史子學(xué)，王秀杰

（1.上海市嘉定區(qū)農(nóng)業(yè)委員會(huì)，上海 嘉定 201800；2.北京科高大北農(nóng)飼料有限責(zé)任公司，北京 懷柔 101407）

檢測(cè)新技術(shù)

高通量測(cè)序技術(shù)應(yīng)用于豬病檢測(cè)的探討

史子學(xué)1，王秀杰2

（1.上海市嘉定區(qū)農(nóng)業(yè)委員會(huì)，上海 嘉定 201800；2.北京科高大北農(nóng)飼料有限責(zé)任公司，北京 懷柔 101407）

高通量測(cè)序技術(shù)以及全基因組深度測(cè)序技術(shù)的快速發(fā)展，加速了檢測(cè)技術(shù)的更新步伐。文章對(duì)高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展及在微生物檢測(cè)領(lǐng)域應(yīng)用進(jìn)行綜述，并對(duì)高通量測(cè)序技術(shù)檢測(cè)豬病的實(shí)踐應(yīng)用進(jìn)行了分析。

高通量測(cè)序技術(shù)；豬?。恍掳l(fā)和突發(fā)傳染病

早期確診并快速清除感染豬是控制豬病的關(guān)鍵，豬病病原體潛伏在豬體內(nèi)未檢出的時(shí)間越長(zhǎng)，導(dǎo)致傳染病擴(kuò)散的風(fēng)險(xiǎn)就越大。在早期，人們通過(guò)典型的臨床癥狀及病理變化即可進(jìn)行豬病診斷。然而，近30年來(lái)，非典型臨床病例和混合感染現(xiàn)象越來(lái)越多，給豬病診斷增加了難度，單純的依靠臨床癥狀、病理解剖或僅僅檢測(cè)個(gè)別豬病，已不能對(duì)大多數(shù)病例做出正確診斷。從養(yǎng)豬業(yè)的實(shí)際需求來(lái)說(shuō)，一方面對(duì)于臨床的豬病要求盡量全面的檢測(cè)出病原種類；另一方面，新發(fā)與再現(xiàn)豬病、豬病混合感染的復(fù)雜趨勢(shì)，都對(duì)豬病檢測(cè)提出了更高的要求。

近年來(lái)出現(xiàn)的高通量測(cè)序技術(shù)（High-throughput sequencing）又稱為下一代測(cè)序技術(shù)，在病原體檢測(cè)及未知病原體發(fā)現(xiàn)方面具有重要意義。高通量測(cè)序技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)一次對(duì)幾十萬(wàn)到幾百萬(wàn)條DNA分子進(jìn)行序列測(cè)定；覆蓋面廣，能檢測(cè)樣品中全部遺傳信息；準(zhǔn)確性高，其準(zhǔn)確率可高達(dá)99.99%。這為豬病的檢測(cè)提供了一種重要的檢測(cè)技術(shù)。

1 高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展

測(cè)序技術(shù)一直推動(dòng)著病原學(xué)研究的發(fā)展，先進(jìn)的測(cè)序技術(shù)為病原檢測(cè)提供了強(qiáng)大的工具。從20世紀(jì)90年代開始，Sanger測(cè)序法被廣泛應(yīng)用在生物信息學(xué)研究當(dāng)中，并在人類基因組計(jì)劃（HGP）中發(fā)揮了巨大的作用。但由于Sanger測(cè)序法通量太低、速度較慢，運(yùn)用Sanger方法的病原體序列研究受到測(cè)序深度的限制，只能了解到病原群體中部分的個(gè)體，并且不能全面檢測(cè)到病原體基因組的數(shù)據(jù)。而且傳統(tǒng)的Sanger測(cè)序方法要先構(gòu)建一個(gè) cDNA文庫(kù)，然后采用挑選克隆測(cè)序的方法，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)程序繁瑣，且時(shí)間和經(jīng)濟(jì)成本較高，所以傳統(tǒng)的測(cè)序法并沒(méi)有對(duì)病原檢測(cè)技術(shù)產(chǎn)生深遠(yuǎn)影響。

以高通量測(cè)序?yàn)樘攸c(diǎn)的新一代測(cè)序技術(shù)具有極高的測(cè)序通量、速度快、成本顯著降低和高度自動(dòng)化的優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于基因組測(cè)定、表達(dá)譜分析、病原微生物檢測(cè)等海量基因序列的相關(guān)研究中[1]。高通量測(cè)序與Sanger方法相比被稱為深度測(cè)序，包括第二代測(cè)序和第三代測(cè)序技術(shù)（基于納米孔的單分子測(cè)序方法），其中第二代測(cè)序技術(shù)包括基因芯片測(cè)序和高通量測(cè)序平臺(tái)?；蛐酒瑴y(cè)序是在芯片上并行地對(duì)可高達(dá)百萬(wàn)的DNA 分子進(jìn)行測(cè)序，一次可以產(chǎn)生巨大數(shù)據(jù)量的測(cè)序結(jié)果，它顯示了測(cè)序技術(shù)劃時(shí)代的變革，成為新一代測(cè)序技術(shù)的重要成員?；蛐酒瑴y(cè)序方法雖然達(dá)到了快速和高通量的標(biāo)準(zhǔn)，但是需要預(yù)先知道待測(cè)基因的序列制作芯片，其測(cè)序靈活性很差，對(duì)于研究基因組數(shù)據(jù)庫(kù)不完備的物種受到限制。

