劉志軍，李　強(qiáng)，袁世發(fā)，任　捷

[作者單位]　050081 石家莊，武警河北總隊(duì)醫(yī)院外一科

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siRNA敲除bcl-2基因?qū)Ω伟㏒MMc-7721細(xì)胞株的影響

劉志軍，李強(qiáng)，袁世發(fā)，任捷

[作者單位]050081 石家莊，武警河北總隊(duì)醫(yī)院外一科

[摘要]目的觀察RNA干擾(RNA interference，RNAi)技術(shù)敲除bcl-2基因?qū)Ω伟┘?xì)胞SMMc-7721的影響。方法用小分子干擾RNA(small interference RNA, siRNA)轉(zhuǎn)染肝癌SMMc-7721細(xì)胞株(實(shí)驗(yàn)組)，轉(zhuǎn)染陰性siRNA(陰性對(duì)照組)和空白對(duì)照組，蛋白的表達(dá)用免疫組化法檢測(cè),細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡情況用流式細(xì)胞儀檢測(cè),細(xì)胞侵襲能力的變化通過(guò)Transwell小室法檢測(cè)。結(jié)果實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞出現(xiàn)顯著凋亡峰，G1期細(xì)胞增多,S期細(xì)胞減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),而陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組兩組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；實(shí)驗(yàn)組侵出小室的細(xì)胞數(shù)量較陰性對(duì)照組及空白組均明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，陰性對(duì)照組與空白組細(xì)胞數(shù)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論siRNA敲除bcl-2能有效減少人肝癌細(xì)胞SMMc-7721細(xì)胞株的bcl-2蛋白表達(dá),抑制癌細(xì)胞的侵襲,促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡。

[關(guān)鍵詞]基因，bcl-2；RNAi；肝癌

原發(fā)性肝癌在人類惡性腫瘤發(fā)病率中居第5位[1]，全球每年約50萬(wàn)人死于原發(fā)性肝癌，占癌癥相關(guān)死亡人數(shù)第3位[2]，目前并無(wú)有效治療手段。腫瘤本質(zhì)是一種基因疾病，是基因參與并經(jīng)多階段演進(jìn)而形成的。bcl-2是凋亡控制基因之一，高表達(dá)可抑制多種刺激因素導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，同時(shí)可引起多種化療藥物的耐藥[3]。大量研究表明惡性腫瘤的發(fā)生與bcl-2表達(dá)相關(guān)[4]。白雪與石搏[5]對(duì)不同時(shí)期宮頸疾病患者bcl-2檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)從宮頸炎、宮頸上皮內(nèi)瘤到宮頸癌bcl-2表達(dá)逐漸上升。

RNA干擾(RNA interference,RNAi)的效果是轉(zhuǎn)錄后的基因沉默[6]，它是在生物進(jìn)化的過(guò)程中出現(xiàn)的基因高度保守現(xiàn)象,通過(guò)RNAi技術(shù)敲除目的基因表達(dá)已成為腫瘤研治的新方向。目前國(guó)內(nèi)外已有多項(xiàng)研究開(kāi)展，龐玉艷與馮震博[7]用脂質(zhì)體Lipofectamine 2000作為載體，將siRNA(小分子RNA)轉(zhuǎn)染至靶細(xì)胞，抑制目標(biāo)靶基因EZH2，同時(shí)在蛋白及細(xì)胞的水平上觀察EZH2基因在siRNA轉(zhuǎn)染后表達(dá)的影響，使EZH2 mRNA和蛋白表達(dá)明顯下調(diào)。本實(shí)驗(yàn)用RNAi技術(shù)敲除bcl-2，抑制人肝癌細(xì)胞SMMc-7721細(xì)胞增值，有望為肝細(xì)胞癌的治療提供新的治療靶點(diǎn)和方法。

