物經(jīng)胃腸道轉(zhuǎn)運(yùn)的原理，為經(jīng)消化道給藥的中藥制劑而設(shè)計(jì)的一種提取工藝[8-9].本文嘗試將生物酶和半仿生法結(jié)合起來提取白藜蘆醇，并采用響應(yīng)面法對(duì)提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，以期最大限度地提高白藜蘆醇的提取率，降低提取成本，為工業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據(jù).

1實(shí)驗(yàn)部分

1.1　試劑與儀器

虎杖(購(gòu)于吉林大藥房，干燥后粉碎機(jī)粉碎過40目篩，密封保存，備用)，白藜蘆醇對(duì)照品(批號(hào)：MUST-11050301，成都曼斯特生物科技有限公司)，纖維素酶(150 000 U·g-1，寧夏和氏璧生物技術(shù)有限公司)，其他試劑均為分析純.

TU1950 紫外分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)，PHS-25型數(shù)顯pH計(jì)(上海精密科學(xué)儀器有限公司)，W5-100SP 恒溫水浴鍋(上海申生科技有限公司)，F(xiàn)A2004N 電子分析天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司)，DZ-2BCⅡ真空干燥箱(天津泰斯特儀器有限公司).

1.2　實(shí)驗(yàn)過程

1.2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密稱定白藜蘆醇對(duì)照品5 mg，甲醇溶解并定容至25 mL，置于冰箱中備用.準(zhǔn)確吸取該溶液0.1，0.2，0.4，0.8，1.6 mL于10 mL容量瓶中，甲醇定容至刻度，搖勻，得系列對(duì)照品溶液.于305 nm下測(cè)定吸光度(A).以吸光度(A)對(duì)濃度(C)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程A=136.90C+0.043 0，R2=0.999 6，線性范圍2-32 μg·mL-1.

1.2.2供試品溶液的制備

準(zhǔn)確稱取虎杖粗粉1.0 g，定量加入檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液，調(diào)節(jié)pH 2.0，50 ℃恒溫振蕩2 h，過濾，濾渣中添加檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液，調(diào)節(jié)pH 7.5，50 ℃恒溫振蕩2 h，過濾，濾渣中添加檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液，調(diào)節(jié)pH為8.3，50 ℃恒溫振蕩2 h，過濾，合并3次濾液，減壓濃縮得虎杖提取液，置100 mL容量瓶中，定容即得.

1.2.3單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.3.1加酶量對(duì)白藜蘆醇提取率的影響

準(zhǔn)確稱取虎杖粗粉5份，每份1.0 g，固定酶解時(shí)間90 min，酶解溫度為50 ℃，分別按0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 mg·g-1加酶后進(jìn)行半仿生提取，合并3次濾液，減壓濃縮置于100 mL容量瓶中定容至刻度，按1.2.1方法測(cè)定白藜蘆醇吸光度，計(jì)算其提取率.

1.2.3.2酶解溫度對(duì)白藜蘆醇提取率的影響

準(zhǔn)確稱取虎杖粗粉5份，每份1.0 g，固定加酶量1.5 mg·g-1，酶解時(shí)間為90 min，分別按酶解溫度為30，40，50，60，70 ℃進(jìn)行半仿生提取，合并3次濾液，減壓濃縮置于100 mL容量瓶中定容至刻度，按1.2.1方法測(cè)定白藜蘆醇吸光度，計(jì)算其提取率.

1.2.3.3酶解時(shí)間對(duì)白藜蘆醇提取率的影響

準(zhǔn)確稱取虎杖粗粉5份，每份1.0 g，固定加酶量1.5 mg·g-1，酶解溫度為50 ℃，分別按酶解時(shí)間分別為30，60，90，120，150 min進(jìn)行半仿生提取，合并3次濾液，減壓濃縮置于100 mL容量瓶中定容至刻度，按1.2.1方法測(cè)定白藜蘆醇吸光度，計(jì)算其提取率.

1.2.4響應(yīng)面試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上確定加酶量(X1)、酶解溫度(X2)及酶解時(shí)間(X3)作為自變量，以白藜蘆醇提取率(Y)為響應(yīng)值，根據(jù)星點(diǎn)設(shè)計(jì)原理，每個(gè)因素設(shè)3個(gè)水平，分別用編碼值-1、0、1表示，因素水平設(shè)計(jì)如表1所示.

