孫　浩，李　衛(wèi)，孫可心

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胃腸間質(zhì)瘤c-Kit和PDGFRA基因突變分析

孫浩，李衛(wèi)，孫可心

[摘要]目的分析胃腸間質(zhì)瘤(gastrointestinal stromal tumor, GIST)跨膜酪氨酸激酶受體c-Kit和血小板源性生長(zhǎng)因子受體(platelet-derived growth factor, PDGFRA)基因的突變特征。方法對(duì)57例GIST石蠟標(biāo)本進(jìn)行DNA提取、PCR擴(kuò)增和直接測(cè)序，檢測(cè)c-Kit外顯子9、11、13、17和PDGFRA外顯子12、18突變狀態(tài)。結(jié)果57例GIST標(biāo)本中共檢出44例(77.2%)c-Kit/PDGFRA基因雜合性突變，未檢測(cè)到純合性突變。其中，c-Kit exon9突變9例(15.8%)，c-Kit exon11突變32例(56.1%)，c-Kit exon13突變2例(3.5%)，PDGFRA 18突變1例(1.8%)，c-Kit/PDGFRA均未檢測(cè)到突變的13例(22.8%)。結(jié)論中國(guó)人群c-Kit/PDGFRA突變比例高，突變類型多樣，其中c-Kit外顯子11比例高，進(jìn)行c-Kit/PDGFRA基因分型有助于靶向藥物伊馬替尼的選擇和劑量估計(jì)。

[關(guān)鍵詞]胃腸間質(zhì)瘤；c-kit；PDGFRA；基因突變

胃腸間質(zhì)瘤(gastrointestinal stromal tumor, GIST)是胃腸道最常見(jiàn)的間葉來(lái)源腫瘤，依照目前的GIST診斷標(biāo)準(zhǔn)，新近流行病學(xué)研究顯示發(fā)病率0.66~2.20/10萬(wàn)[1-3]。GIST對(duì)傳統(tǒng)化學(xué)治療極不敏感，化療藥物有效率不足5%，進(jìn)展期中位生存率僅約18個(gè)月[4]。即使完整切除腫瘤，GIST的5年生存率也僅有35%～65%，2年內(nèi)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率40%～50%，首診時(shí)多達(dá)15%~50%的患者存在轉(zhuǎn)移[5]。

研究發(fā)現(xiàn)干細(xì)胞因子表面的跨膜酪氨酸激酶受體c-Kit和血小板源性生長(zhǎng)因子受體(platelet-derived growth factor, PDGFRA)基因的功能活化突變是GIST發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵[6]，針對(duì)以上分子靶點(diǎn)的靶向藥物伊馬替尼和舒尼替尼先后在2001年和2006年被FDA批準(zhǔn)用于GIST的治療，改變了這一疾病的治療策略。伊馬替尼是一種小分子酪氨酸激酶抑制劑(tyrosine kinase inhibitor, TKI)，已發(fā)現(xiàn)的主要分子靶點(diǎn)為Kit，PDGFR A/B和bcl-abl；舒尼替尼的分子靶點(diǎn)較前者更為豐富，可以對(duì)Kit、PDGFRs、VEGFRs、FLT3和RET產(chǎn)生抑制作用。它們可作為假底物與ATP競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合Kit/PDGFRs受體的酪氨酸激酶位點(diǎn)，阻止其自身磷酸化，特異性抑制酪氨酸激酶受體，從而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。國(guó)際多中心Ⅱ、Ⅲ期臨床試驗(yàn)結(jié)果顯示伊馬替尼治療復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移/無(wú)法手術(shù)GIST，其臨床受益率80%左右(PR+SD)，中位生存時(shí)間由12個(gè)月提高至58個(gè)月，因此伊馬替尼治療GIST成為分子靶向治療實(shí)體瘤的經(jīng)典[7-8]。

針對(duì)原發(fā)GIST或復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的GIST，明確其c-Kit和PDGFRA基因突變狀態(tài)，對(duì)GIST進(jìn)行精確的分子分型，篩選靶向藥物適宜患者，根據(jù)基因突變類型推薦合理治療劑量，是GIST個(gè)體化診療的重要環(huán)節(jié)。本研究回顧性總結(jié)了我院原發(fā)或復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的GIST臨床資料及病理特征、c-Kit和PDGFRA基因突變類型，為實(shí)現(xiàn)GIST個(gè)體化治療提供依據(jù)。

