李　瑋，王憲靈，賀政新，趙博華，王縛鯤

[作者單位]　050082 石家莊，解放軍白求恩國際和平醫(yī)院檢驗實驗科

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兩種RNA提取方法對丙型肝炎RNA定量分析的影響

李瑋，王憲靈，賀政新，趙博華，王縛鯤

[作者單位]050082 石家莊，解放軍白求恩國際和平醫(yī)院檢驗實驗科

[摘要]目的比較兩種RNA提取方法對丙型肝炎病毒(hepatitis C virus, HCV)RNA檢測結(jié)果的影響，為臨床實驗室質(zhì)量控制和結(jié)果評價提供依據(jù)。方法以定值質(zhì)控品為標準物質(zhì)，采用硫氰酸胍法和蛋白酶K法兩種RNA提取方法對我院2014年11月確診的33例HCV感染者進行HCV RNA定量分析。結(jié)果兩種檢測方法檢測定值質(zhì)控品的批內(nèi)不精密度分別為3.7%和2.2%、批間不精密度分別為5.0%和4.3%。硫氰酸胍法提取定值質(zhì)控品RNA進行定量PCR檢測結(jié)果lg值為4.15±0.21低于蛋白酶K法的4.80±0.21，差異有統(tǒng)計學意義(t=10.88，P<0.001)；兩種方法對本組HCV感染者檢測結(jié)果lg值分別為4.86±1.14和5.29±1.22，差異有統(tǒng)計學意義(t=12.10，P<0.001)，且二者呈顯著線性相關(guān)(r=0.987，P<0.001)。結(jié)論與硫氰酸胍法比較，蛋白酶K法是一種效率更高，檢測數(shù)據(jù)更準確的RNA提取方法。

[關(guān)鍵詞]丙型肝炎；RNA；肝炎病毒屬；基因檢測

丙型肝炎病毒(hepatitis C virus, HCV)已經(jīng)成為繼乙型肝炎之后感染例數(shù)最多的肝炎病毒，并呈現(xiàn)出逐年上升的趨勢，據(jù)報道，全球約有1.6億人感染HCV[1-5]。有研究通過分析我國傳染病網(wǎng)絡(luò)直報系統(tǒng)數(shù)據(jù)后認為，丙型肝炎發(fā)病數(shù)(率)呈逐年增長趨勢，發(fā)病數(shù)由2003年2萬例上升到2013年20萬例，發(fā)病率則由1.57/10萬增長到15.00/10萬，在11年間發(fā)病數(shù)(率)增長了近10倍[6]。盡管感染形勢嚴峻，大部分感染者并未察覺到自身的感染情況[7]，未得到及時的診斷和治療。目前，對于HCV的診斷手段主要包括酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測病毒抗體或病毒抗原和實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)確認病毒載量，這些方法在確認病毒感染和評價臨床治療效果方面有重要的作用。RNA提取的質(zhì)量是影響RT-PCR檢測HCV實驗準確性的主要環(huán)節(jié)之一[8]，本研究以定值質(zhì)控品為標準物質(zhì)，分別采用硫氰酸胍法和蛋白酶K法進行提取RNA，比較二者對HCV RNA定量分析的影響。

1資料與方法

1.1研究對象選取2014年11月我院肝病科確診為HCV感染患者33例，其中男14例，女19例；年齡22～73歲，中位年齡50歲。清晨空腹無菌穿刺抽取靜脈血，1 h內(nèi)離心(3000 r/min，5 min)分離血清，8 h內(nèi)完成檢測。

1.2儀器與試劑SLAN熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)檢測系統(tǒng)購自上海宏石公司；加熱型干式金屬浴恒溫器購自西安天隆科技公司；3K15型低溫高速離心機購自美國SIGMA公司；定值型HCV RNA標準物質(zhì)購自北京康徹思坦生物技術(shù)公司(批號201405002)；HCVRNA定量測定試劑盒(批號H20140601)，硫氰酸胍法核糖RNA抽提試劑盒(批號H20140901)和蛋白酶K法核糖RNA抽提試劑盒(批號P20140801)均購自上海之江生物科技公司。

1.3核糖RNA提取方法

1.3.1硫氰酸胍法：操作嚴格按照試劑盒說明書進行，主要步驟如下：將140 μl臨床樣品或定值質(zhì)控品與526 μl結(jié)合液混勻，渦旋振蕩10 s，使磁珠均勻分散至緩沖液，完全裂解病毒并與RNA結(jié)合，靜置3 min以上。將上述液體加入親和柱中，離心分離磁珠，經(jīng)洗滌與充分干燥后，以50 μl、65℃預(yù)熱洗脫液離心洗脫備用。

