王玉龍，袁步娟，趙海欣，劉　云

[作者單位]　224001 江蘇 鹽城，鹽城市中醫(yī)院(王玉龍)，224002 江蘇 鹽城，鹽城市藥品檢驗(yàn)所(袁步娟)，224001 江蘇 建湖縣，建湖縣人民醫(yī)院藥學(xué)部(趙海欣)，224002 江蘇 鹽城，鹽城市師范學(xué)院藥學(xué)院(劉云)

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HPLC法測定延丹膠囊中原兒茶醛、芍藥苷和橙皮苷的含量

王玉龍，袁步娟，趙海欣，劉云

[作者單位]224001 江蘇 鹽城，鹽城市中醫(yī)院(王玉龍)，224002 江蘇 鹽城，鹽城市藥品檢驗(yàn)所(袁步娟)，224001 江蘇 建湖縣，建湖縣人民醫(yī)院藥學(xué)部(趙海欣)，224002 江蘇 鹽城，鹽城市師范學(xué)院藥學(xué)院(劉云)

[摘要]目的建立控制延丹膠囊質(zhì)量的方法。方法采用高效液相色譜(high performance liquid chromatography, HPLC)法同時(shí)測定延丹膠囊中原兒茶醛、芍藥苷和橙皮苷的含量，Waters CAPCELL PAK C18色譜柱(150 mm×4.6 mm, 5 μm)，流動(dòng)相為乙腈-0.1%磷酸，檢驗(yàn)波長230nm，柱溫25℃。結(jié)果原兒茶醛、芍藥苷和橙皮苷分別在0.007728～0.4508 μg(相關(guān)系數(shù)r=1.0000)、0.06462～4.308 μg(r=1.0000)和0.06984～3.492 μg(r=0.9999)呈良好線性關(guān)系；平均回收率(n=6)為99.00%[相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為1.10%]、98.92%(RSD為1.10%)，98.65%(RSD為1.10%)。結(jié)論該方法簡便、準(zhǔn)確、重復(fù)性好，可作為延丹膠囊質(zhì)量控制方法。

[關(guān)鍵詞]高效液相色譜法；原兒茶醛；芍藥苷；橙皮苷；含量測定

延丹膠囊主要成分是丹參、延胡索(醋制)、五靈脂、瓜蔞、乳香(醋制)、白芍、枳殼、柴胡[1]，主要用于冠心病勞累性心絞痛氣滯血瘀證：如胸痛、胸悶、心慌、憋氣等[2]，并可改善心電圖，增加體力[3]。延丹膠囊在國家食品藥品監(jiān)督管理局國家藥品標(biāo)準(zhǔn)YBZ04452005-2009Z中收載[4]，目前已有的延丹膠囊的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)主要是芍藥苷、橙皮苷、延胡索乙素、原兒茶醛的薄層鑒別，而丹參酮ⅡA的含量測定僅以薄層色譜法的定性鑒別和丹參酮ⅡA含量為指標(biāo)的測定，此方法很難有效的反映此制劑的質(zhì)量[5]。同時(shí)測定延丹膠囊中原兒茶醛、芍藥苷和橙皮苷含量的研究罕見報(bào)道[6]。本文擬將采用高效液相色譜(high performance liquid chromatography, HPLC)法同時(shí)測定延丹膠囊中原兒茶醛、芍藥苷和橙皮苷含量。

1資料與方法

1.1儀器與試藥HPLC系統(tǒng)：高效液相色譜儀(Waters 2695/2489 日本島津公司)；XS205電子分析天平(0.1 mg，梅特勒托利多公司)；MP2001電子天平(Sartorius 0.1 g，上海恒平科學(xué)儀器有限公司)；B3200S-T超聲波清洗器(比能信超聲(上海)有限公司)；紫外-可見分光光度計(jì)(UV2501日本島津)。甲醇(色譜純，江蘇漢邦科技有限公司)；純凈水；乙醇(分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)制劑有限公司)；氨水(臨淄環(huán)宇經(jīng)貿(mào)有限公司)；芍藥苷(含量：94.9%，中國藥品生物制品檢定所提供，批號(hào)：110736-201337)；原兒茶醛(含量：96.5%，中國藥品生物制品檢定所提供，批號(hào)：110810-200506)；橙皮苷(含量：95.1%，中國藥品生物制品檢定所提供，批號(hào)：110721-201014)；延丹膠囊(由安徽省天康藥業(yè)有限公司提供，批號(hào)：121205-130421-131219)。