1資料與方法

1.1一般資料收集我院2008年1月—2014年6月確診為GIST并接受基因檢測(cè)的患者57例。其中，男22例，女35例；年齡29~76歲，平均年齡54.0歲。57例GIST患者中原發(fā)腫瘤占80.7%(46/57)，胃原發(fā)腫瘤23例(40.3%)，小腸原發(fā)腫瘤20例(35.1%)，結(jié)直腸原發(fā)腫瘤3例(5.3%)。腫瘤直徑<5 cm13例，介于5~10 cm35例，大于10 cm9例。病理特征包括病理組織學(xué)和免疫組織化學(xué)(受體蛋白CD117、CD34、bcl-2、desmin、Ki-67，PDGFRA等表達(dá)情況)結(jié)果，并參照文獻(xiàn)[9-10]評(píng)估GIST病理組織學(xué)亞型：梭形細(xì)胞型、上皮樣細(xì)胞型和混合型細(xì)胞型。其中25例(43.9%)為梭形細(xì)胞型，4(7.0%)例為上皮細(xì)胞型，28例(49.1%)為混合細(xì)胞型。有54例CD117+(94.7%)，3例CD117-者均為CD34+。見(jiàn)表1。

表1　57例GIST患者的臨床和病理基本特征

1.2Kit和PDGFRA基因序列分析方法按照QIAGEN(QIAamp DNA FFPE Tissue Kit)試劑盒操作說(shuō)明提取石蠟組織腫瘤細(xì)胞基因組DNA。分光光度計(jì)檢測(cè)DNA濃度和純度，OD260/280值1.8~2.0方可進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。Kit基因第9、11、13、17外顯子及PDGFRA基因第12、18外顯子PCR引物序列參照文獻(xiàn)[11-12]，見(jiàn)表2。PCR反應(yīng)體系為50 UL，反應(yīng)條件為95℃變性5 min；94℃ 30 s，56℃ 40 s，72℃ 25 s，循環(huán)35次，最后延伸5 min。PCR產(chǎn)物送到上海生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行雙向測(cè)序。其測(cè)序引物序列與PCR反應(yīng)相同，測(cè)序結(jié)果采用BLAST(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov)軟件與NCBI公開(kāi)發(fā)表的基因序列(c-Kit:NC_000004.11,PDGFRA:NC_000004.10)進(jìn)行比對(duì)，分析其突變位點(diǎn)。

表2　Kit/PDGFRA基因PCR擴(kuò)增引物序列

2結(jié)果

c-Kit和PDGFRA基因序列分析在57例GIST標(biāo)本中共檢出44例(77.2%)c-Kit/PDGFRA基因雜合性突變，未檢測(cè)到純合性突變。其中，c-Kit exon9突變9例(15.8%)，c-Kit exon11突變32例(56.1%)，c-Kit exon13突變2例(3.5%)，c-Kit exon17未檢測(cè)到突變，PDGFRA exon12未檢測(cè)到突變，PDGFRA exon18突變1例(1.8%)，c-Kit/PDGFRA均未檢測(cè)到突變的13例(22.8%)，見(jiàn)表3。

表3　腫瘤定位和c-Kit和PDGFRA基因突變類型

c-Kit外顯子9的突變發(fā)生在胃有4例，小腸5例，均為編碼502~503密碼子丙氨酸和酪氨酸的6個(gè)核苷酸(GCCTAT)串聯(lián)重復(fù)插入突變，見(jiàn)圖1、2；c-Kit外顯子11的突變發(fā)生在胃有19例，小腸11例，后腹膜1例，突變類型多樣，其中點(diǎn)突變14例，缺失突變13例，如圖3、4所示，插入突變4例，其中發(fā)生在第557~560個(gè)密碼子12個(gè)核苷酸的點(diǎn)突變是其突變“熱點(diǎn)”，共8例；c-Kit外顯子13的突變有2例，均發(fā)生在小腸，突變類型為點(diǎn)突變；c-Kit外顯子17的突變有1例，發(fā)生在胃，突變類型為點(diǎn)突變；有1例發(fā)生PDGFRA外顯子18的突變，部位在小腸，為常見(jiàn)的D842V點(diǎn)突變。