1.3.2蛋白酶K法：操作嚴格按照試劑盒說明書進行，主要步驟如下：將20 μl蛋白酶K、200 μl臨床樣品或定值質(zhì)控品和200 μl緩沖液混合，渦旋振蕩15 s充分混勻；56℃孵育15 min后加入250 μl無水乙醇，渦旋振蕩15 s，室溫放置5 min；將溶液與絮狀物轉(zhuǎn)移至吸附柱，經(jīng)洗滌與充分干燥后，室溫下以50 μl洗脫液離心洗脫備用。

1.4RNA定量分析將定量檢測混合液與RT-PCR酶按19︰1的比例混合均勻；取20 μl混合液分別與5 μl提取的臨床樣品或定值質(zhì)控品RNA、臨界陽性對照品(病毒載量很低的對照品，用于確定檢測的最低檢測限)、陰性對照品(不含有待檢測病毒，用于確定檢測的有效性。)和試劑盒內(nèi)標準品Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ各5 μl混合進行PCR。PCR擴增程序設(shè)置：45℃逆轉(zhuǎn)錄10 min，95℃預(yù)變性15 min，再按95℃ 15 s→60℃ 60 s，循環(huán)50次。熒光通道選擇FAM通道和VIC通道，單點熒光檢測溫度為60℃。質(zhì)量控制：HCV陰性對照品FAM通道檢測結(jié)果<1000 U/ml，且VIC通道檢測Ct值≤35；HCV臨界陽性對照品FAM通道檢測結(jié)果在5×103~5×104U/ml范圍內(nèi)；標準曲線相關(guān)系數(shù)≤-0.98，否則視為結(jié)果無效。

2結(jié)果

2.1RT-PCR質(zhì)量控制RT-PCR質(zhì)量控制主要由陰性對照品和臨界陽性對照品進行監(jiān)控，如圖1所示，a為臨界陽性對照品擴增曲線，呈S型；b為陰性對照品檢測結(jié)果。

圖1　陰性對照品和臨界陽性對照品的定量聚合酶鏈反應(yīng)曲線a.臨界陽性對照品；b.為陰性對照品

2.3兩種RNA提取方法對室內(nèi)質(zhì)控的影響連續(xù)24 d采用硫氰酸胍法與蛋白酶K法提取定值質(zhì)控品RNA進行定量PCR檢測，取其結(jié)果lg值。硫氰酸胍法測量值為4.15±0.21，蛋白酶K法測量值為4.80±0.21，兩組結(jié)果比較差異存在統(tǒng)計學意義(t=10.88，P<0.001)(圖2)；與定值質(zhì)控品參考值lgR=4.64相比，硫氰酸胍法與蛋白酶K法偏倚分別為-0.49和0.16，可見蛋白酶K法的偏倚要小于硫氰酸胍法(圖2)。以0.5對數(shù)值為允許誤差范圍(4.14~5.14)，連續(xù)24次測量中，硫氰酸胍法有16次測量值超出此范圍，而蛋白酶K法測量值均在允許誤差范圍內(nèi)。

圖2　蛋白酶K法與硫氰酸胍法測定定值質(zhì)控品RNA定量聚合酶鏈反應(yīng)檢測結(jié)果比較

2.4兩種RNA提取方法檢測結(jié)果比較本組HCV檢測結(jié)果顯示，硫氰酸胍法與蛋白酶K法檢測結(jié)果存在顯著性差異(4.86±1.14 vs 5.29±1.22，t=12.10，P<0.001)，且二者呈顯著線性相關(guān)(r=0.987，P<0.001)，見圖3A。用Bland-Altman分析法比較兩種RNA提取方法對HCV檢測結(jié)果的一致性，硫氰酸胍法對蛋白酶K法的偏倚為-0.435，95%一致性界限為(-0.840,-0.030)，見圖3B。

3討論

直接檢測HCV RNA對于早期診斷HCV具有重要意義，因為HCV感染后到機體出現(xiàn)抗體有一個較長的窗口期(50～70)d，而HCV基因組的復(fù)制往往在感染后數(shù)天即出現(xiàn)[11-15]。采用熒光定量PCR法監(jiān)測患者HCV RNA水平，其檢測范圍可達10~1×108U/ml[16-17]，有助于判斷HCV體內(nèi)復(fù)制及傳染性，對丙型肝炎患者的臨床治療、監(jiān)測具有重要作用[18]。