1.2溶液制備

1.2.1對(duì)照品溶液:①精密稱取對(duì)照品橙皮苷、芍藥苷、原兒茶醛適量，置10 ml量瓶中，首先加適量甲醇超聲溶解，然后用甲醇定容至刻度，搖勻，配得濃度分別為1164.0、1077.0、128.8 μg/ml的對(duì)照儲(chǔ)備液。②精密量取儲(chǔ)備液各1.0 ml于10 ml容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得質(zhì)量濃度分別為116.40、107.70、12.88 μg/ml的橙皮苷、芍藥苷和原兒茶醛對(duì)照品混合溶液。

1.2.2供試品溶液:精密稱取延丹膠囊3.0016 g，置錐形瓶中，加入100%甲醇50 ml，稱定重量，超聲45 min后，用100%甲醇補(bǔ)重，過濾，得供試品溶液。

1.2.3色譜條件:色譜柱：Waters CAPCELL PAK C18(150 mm×4.6 mm，5 μm)，柱溫：25℃，乙腈-0.1%磷酸為流動(dòng)相，進(jìn)樣量：10 μl，檢測波長：230 nm，流速：1.0 ml/min，分析時(shí)間：24 min，延長8 min。

2結(jié)果

2.1波長的選擇取“1.2.1”下的橙皮苷、芍藥苷、原兒茶醛對(duì)照品溶液分別于紫外可見分光光度計(jì)下200～400 nm波長范圍內(nèi)掃描，結(jié)果顯示分別在283、230、231 nm處有最大吸收。既往研究[7-12]測定三者的含量大多使用230 nm和280 nm的波長。取對(duì)照品溶液適量(0.45 μm)薄膜過濾，在高效液相雙波長進(jìn)行檢測得到的圖譜顯示230 nm的色譜圖基線更穩(wěn)、干擾少，故選230 nm作為檢測波長。

2.2流動(dòng)相的選擇本文考察了甲醇-水系統(tǒng)和甲醇-酸系統(tǒng)作為流動(dòng)相，結(jié)果表明，以甲醇-酸溶液為流動(dòng)相，所得色譜峰峰形好，分離效果佳。同時(shí)比較了相同pH的甲酸、冰醋酸和磷酸，結(jié)果顯示加入磷酸的效果比較好，故選擇甲醇-0.1%磷酸系統(tǒng)作為流動(dòng)相。

2.3提取工藝的考察以橙皮苷、芍藥苷、原兒茶醛的含量為指標(biāo)，考察提取工藝。采用超聲法分別考察了甲醇、乙醇的提取效率，結(jié)果表明甲醇的提取效率較高。采用超聲法分別考察了體積分?jǐn)?shù)為50%、75%、100%的甲醇、以及100%甲醇加1 ml氨水的提取效率，結(jié)果表明體積分?jǐn)?shù)為100%甲醇加1 ml氨水的提取效率最高。同時(shí)考察超30 min、45 min和1 h的提取效果，結(jié)果表明超聲45 min和1 h效果相近，故選擇100%甲醇加1 ml氨水超聲45 min，提取1次。

2.4樣品的處理方式考察了未使用0.45 μm薄膜過濾和使用薄膜過濾的樣品，發(fā)現(xiàn)過濾過的樣品所得色譜峰峰形好，分離效果佳，雜峰較少。

2.5專屬性分析在“1.2.3”色譜條件下取“1.2.1”下混合對(duì)照品溶液(圖1)和“1.2.2”下供試品溶液(圖2)適量(0.45 μm微孔濾膜過濾后進(jìn)樣)。從圖可見色譜峰相互無干擾，表明該方法有較強(qiáng)的專屬性，經(jīng)計(jì)算得原兒茶醛理論塔板數(shù)為16274，芍藥苷理論塔板數(shù)為32027，橙皮苷理論塔板數(shù)為56089。