圖1　野生型c-Kit外顯子9

圖2　c-Kit外顯子9的突變(GCCTAT)

圖3　野生型c-Kit外顯子11

圖4　c-Kit外顯子11的缺失突變

3討論

GIST是消化道最常見(jiàn)的間葉源性腫瘤，絕大部分表達(dá)Kit基因和PDGFRA基因編碼。c-Kit和PDGFRA基因位于人染色體4q12-13，屬于原癌基因，它們編碼的受體蛋白均屬于Ⅲ型酪氨酸激酶受體家族，具有相似的蛋白結(jié)構(gòu)，分為4個(gè)區(qū)：膜外配體結(jié)合區(qū)、跨膜區(qū)、胞內(nèi)近膜區(qū)和酪氨酸激酶區(qū)，后者又被一段插入序列分隔為ATP結(jié)合功能區(qū)(TK1)和磷酸轉(zhuǎn)移酶功能區(qū)(TK2)，ATP結(jié)合功能區(qū)是伊馬替尼與ATP競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合的區(qū)域[11]。

正常情況下，Kit受體沒(méi)有活性，其活化需要干細(xì)胞因子(stem cell factor，SCF)的參與。在GIST細(xì)胞中，由于Kit/PDGFRA基因發(fā)生功能獲得性突變，相應(yīng)的受體蛋白可在缺乏配體結(jié)合的情況下，發(fā)生自發(fā)性持續(xù)活化并激活下游的PI3K/Akt、RAS/MAPK和JAK/STAT3信號(hào)通路，導(dǎo)致腫瘤形成[12]。伊馬替尼是一種特殊的酪氨酸激酶抑制劑，經(jīng)FDA批準(zhǔn)可應(yīng)用于c-Kit陽(yáng)性、不能手術(shù)切除和/或轉(zhuǎn)移性的惡性GISTs的治療。其作用機(jī)理在于藥物結(jié)合于Kit蛋白胞漿內(nèi)酪氨酸激酶功能區(qū)的ATP結(jié)合位點(diǎn)，阻斷磷酸基團(tuán)由ATP向底物酪氨酸殘基的轉(zhuǎn)移，從而抑制細(xì)胞增殖并恢復(fù)細(xì)胞凋亡程序。

大部分GISTs均存在Kit基因突變，從而導(dǎo)致c-Kit蛋白的活化,不需要配體SCF參與就能刺激腫瘤細(xì)胞的持續(xù)增殖和抗凋亡信號(hào)的失控[13-14]。GISTs中Kit基因突變率約為90%，且突變形式多樣。其中位于11號(hào)外顯子Lys550-Val560區(qū)段的變異最為常見(jiàn)(占70~80%)，位于9號(hào)外顯子Ala502-Tyr503區(qū)段的6堿基重復(fù)突變約占5%~10%。本研究檢測(cè)出44例(77.2%)c-Kit/PDGFRA基因雜合性突變，約低于目前的研究報(bào)道，可能由于某些標(biāo)本含腫瘤細(xì)胞數(shù)量少及一代測(cè)序方法靈敏度相對(duì)較低等因素導(dǎo)致少量標(biāo)本出現(xiàn)假陽(yáng)性等情況；c-Kit exon9突變9例(15.8%)，約低于江慧等[15]的研究結(jié)果，可能是由于c-Kit exon9突變發(fā)生與部位不同所致，如在小腸的突變率高于胃，而我們選擇的標(biāo)本較多的來(lái)源于胃，這將影響c-Kit Exon9的突變比例。c-Kit exon11突變32例(56.1%)，與目前報(bào)道的結(jié)果接近。c-Kit exon13突變2例(3.5%)，PDGFRA exon18突變1例(1.8%)，接近目前的研究報(bào)道[15]。