圖3　兩種RNA提取方法對33例HCV感染患者檢測結(jié)果比較HCV為丙型肝炎病毒，A為硫氰酸胍法與蛋白酶K法HCV定量分析結(jié)果的線性關(guān)系；B為Bland-Altman分析法比較兩種RNA提取方法對HCV檢測結(jié)果的一致性

RT-PCR檢測HCV RNA固然具有特異性強、敏感度高和自動化程度高等優(yōu)點[19-20]，但由于其操作相對復(fù)雜且干擾因素多，對檢測質(zhì)量控制要求高，一直以來難于在常規(guī)工作和基層單位中推廣。RT-PCR實驗步驟中任一步驟出現(xiàn)問題均易影響檢出準確度，其中RNA提取是HCV RNA檢測的關(guān)鍵步驟，選擇高效的提取方法尤其重要[21]。本研究在對RT-PCR實驗進行嚴格質(zhì)控的前提下，利用定值質(zhì)控品和臨床HCV患者血清比較兩種RNA提取方法對HCV定量檢測的影響。對兩種檢測結(jié)果進行配對t檢驗，結(jié)果顯示無論對定值質(zhì)控品還是臨床HCV感染者血清，兩種方法的分析結(jié)果均存在統(tǒng)計學差異，硫氰酸胍法的檢測結(jié)果略低于蛋白酶K法，提示蛋白酶K法有較高的RNA提取率。RNA提取是HCV RNA定量分析的關(guān)鍵步驟，對臨床樣本進行分析時要選擇高效率的RNA提取方法[21]。兩種RNA提取方法分別以磁珠和親和柱分離RNA。硫氰酸胍法以分散于提取液中的能吸附RNA的磁珠為介質(zhì)，但已有研究證實，該法可以獲得較高的RNA分離效率[22]，本實驗室采用以蛋白酶K與磁珠法結(jié)合的全自動RNA提取方法亦可取得良好的RNA分離效果。

目前國際上尚無HCV RNA檢測項目允許偏倚的統(tǒng)一判斷標準，本研究參照文獻[9]，采用衛(wèi)生部臨檢中心室間質(zhì)評的允許誤差為判斷標準(0.5對數(shù)值)，在此標準下，連續(xù)24次測量中，硫氰酸胍法有16次測量值超出允許范圍，而蛋白酶K法24次測量值均在允許誤差范圍內(nèi)。由此我們認為，對于臨床實驗室HCV RNA定量檢測而言，與硫氰酸胍法比較，蛋白酶K法是一種效率更高、數(shù)據(jù)更準確的RNA提取方法。

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(收稿時間：2015-08-24修回時間：2015-10-13)

·論著·

Effects of Two RNA Extraction Assays on RNA Quantitative Analysis for Hepatitis C Virus

LI Wei, WANG Xian-ling, HE Zheng-xin, ZHAO Bo-hua, WANG Fu-kun (Department of Clinical Laboratory, Bethune International Peace Hospital of PLA, Shijiazhuang 050082, China)

[Abstract]ObjectiveTo compare the effects of two ribonucleic acid (RNA) extraction assays on RNA quantitative analysis for Hepatitis C virus (HCV) in order to provide evidence for quality control and result evaluation. MethodsThe quantitative material of quality control was used as standard substance, and RNA quantitative analysis was performed using two extraction assays with Guanidinium Thiocyanate and protease K for 33 HCV infected patients admitted in November 2014. ResultsIntra-batch imprecision values of the two RNA extraction assays were 3.7% and 2.2%, and inter-batch imprecision values were 5.0% and 4.3% respectively. For the constant quality control, the lg value 4.15±0.21 using the Guanidinium Thiocyanate assay was lower than 4.80±0.21 using the protease K assay, and the difference was statistically significant (t=10.88， P<0.001). For the serum of HCV infected patients, the lg value 4.86±1.14 using the Guanidinium Thiocyanate assay and 5.29±1.22 using the protease K assay, and the difference was statistically significant (t=12.10， P<0.001). The results showed that significant linear correlations existed in HCV quantitative detection by different test assays (r=0.987， P<0.001). ConclusionThe Guanidinium Thiocyanate assay is a more efficient and accurate method for RNA extraction compared with the protease K assay.

[Key words]Hepatitis C； RNA； Hepacivirus； Genetic testing

[DOI]10.3969/j.issn.2095-140X.2015.12.016

[文獻標志碼][中國圖書資料分類號]R512.63；R373.2A

[文章編號]2095-140X(2015)12-0071-04

[通訊作者]王縛鯤，E-mail：wfk8@sina.com