2.6線性關(guān)系考察取“1.2.1”項(xiàng)下對(duì)照品儲(chǔ)備液適量(0.45 μm微孔濾膜過濾)，在“1.2.3”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣10、15、35 μl的系列對(duì)照品溶液。再取其1 ml到10 ml容量瓶中加甲醇，定容至刻度搖勻后取適量(0.45 μm微孔濾膜過濾)，進(jìn)樣6、8、10 μl的系列對(duì)照品溶液，按上述色譜條件進(jìn)樣測定峰面積，分析數(shù)據(jù)見表1。以峰面積y對(duì)進(jìn)樣量x(μg)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果表明：原兒茶醛、芍藥苷和橙皮苷的線性范圍分別為0.007728~0.4508 μg范圍內(nèi)，回歸方程為：y=2.3E+6x+22359，r=1.0000；0.06462~4.308 μg范圍內(nèi)，回歸方程為：y=1.4E+6x-144.76，r=1.0000；0.06984~3.492 μg范圍內(nèi)，回歸方程為：y=5.7e+6x+5511.9，r=0.9999，與峰面積呈良好線性關(guān)系。

2.7精密度試驗(yàn)日內(nèi)精密度：在24 h內(nèi)，取供試品溶液適量0.45 μm薄膜過濾，在“1.2.3”項(xiàng)色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣6次，每次10 μl，記錄色譜峰面積。結(jié)果表明：橙皮苷、芍藥苷、原兒茶醛峰面積的RSD(n=6)分別為0.63%、0.79%、0.71%，表明該方法在探索的色譜條件下可行。

2.8檢測限及定量限測定將各對(duì)照品色譜峰的信號(hào)與基線信號(hào)進(jìn)行比較，以信噪比約為3∶1時(shí)注入儀器的量確定為檢測限。以信噪比約為10:1時(shí)注入儀器的量確定為定量限。結(jié)果表明：原兒茶醛的檢測限為38.64 μg，定量限為128.80 μg；芍藥苷的檢測限為107.70 μg，定量限為430.80 μg；橙皮苷的檢測限為23.28 μg ，定量限為174.60 μg。

圖1　混合對(duì)照品圖譜

表1　對(duì)照品的線性關(guān)系(n=6)

圖2　供試品延丹膠囊樣品圖譜

2.9穩(wěn)定性試驗(yàn)取“1.2.2”下的供試品溶液適量，分別在0、2、4、8、16、24 h，按“1.2.3”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣測定，結(jié)果顯示橙皮苷、原兒茶醛、芍藥苷峰面積的RSD分別為1.78%、1.72%、0.93%，說明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.10重復(fù)性試驗(yàn)精密量取1號(hào)樣品6份，每份10片量，按“1.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“1.2.3”色譜條件下進(jìn)行分析測定。結(jié)果表明：橙皮苷含量的平均值(n=6)為409.80 μg/ml，RSD為1.62%；原兒茶醛含量的平均值(n=6)為77.01 μg/ml，RSD為1.63%；芍藥苷含量的平均值(n=6)為9.12 μg/ml，RSD為0.86%。

2.11回收率試驗(yàn)精密稱取已知含量的延丹膠囊1.5 g共6份，置于具塞瓶中，精密加入原兒茶醛對(duì)照品溶液(0.2248 mg/ml)1.0 ml，橙皮苷對(duì)照品溶液(0.0613 mg/ml)1.0 ml，芍藥苷對(duì)照品溶液(0.1105 mg/ml)1.0 ml，加100%甲醇50 ml，稱定重量，超聲45 min，放冷，加100%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，離心，取上清液，濾過，即得加樣回收試驗(yàn)的供試品溶液。依法測定并計(jì)算回收率，結(jié)果見表2、3、4。

表2　原兒茶醛回收率(n=6)

表3　橙皮苷回收率(n=6)

表4　芍藥苷回收率(n=6)