2 主流的高通量測(cè)序技術(shù)

以454高通量測(cè)序?yàn)榇淼氖悄壳白罹邞?yīng)用前景的第二代測(cè)序技術(shù)，其克服了先前測(cè)序技術(shù)的不足，采用邊合成邊測(cè)序，即通過(guò)捕捉新合成的末端的標(biāo)記來(lái)確定DNA的序列，尤其適合沒(méi)有基因組參考序列的物種的基因組或轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。454高通量測(cè)序則避免了Sanger測(cè)序中涉及的繁重的大量克隆實(shí)驗(yàn)，顯著減少了工作量和提高了工作效率。454高通量測(cè)序技術(shù)是現(xiàn)今應(yīng)用最廣泛的測(cè)序技術(shù)，公認(rèn)特點(diǎn)是成本低、通量高、速度快，可以快速產(chǎn)生大量的數(shù)據(jù)。以高通量測(cè)序檢測(cè)環(huán)境中微生物多樣性流程為例：環(huán)境樣品提取基因組DNA—16S rDNA高變區(qū)ITS PCR富集—構(gòu)建測(cè)序文庫(kù)—上機(jī)測(cè)序—得到高質(zhì)量測(cè)序數(shù)據(jù)—生物信息學(xué)分析。目前各個(gè)公司研制出了不同的454高通量測(cè)序平臺(tái)，2005年，454公司推出基于焦磷酸測(cè)序技術(shù)的454測(cè)序儀為標(biāo)志，代表著新一代測(cè)序技術(shù)的推廣和應(yīng)用。2006年，美國(guó)Illumina公司進(jìn)軍新一代DNA測(cè)序市場(chǎng)，研發(fā)出了測(cè)序平臺(tái)—Solexa測(cè)序儀。2007年，美國(guó)ABI公司也推出了第二代測(cè)序平臺(tái)—SOLiD測(cè)序儀。454 FLX進(jìn)行測(cè)序的片段比較長(zhǎng)，高質(zhì)量的讀長(zhǎng)可達(dá)到400 bp左右，比較適合對(duì)未知基因進(jìn)行全序列的測(cè)定。Solexa測(cè)序價(jià)格低廉，性價(jià)比最高，同等條件下成本只有454測(cè)序的1/10。且具有全自動(dòng)化的測(cè)序系統(tǒng)，可以讀取的片段數(shù)目較多，非常適合大量小片度的測(cè)序。SOLiD測(cè)序?qū)τ诿總€(gè)堿基讀取兩次，準(zhǔn)確度高，原始?jí)A基數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確度大于99.94%，15X覆蓋率時(shí)接近100%。

3 高通量測(cè)序在病原體檢測(cè)領(lǐng)域的應(yīng)用

雖然各種454高通量測(cè)序平臺(tái)沒(méi)有達(dá)到測(cè)序方面的完美，但這幾種平臺(tái)均適合用于臨床對(duì)病原進(jìn)行快速、精確地檢測(cè)，并且此技術(shù)在發(fā)現(xiàn)未知病原體研究上已顯示了技術(shù)先進(jìn)性[2]。高通量測(cè)序在醫(yī)學(xué)、環(huán)境、食品領(lǐng)域應(yīng)用較廣泛[3]。例如，早產(chǎn)兒通常面對(duì)較大的健康問(wèn)題，有時(shí)甚至受到致死性感染，這可能是由于腸道微生物引起的。研究人員利用羅氏454 GS FLX Titanium測(cè)序系統(tǒng)對(duì)于11例極低出生體重嬰兒的腸道樣本進(jìn)行測(cè)序，不僅獲得了細(xì)菌的信息，還有真核真菌和蛔蟲的片段。根據(jù)檢測(cè)結(jié)果，可以針對(duì)性地對(duì)這些嬰兒使用抗菌素和針對(duì)白色念珠菌感染的制霉菌素抗真菌藥物等積極治療手段。此外，最近，挪威和英國(guó)的417家養(yǎng)殖場(chǎng)發(fā)現(xiàn)一種破壞心臟和肌肉組織，致死率高達(dá)20%的心臟和骨骼肌炎癥（HSMI）。雖然研究表明這是一種傳染病，但研究人員未能鑒定出病原體。美國(guó)哥倫比亞大學(xué)及挪威國(guó)家醫(yī)學(xué)研究所等機(jī)構(gòu)的研究人員組成了一個(gè)專門的研究小組，利用羅氏454測(cè)序系統(tǒng)的高通量測(cè)序技術(shù)，發(fā)現(xiàn)該疾病是一種與呼腸孤病毒相關(guān)的未知病毒感染引起的。借助高通量測(cè)序和生物信息學(xué)方面的經(jīng)驗(yàn)，在幾周內(nèi)獲得了這種未知病毒的全基因組序列。高通量測(cè)序技術(shù)可以檢測(cè)土壤中細(xì)菌、真菌、原生動(dòng)物、病毒及類病毒等微生物的多樣性。Sogin等檢測(cè)深海和未探索的稀有生物圈微生物多樣性，454測(cè)序結(jié)果顯示，大西洋海底和熱泉中的微生物比先前報(bào)道的數(shù)據(jù)高1～2個(gè)數(shù)量級(jí)，并且微生物類群更豐富。Li等采用454測(cè)序技術(shù)研究國(guó)內(nèi)釀酒發(fā)酵過(guò)程中細(xì)菌和真菌的多樣性，檢測(cè)到的細(xì)菌分屬于15個(gè)科，真菌分屬于6個(gè)科，60%的真菌ITS1序列屬于酵母科。國(guó)內(nèi)外研究表明，高通量測(cè)序平臺(tái)應(yīng)用于病原微生物及未知病原體檢測(cè)具有巨大潛力。