1材料和方法

1.1主要材料免疫組化試劑盒及bcl-2蛋白鼠抗人單克隆抗體(北京中杉金橋公司)，LipofectamineTM2000，OPTI-MEM(invitrogen)，bcl-2 siRNA的序列：靶序列GTAACTCCTATATAAGCTG。正義鏈5-GUAUCCACAUUAUAGCAUGdTdT-3,反義鏈5-dTdTUGCAUAGGAUUAAUUCGAc-3，由廣州RIBIBIO公司合成。

1.2免疫組化法檢測(cè)bcl-1蛋白表達(dá)抽取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人肝癌細(xì)胞株SMMc-7721，接種于12孔板中預(yù)置的載玻片上，分實(shí)驗(yàn)組(轉(zhuǎn)染bcl-2 siRNA組),陰性對(duì)照組(轉(zhuǎn)染陰性siRNA組)和空白對(duì)照組(未轉(zhuǎn)染組)(各組n=25)，5% CO2、37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，待細(xì)胞爬滿總面積30%，抽除轉(zhuǎn)染組中原培養(yǎng)液，加入1640培養(yǎng)液800 μl，把24 μl脂質(zhì)體2000加入到1200 ml OPTI-MEM液中，靜置于室溫下，隨后抽取bcl-2siRNA及non-siRNA各30 μl分別加入OPTI-MEM 600 ml中，稀釋液612 μl lip 2000分別注入bcl-2siRNA混合液和non-siRNA混合液中，輕輕搖動(dòng)混勻，靜置于室溫下30 min，每孔實(shí)驗(yàn)組加入lip2000-bcl-2siRNA-OPTI-MEM混合液414 μl，每孔陰性對(duì)照組加入lip2000-non-siRNA-OPTI-MEM混合液414 μl,輕輕混勻后放置于培養(yǎng)箱內(nèi)，培養(yǎng)2 d，取出細(xì)胞涂片標(biāo)本，PBS液沖洗，用丙酮固定約20 min,PBS浸泡5 min，3%H2O2去離子水孵養(yǎng)15 min，再加50 μl山羊血清封閉液，孵養(yǎng)20 min,倒去，加入50 μl一抗，4℃8 h，每組一板以PBS來(lái)代替一抗。經(jīng)過(guò)12 h后給予PBS沖洗，隨后加入二抗，用辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素，用DAB顯色，復(fù)染，返藍(lán)，將樣本置于顯微鏡下進(jìn)行觀察、照相。

1.3細(xì)胞周期變化和細(xì)胞凋亡情況(流式細(xì)胞儀法)各組細(xì)胞按濃度1.5×105/L接種于6孔板中,按上述培養(yǎng)方法轉(zhuǎn)染，繼續(xù)培養(yǎng)48 h,用胰酶消化離心收集并懸于PBS液中,4℃70%乙醇固定30 min,用含Rnase和碘化丙錠(PI)的染色液染色30 min,流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期變化情況。

2結(jié)果

2.1實(shí)驗(yàn)組bcl-2蛋白表達(dá)明顯受抑制bcl-2蛋白在各組表達(dá)的計(jì)分分別為:實(shí)驗(yàn)組于第4孔板時(shí)乘積積分為25分,而空白對(duì)照組及陰性對(duì)照組于第9孔板時(shí)乘積積分均為25分,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.2細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡情況實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞出現(xiàn)顯著凋亡峰，G1期細(xì)胞增多,S期細(xì)胞減少，與空白對(duì)照組但和陰性對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),而陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組兩組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表1。

表1　各組細(xì)胞周期變化情況各期細(xì)胞比例±s，%)

2.3細(xì)胞侵襲能力改變(transwell侵襲實(shí)驗(yàn))其中實(shí)驗(yàn)組浸潤(rùn)至下室的細(xì)胞數(shù)為(20.80±2.17)個(gè)/每高倍鏡視野；陰性對(duì)照組浸潤(rùn)至下室的細(xì)胞數(shù)為(62.50±3.34)個(gè)/每高倍鏡視野；空白對(duì)照組浸潤(rùn)至下室的細(xì)胞數(shù)為(64.20±1.92)個(gè)/每高倍鏡視野。實(shí)驗(yàn)組侵出小室的細(xì)胞數(shù)量較陰性對(duì)照組及空白組均明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，陰性對(duì)照組與空白組細(xì)胞數(shù)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