表1　因素水平表

2結(jié)果與討論

2.1　單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1加酶量對(duì)白藜蘆醇提取率的影響

由圖1可知，隨著加酶量的增加，提取率呈上升趨勢(shì)，當(dāng)加酶量為1.5 mg·g-1時(shí)，提取率最大，之后隨著加酶量的增加，提取率呈減小趨勢(shì).為進(jìn)一步考察加酶量對(duì)提取率的影響，分別選擇1.0、1.5、2.0進(jìn)行星點(diǎn)設(shè)計(jì)-響應(yīng)面實(shí)驗(yàn).

加酶量/(mg·g-1)圖1　加酶量對(duì)提取率的影響

2.1.2酶解溫度對(duì)白藜蘆醇提取率的影響

由圖2可知，其他條件不變的情況下，白藜蘆醇提取率先隨酶解溫度的升高而增加，說明隨著溫度的升高，白藜蘆醇的溶出量增多；在50 ℃時(shí)提取量達(dá)最大值；當(dāng)酶解溫度超過50 ℃后，白藜蘆醇提取率反而呈減少趨勢(shì)，說明過高的溫度可能會(huì)破壞白藜蘆醇中的某些活性成分，從而降低其提取率.為了進(jìn)一步考察酶解溫度對(duì)提取率的影響，選擇40、50、60 ℃進(jìn)行星點(diǎn)設(shè)計(jì)-響應(yīng)面試驗(yàn).

酶解溫度/℃圖2　酶解溫度對(duì)提取率的影響

2.1.3酶解時(shí)間對(duì)白藜蘆醇提取率的影響

由圖3可以看出，其他條件不變的情況下，白藜蘆醇的提取率隨著時(shí)間的增加而增加，但在90～150 min之間其變化不明顯.結(jié)合實(shí)際，選取60、90、120 min進(jìn)行星點(diǎn)設(shè)計(jì)-響應(yīng)面試驗(yàn).

酶解時(shí)間/min圖3　酶解時(shí)間對(duì)提取率的影響

2.2　響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果

響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果如表2所示.

利用 SAS 9.4軟件進(jìn)行多元回歸擬合分析，白藜蘆醇提取率對(duì)編碼自變量的二次回歸方程為：Y=-0.055 35 + 0.024 131*X1+ 0.002 375*X2+0.000 545*X3-0.011 923*X1*X1+ 0.000 15*X1*X2+0.000 067*X1*X3-0.000 035*X2*X2+0.000 012*X2*X3-6.062E-6*X3*X3

表2　響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)表及結(jié)果

對(duì)上述回歸方程各系數(shù)進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)及方差分析，結(jié)果如表3和表4所示.

表3　回歸系數(shù)顯著性檢驗(yàn)

注：* 為顯著(P<0.05)；** 為極顯著(P<0.001)

表4　回歸方程的方差分析

注：* 為顯著(P<0.05)；* * 為極顯著(P<0.01)

由表3可知，對(duì)白藜蘆醇提取率影響最顯著的因素為酶解時(shí)間，加酶量和酶解溫度對(duì)白藜蘆醇提取率影響也達(dá)到了顯著水平(Pr>F值均小于0.05)，由于加酶量的Pr>F值大于酶解溫度的Pr>F值，因此酶解溫度對(duì)白藜蘆醇提取率影響大于加酶量，綜上各因素對(duì)白藜蘆醇提取率的影響次序?yàn)椋好附鈺r(shí)間>酶解溫度>加酶量.