4 高通量測(cè)序技術(shù)在生豬等養(yǎng)殖業(yè)中的應(yīng)用

Eilliott等通過(guò)常規(guī)方法研究豬舍空氣中微生物，鑒定到存在大腸桿菌、葡萄球菌、彎曲桿菌、革蘭氏陰性菌、變形菌、放線菌等。李紅梅等[4]使用高通量測(cè)序技術(shù)檢測(cè)規(guī)模化豬場(chǎng)空氣中微生物及其污染傳播規(guī)律，發(fā)現(xiàn)豬舍空氣微生物種類多樣性，包括有16種門、115種科、217種屬，在鑒定的10種優(yōu)勢(shì)菌群中，6種為病原微生物，表明高通量測(cè)序技術(shù)在豬病檢測(cè)中具有非常大的應(yīng)用價(jià)值。王楷宬等[5]應(yīng)用高通量測(cè)序檢測(cè)禽類臨床樣品中未知病原，高效率地發(fā)現(xiàn)2種新病毒，并得到該病毒的部分基因組，為后續(xù)制定防控策略提供了可靠數(shù)據(jù)。

5 高通量測(cè)序技術(shù)檢測(cè)豬病的應(yīng)用前景

當(dāng)前我國(guó)豬病流行的新形勢(shì)及新發(fā)、突發(fā)豬病的潛在威脅，為高通量測(cè)序技術(shù)應(yīng)用于豬病檢測(cè)提供了現(xiàn)實(shí)需求。相比前幾年，高通量測(cè)序技術(shù)的經(jīng)濟(jì)成本已經(jīng)大大降低，對(duì)于全面掌握一個(gè)豬場(chǎng)或地區(qū)豬病的流行背景確實(shí)為一種可靠工具，例如，可以對(duì)某一地區(qū)或豬場(chǎng)病死豬無(wú)害化處理冷庫(kù)中樣品，定期用高通量測(cè)序技術(shù)檢測(cè)，得到的數(shù)據(jù)可為當(dāng)?shù)刂贫ㄒ卟》揽夭呗蕴峁﹨⒖?，也可作為基礎(chǔ)數(shù)據(jù)上報(bào)國(guó)家動(dòng)物疫情測(cè)報(bào)站。高通量測(cè)序技術(shù)在應(yīng)用中也要注意臨床樣品選擇問(wèn)題，不同的豬傳染病的病原體在組織中載量有差別，豬藍(lán)耳病病毒在血液中載量高、豬流感優(yōu)先檢測(cè)呼吸道、肛拭子等樣品，檢測(cè)豬瘟則推薦采集扁桃體、腎臟和淋巴結(jié)等。如何選擇臨床樣品，有效檢測(cè)各種豬病需要在臨床應(yīng)用中進(jìn)一步探討。

6 結(jié)語(yǔ)

高通量測(cè)序技術(shù)在豬病檢測(cè)領(lǐng)域的應(yīng)用，將極大地提高我們對(duì)臨床樣品中豬病混合感染及未知病原的全面認(rèn)識(shí)，對(duì)豬病檢測(cè)、診斷水平帶來(lái)跨越式的提升。2016年國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目已發(fā)布，2項(xiàng)豬重要疫病的診斷與檢測(cè)新技術(shù)研究獲得立項(xiàng)，相信將對(duì)豬病檢測(cè)診斷技術(shù)帶來(lái)進(jìn)一步的創(chuàng)新性發(fā)展。

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2016-06-30）

國(guó)家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金資助（31302132）

史子學(xué)（1978-），男，博士，研究方向：重大動(dòng)物疫病防控。