檢測(cè)Kit基因突變對(duì)于指導(dǎo)GIST患者的合理用藥，具有重要的參考價(jià)值。臨床研究表明[13,16-17]，GIST中Kit基因的突變情況與格列衛(wèi)分子靶向治療的療效相關(guān)：存在11號(hào)外顯子突變患者的療效最好，存在9號(hào)外顯子突變的患者療效次之，而Kit基因?yàn)橐吧蜁r(shí)，格列衛(wèi)的療效最差。另外，對(duì)于9號(hào)外顯子突變的患者，提高用藥劑量可顯著提高療效。研究結(jié)果表明，對(duì)于Kit基因無(wú)突變的GIST患者，還需要檢測(cè)有無(wú)PDGFRA基因是否存在激活性突變(主要位于外顯子12、18)，PDGFRA外顯子發(fā)生突變的GIST病例對(duì)格列衛(wèi)治療敏感。臨床研究顯示，伊馬替尼對(duì)GIST、腦瘤和黑色素瘤同樣有效[18]；PDGFRA外顯子18及外顯子12發(fā)生突變的多數(shù)GIST患者對(duì)伊馬替尼敏感。但PDGFRA外顯子18的D842V突變會(huì)導(dǎo)致GIST患者對(duì)伊馬替尼原發(fā)耐藥。因此，檢測(cè)腫瘤患者PDGFRA基因突變情況可用于預(yù)測(cè)伊馬替尼治療是否有效。對(duì)于外顯子突變類型差異與伊馬替尼療效的關(guān)系我們也在進(jìn)一步觀察當(dāng)中。

本研究結(jié)果提示c-Kit/PDGFRA基因突變比例高，突變類型多樣，而不同的突變類型與GIST靶向治療的選擇、伊馬替尼劑量的評(píng)估、療效及預(yù)后相關(guān)[13]。因此，檢測(cè)GIST的c-Kit/PDGFRA基因突變類型，根據(jù)遺傳特征對(duì)GIST患者進(jìn)行個(gè)體化給藥具有十分重要的意義。

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(收稿時(shí)間：2015-09-20修回時(shí)間：2015-10-21)

·論著·

Analysis of c-Kit and PDGFRA Gene Mutation in GIST

SUN Hao1, LI Wei1, SUN Ke-xin2(1. Department of Gastrointestinal Surgery, Chongqing Cancer Hospital Affiliated to Guangxi Medical University, Chongqing 400030, China; 2. the First Department of Medicine, Chongqing Medical University, Chongqing 400030, China)

[Abstract]ObjectiveTo analyze mutation characteristics of transmembrane receptor tyrosine kinase c-kit and platelet-derived growth factor (PDGFRA) genes in gastrointestinal stromal tumor (GIST) patients. MethodsDNA extraction, PCR amplification and direct sequencing were performed in 57 paraffin-embedded GIST specimens in order to detect mutations of t-RTKS exon 9, 11, 13 and 17 and PDGFRA exon 12 and 18. ResultsA total of 44 cases (77.2%) of c-Kit/PDGFRA gene heterozygous mutation were detected among the 57 GIST specimens, but there was no homozygosity mutation. There were 9 cases (15.8%) of t-RTKS exon 9 mutations, 32 cases (56.1%) of t-RTKS exon 11 mutations, 2 cases (3.5%) of t-RTKS exon 13 mutations, 1 case (1.8%) of PDGFRA exon 18 mutation and 13 cases (22.8%) without t-RTKS/PDGFRA mutations. ConclusionThe t-RTKS/PDGFRA has high mutations rates in Chinese population with diverse mutation types, and mutations rate of t-RTKS exon 11 is high. The t-RTKS/PDGFRA genotyping may help to choose targeted drug Imatinib and evaluate the dose.

[Key words]Gastrointestinal stromal tumor; c-Kit; Platelet-derived growth factor; Gene mutation

[DOI]10.3969/j.issn.2095-140X.2015.12.008

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼][中國(guó)圖書(shū)資料分類號(hào)]R735A

[文章編號(hào)]2095-140X(2015)12-0036-05

[通訊作者]李衛(wèi)，E-mail:lwaq3356@sian.com

[基金項(xiàng)目][作者單位]400030 重慶市，廣西醫(yī)科大學(xué)附屬重慶市腫瘤醫(yī)院胃腸外科(孫浩、李衛(wèi))，重慶醫(yī)科大學(xué)2013級(jí)醫(yī)學(xué)一系丙三班(孫可心)