由表4可知[10-12]，回歸方程的Pr>F值小于0.001，說明所建立的二次多項(xiàng)式模型具有高度顯著性，線性項(xiàng)和二次項(xiàng)的Pr>F值小于0.001，說明其對(duì)白藜蘆醇的提取率的影響具有高度顯著性，模型的調(diào)整決定系數(shù)R2=96.20%，說明響應(yīng)值的變化有96.2%來源于所選變量，而失擬項(xiàng)Pr>F值大于0.05，影響不顯著，說明模型擬合度好，可以較好地描述各實(shí)驗(yàn)因素與響應(yīng)值之間的關(guān)系.響應(yīng)面為響應(yīng)值對(duì)兩兩交互因素所構(gòu)成的三維空間曲線圖，曲面越陡峭，表明該交互因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響越大，為了更加直觀表達(dá)兩個(gè)因素同時(shí)對(duì)白藜蘆醇提取率的影響，可以將其中一個(gè)因素的值固定為零水平對(duì)應(yīng)的值，僅考慮另外兩個(gè)因素對(duì)白藜蘆醇提取率的影響，根據(jù)回歸方程繪制響應(yīng)曲面圖和等高線圖，結(jié)果如圖 4-6所示.

圖4　加酶量和酶解溫度同時(shí)對(duì)白藜蘆醇提取率影響的相應(yīng)曲面圖和等高線圖

加酶量/(mg·g-1)圖5　加酶量和酶解時(shí)間對(duì)白藜蘆醇提取率影響的相應(yīng)曲面圖和等高線圖

酶解溫度/℃圖6　酶解溫度和酶解時(shí)間對(duì)白藜蘆醇提取率影響的相應(yīng)曲面圖和等高線圖

3結(jié)論

利用SAS軟件RSREG語(yǔ)句對(duì)模型進(jìn)行典型性分析，得出最佳工藝條件：加酶量1.659 mg·g-1，酶解溫度55.177 ℃，酶解時(shí)間為107.166 min，在此工藝條件下，白藜蘆醇提取率為5.94%，但考慮到實(shí)際情況，將上述最佳工藝條件修正為加酶量1.7 mg·g-1，酶解溫度55 ℃，酶解時(shí)間107 min.在此修正工藝條件下進(jìn)行三組驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，白藜蘆醇平均提取率為5.91%，與預(yù)測(cè)值偏差為-0.50%，由此可知回歸模型較好地反映了虎杖中白藜蘆醇的最佳提取工藝參數(shù)，同時(shí)也說明了該工藝條件的穩(wěn)定.

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Optimization of Enzyme-linked Semi-bionic Extraction Technology

of Resveratrol from Polygonurn cuspidatum

CHEN Shuai1,2,WANG Hui-zhu1,WANG Wang-chao1,CUI Xi-xiu1

(1.School of Chemistry and Pharmaceutical Engineering,Jilin Institute of Chemical Teconology, Jilin132022,China;2.School of pharmacy, Shenyang Pharmacetical University,Shenyang110016,China)

Abstract:Objective:To optimize enzyme-linked semi-bionic extraction technology of Resveratrol from Polygonurn cuspidatum．Method: With yield of Resveratrol as index，based on single factor test，the principle of central composite design was adopted by selecting the amount of enzyme，enzymolysis time and temperature as factors，extraction technology was optimized by response surface methodology．Result: Optimum extraction conditions were as follows: the amount of enzyme 1.7 mg·g-1，enzymolysis time 107 min，enzymolysis temperature 55 ℃．Under these conditions，yield of Resveratrol was up to 5.91%，which was close to the predicted value (5.94%)．Conclusion: Optimized enzyme-linked semi-bionic extraction technology was reasonable and feasible with good predictability.

Key words:enzyme-linked semi-bionic extraction；Polygonurn cuspidatum；Resveratrol

文章編號(hào)：1007-2853(2015)11-0042-03 1007-2853(2015)11-0025-05

作者簡(jiǎn)介：鄭永永(1989-)，男，山東荷澤人，北華大學(xué)2014級(jí)研究生，主要從事智能精密制造及其自動(dòng)化方面的研究. 薛俊禮(1985-)，男，吉林松原人，吉林化工學(xué)院助教，碩士，主要從事固體超強(qiáng)酸方面的研究.

基金項(xiàng)目：吉林省科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(20150520109JH)；吉林市科技創(chuàng)新發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(201464043)(20156413)

收稿日期：2015-08-30 2015-07-20

中圖分類號(hào)：R 284.2

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A DOI：10.16039/j.cnki.cn22-1249.2015.11.006