3討論

RNA干擾是在mRNA水平上的由內(nèi)外源性雙鏈RNA誘發(fā)而產(chǎn)生的基因敲除[8]，RNA干擾具有高度特異性的特點(diǎn)。人工合成的小片段(21~23個(gè)核苷酸)干擾siRNA,將其轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中，其中一條siRNA鏈可與蛋白復(fù)合物結(jié)合，產(chǎn)生RISCRNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物(RNA-induced silencing complex，RISC),RISC可與目標(biāo)mRNA特異性的地專一結(jié)合，并將其酶解，同時(shí)不干擾非同源mRNA的穩(wěn)定性，和反義寡核苷酸相比較具有抑制作用強(qiáng)、細(xì)胞攝取容易、穩(wěn)定性高等優(yōu)點(diǎn)[9]。胞內(nèi)RNA酶將切下的mRNA片段進(jìn)一步降解清除,同時(shí)，解鏈的siRNA，與特異的mRNA直接結(jié)合，通過(guò)RNA依賴性的RNA多聚酶(RNA-dependent RNA polymerase,RdRP)作用，可形成新的dsRNA(雙鏈RNA)，Dicer酶可識(shí)別新的dsRNA并將其酶解，從而形成新的siRNA，由此產(chǎn)生級(jí)聯(lián)反應(yīng)，形成正反饋，引起放大的作用，形成大量新的siRNA，可使RNAi在短時(shí)間內(nèi)高效地抑制靶基因的表達(dá)。RNAi 可應(yīng)用于腫瘤發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移等任何有癌基因或蛋白高表達(dá)的環(huán)節(jié)，如點(diǎn)突變激活的癌基因、融合基因、插入基因、多藥耐藥基因、VEGF及其受體等都可以作為RNAi作用的靶點(diǎn)[10]。

在人類惡性腫瘤中>50%腫瘤組織可檢測(cè)到bcl-2基因或蛋白過(guò)度表達(dá)，它也是某些腫瘤產(chǎn)生耐藥性及預(yù)后不良的重要因素。有研究證實(shí)，它與惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、預(yù)后情況有一定關(guān)聯(lián)[11]。

bcl-2基因是一種凋亡調(diào)控基因，由bcl-2基因?yàn)槟０宸g的bcl-2蛋白，屬于細(xì)胞內(nèi)膜蛋白的一種,多定位于線粒體，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和核膜等細(xì)胞器上。細(xì)胞在多數(shù)刺激劑誘導(dǎo)的凋亡過(guò)程，可被bcl-2高表達(dá)廣泛抑制，從而維持細(xì)胞存活。

bcl-2基因抑制細(xì)胞凋亡通過(guò)以下方式表達(dá)：①阻斷細(xì)胞凋亡信號(hào)傳導(dǎo)通路。細(xì)胞凋亡是通過(guò)內(nèi)在和外在途徑兩個(gè)方式實(shí)現(xiàn)，內(nèi)在途徑是通過(guò)線粒體來(lái)完成，外在途徑則是通過(guò)死亡受體與配體結(jié)合，將細(xì)胞凋亡信號(hào)傳導(dǎo)。高表達(dá)的bcl-2可以通過(guò)抑制凋亡傳導(dǎo)途徑來(lái)抑制細(xì)胞凋亡，Sudjit等[12]研究發(fā)現(xiàn)bcl-2與ERK調(diào)節(jié)激酶形成復(fù)合物而阻斷凋亡途徑，抑制細(xì)胞凋亡；②與Bax的相互作用。Bax可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，而bcl-2抑制細(xì)胞凋亡。兩者結(jié)合產(chǎn)生異源或同源二聚體。二者比例決定細(xì)胞凋亡情況，當(dāng)Bax同源二聚體超過(guò)80%在凋亡信號(hào)誘導(dǎo)下出現(xiàn)凋亡，當(dāng)異源二聚體(Bax/bcl-2和Baxl/bcl-2)含量超過(guò)50%時(shí)，則細(xì)胞抗凋亡能力提高[13]；③bcl-2蛋白抗氧化作用。bcl-2蛋白可通過(guò)抗氧化作用，提高細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽的水平，使細(xì)胞處于氧化還原狀態(tài)，保護(hù)細(xì)胞膜，抑制細(xì)胞凋亡[14]；④bcl-2蛋白和細(xì)胞內(nèi)鈣離子的關(guān)系。細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度升高是引起細(xì)胞凋亡的始發(fā)因素,bcl-2蛋白存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜中,過(guò)高表達(dá)可抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)管釋放鈣離子，因此,bcl-2蛋白能通過(guò)影響內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣離子釋放從而抑制細(xì)胞凋亡[15]。