2.12取樣測定分別取本批號(hào)的延丹膠囊3份，按“1.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液。取適量用0.45 μm薄膜過濾，精密吸取供試品溶液10 μl，在上述色譜條件下進(jìn)樣分析，測定峰面積，用外標(biāo)法計(jì)算出各成分的含量，測定結(jié)果見表5。

表5　延丹膠囊中各成分的含量(n=3)

3討論

中藥復(fù)方膠囊是由多種化學(xué)成分共同作用而發(fā)揮藥效，單一成分含量的高低不能全面反映中藥復(fù)方膠囊的藥效。延丹膠囊主要是由丹參和白芍制成，故將其中的橙皮苷、芍藥苷和原兒茶醛作為含量考察指標(biāo)之一，用HPLC法測定其含量以進(jìn)行本品的質(zhì)量控制。

根據(jù)有關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道[13-15]，芍藥苷的最大吸收波長為230 nm，橙皮苷有兩個(gè)最大吸收波長，分別為230 nm和284 nm，因芍藥苷在284 nm附近紫外吸收較低，故本實(shí)驗(yàn)選用230 nm作為檢測波長，同時(shí)測定芍藥苷和橙皮苷兩種組分的含量。

丹參水溶性成分主要是酚酸類化合物，在中性流動(dòng)相中易發(fā)生離解，使含量偏低且拖尾嚴(yán)重。因此，一般情況下，HPLC法測定藥材或制劑中原兒茶醛的含量多采用甲醇-冰醋酸-水系統(tǒng)，在流動(dòng)相中加入少量冰醋酸或磷酸，抑制其解離并改善峰形和分離度，能夠滿足多數(shù)樣品的分離要求，故本研究選用甲醇-磷酸作為流動(dòng)相。

綜上所述，采用高效液相法同時(shí)測定延丹膠囊中橙皮苷、芍藥苷和原兒茶醛的含量，用以延丹膠囊的質(zhì)量控制，可全面的反映本制劑中多組分藥材的質(zhì)量，且方法簡便、可靠、分離效果與重復(fù)性好，可為本品的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供借鑒。

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(收稿時(shí)間：2015-09-15修回時(shí)間：2015-10-18)

·論著·

HPLC Method in Detection of Contents of Protocatechuic Aldehyde, Paeoniflorin and Hesperidins in Yandan Capsules

WANG Yu-long1, YUAN Bu-juan2, ZHAO Hai-xin3, LIU Yun4(1. Traditional Chinese Medical Hospital of Yanchen, Yancheng, Jiangsu 224001, China; 2. Drug Inspection Institute of Yancheng, Yancheng, Jiangsu 224002, China; 3. Department of Pharmacy, the People's Hospital of Jianhu County, Jianhu, Jiangsu 224700, China; 4. Pharmaceutical College, Yancheng Teachers University, Yancheng, Jiangsu 224002, China)

[Abstract]ObjectiveTo establish a method to control the quality of Yandan capsules. MethodsThe high-performance liquid chromatography (HPLC) method and a CAPCELL PAK C18 (150 mm×4.6 mm， 5 μm) chromatographic column were used; acetonitrile and 0.1 % phosphoric acid solution were used as mobile phase in gradient mode. The wavelength was 30 nm with 25℃ column temperature. ResultsThe Protocatechuic Aldehyde, Paeoniflorin and Hesperidin showed good linear correlation in the ranges of 0.007728-0.4508 μg [correlation coefficient (r) =1.0000], 0.06462-4.308 μg (r=1.0000) and 0.06984-3.492 μg (r=0.9999 ) respectively, and the average recovery rates were 99.00 % [the relative standard deviation (RSD)∶1.10 %], 98.92 % (RSD∶1.10 %) and 98.65% (RSD∶1.10 %) respectively. ConclusionThe method is simple and feasible with good repeatability, and it can be used for the quality control of Yandan capsules.

[Key words]High performance liquid chromatography; Protocatechuic aldehyde; Paeoniflorin; Hesperidin; Assay

[DOI]10.3969/j.issn.2095-140X.2015.12.023

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼][中國圖書資料分類號(hào)]R446A

[文章編號(hào)]2095-140X(2015)12-0099-04