本次課題，設(shè)計(jì)了以bcl-2基因?yàn)榘悬c(diǎn)的siRNA，利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染至高表達(dá)bcl-2的人肝癌細(xì)胞SMMc-7721細(xì)胞，經(jīng)過(guò)RNAi后檢測(cè)到bcl-2蛋白的表達(dá)明顯下降，細(xì)胞凋亡增加，增殖減慢，抑制效果非常明顯；同時(shí)本實(shí)驗(yàn)證實(shí)了在肝癌發(fā)展過(guò)程中bcl-2蛋白起到了至關(guān)重要的作用，表明bcl-2基因可以做為治療肝癌的靶點(diǎn),有望成為惡性腫瘤治療新手段，近期已有報(bào)道用RNAi聯(lián)合化學(xué)治療治療肝癌和卵巢癌細(xì)胞的研究[16]。隨著研究的發(fā)展，RNA干擾技術(shù)將會(huì)廣泛的應(yīng)用于臨床，成為治療惡性腫瘤的有效手段。

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(收稿時(shí)間：2015-09-22修回時(shí)間：2015-10-25)

·論著·

Effect of bcl-2 Gene Replaced by siRNA on Cell Line of SMMC-7721 Liver Cancer

LIU Zhi-jun, LI Qiang, YUAN Shi-fa, REN Jie (Department of General Surgery， General Hospital of Hebei Provincial Armed Police Force， Shijiazhuang 050081， China)

[Abstract]ObjectiveTo observe the effect of bcl-2 gene replaced by RNA interference (RNAi) on cell line of SMMC-7721 liver cancer. MethodsThe SMMC-7721 cell line of human liver cancer was transfected by small interference RNA (siRNA), and were divided into experiment group (n=25), negative siRNA group (n=25) and control group (n=25). The protein expressions were detected using immunohistochemical method, and the cell cycle and apoptosis were detected using flow cytometry instrument, and the changes of cell invasive ability were detected using Transwell cabin method. ResultsCompared with those in the negative siRNA and control groups, significant apoptosis peak was found, the cell number significantly increased in G1 phase, and the number significantly decreased in S phase in experiment group (P<0.05), while the differences between negative siRNA and control groups were not statistically significant (P>0.05). Compared with those in the negative siRNA and control groups, the cell number of invasive cabin significantly decreased (P<0.05), while the differences between negative siRNA and control groups were not statistically significant (P>0.05). ConclusionThe bcl-2 gene replaced by siRNA can significantly reduce the bcl-2 protein expression of SMMC-7721 cell line of human liver cancer, inhibit infestation of cancer cell and promote cancer apoptosis.

[Key words]Genes, bcl-2； RNA interference； Liver neoplasms

[DOI]10.3969/j.issn.2095-140X.2015.12.010

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼][中國(guó)圖書(shū)資料分類號(hào)]R394.2A

[文章編號(hào)]2095-140X(2015)12-0044-03