李翅翅，　李力群，　黃春霞，　張　丹

(溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 1整形外科， 2呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，浙江 溫州 325000)

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自噬通過抑制凋亡促進(jìn)體外饑餓狀態(tài)下脂肪細(xì)胞存活*

李翅翅1，李力群1，黃春霞1，張丹2△

(溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院1整形外科，2呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，浙江 溫州 325000)

[摘要]目的： 觀察體外饑餓狀態(tài)下脂肪細(xì)胞的自噬變化，研究自噬在維持體外饑餓狀態(tài)下脂肪細(xì)胞存活中的作用。方法: 將小鼠3T3-L1細(xì)胞誘導(dǎo)成為脂肪細(xì)胞后，雷帕霉素(rapamycin，RAP)預(yù)處理脂肪細(xì)胞，在缺糖缺氧(oxygen-glucose deprivation，OGD)模擬的饑餓環(huán)境中孵育細(xì)胞。應(yīng)用Western blotting及透射電鏡法檢測(cè)細(xì)胞自噬變化，用TUNEL染色及Western blotting檢測(cè)脂肪細(xì)胞凋亡。結(jié)果: OGD條件下脂肪細(xì)胞的自噬水平明顯升高，RAP預(yù)處理進(jìn)一步上調(diào)了OGD條件下的細(xì)胞自噬。與對(duì)照組相比，OGD組細(xì)胞cleaved caspase-3的水平及細(xì)胞凋亡率明顯升高(P<0.01)。RAP預(yù)處理降低了OGD 條件下cleaved caspase-3的水平，并明顯降低了細(xì)胞凋亡率(P<0.05)。結(jié)論: 自噬在饑餓狀態(tài)下脂肪細(xì)胞存活中發(fā)揮保護(hù)性作用，提高自噬水平有助于降低饑餓狀態(tài)下脂肪細(xì)胞的凋亡水平。

[關(guān)鍵詞]脂肪細(xì)胞； 饑餓； 自噬； 細(xì)胞凋亡； 雷帕霉素

自體脂肪細(xì)胞因具有來源豐富、獲取方便、無排異反應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)，目前已被頜面外科和整形外科等廣泛應(yīng)用于移植后填充面部皮下凹陷性缺損或畸形等。然而移植后脂肪細(xì)胞存活率較低導(dǎo)致該技術(shù)的治療效果不盡人意。研究表明，脂肪移植后在新的微環(huán)境中處于相對(duì)饑餓狀態(tài)，營養(yǎng)物質(zhì)缺乏導(dǎo)致移植的細(xì)胞發(fā)生凋亡甚至壞死[1]。據(jù)報(bào)道，自體脂肪細(xì)胞移植后吸收率約25%～80%[2]。目前亟待尋求提高移植后脂肪細(xì)胞存活率或提高其對(duì)抗饑餓等應(yīng)激刺激的方法。

自噬是真核細(xì)胞所特有的一種分解代謝過程，是細(xì)胞的一種保護(hù)性作用。生理狀態(tài)下細(xì)胞的自噬水平很低，但饑餓、缺血及缺氧等應(yīng)激刺激可提高細(xì)胞自噬水平[3-4]。研究認(rèn)為，自噬通過清除細(xì)胞內(nèi)衰老細(xì)胞器及錯(cuò)誤折疊蛋白，不僅抑制短期饑餓、缺血缺氧刺激條件下細(xì)胞死亡，并且可為細(xì)胞存活提供能量物質(zhì)[5-6]。盡管如此，自噬是否對(duì)移植后脂肪細(xì)胞存活發(fā)揮作用目前尚不清楚。

雷帕霉素(rapamycin，RAP)是一種臨床上廣泛使用的免疫抑制劑，同時(shí)，RAP也是一種自噬促進(jìn)劑，主要通過特異性抑制哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白復(fù)合體(mammalian target of rapamycin complex)1的功能而上調(diào)細(xì)胞自噬水平[7]。研究已發(fā)現(xiàn)RAP在多種疾病中發(fā)揮的細(xì)胞保護(hù)性作用源于其對(duì)自噬的調(diào)節(jié)[8-9]。本研究中，我們首先將3T3-L1細(xì)胞誘導(dǎo)成脂肪細(xì)胞，然后通過用RAP預(yù)處理的方法干預(yù)體外模擬饑餓狀態(tài)下脂肪細(xì)胞的自噬水平，由此研究自噬對(duì)饑餓狀態(tài)下脂肪細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)作用。

材料和方法

1細(xì)胞及誘導(dǎo)分化

小鼠3T3-L1成纖維細(xì)胞(前脂肪細(xì)胞)購自ATCC。3T3-L1成纖維細(xì)胞使用正常高糖10%胎牛血清-11965 DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)，培養(yǎng)瓶置于37 ℃、5%CO2恒溫孵育箱中。觀察到細(xì)胞融合后，加入誘導(dǎo)液A(1.67 μmol/L胰島素、1 μmol/L地塞米松和0.5 mmol/L IBMX)進(jìn)行第1次誘導(dǎo)，并記為第0天。于第2天將誘導(dǎo)液A棄去，換以誘導(dǎo)液B(1.67 μmol/L胰島素)進(jìn)行第2次誘導(dǎo)。隔天更換新鮮正常高糖10%胎牛血清-11965 DMEM培養(yǎng)液，在第8天可觀察到90%以上的細(xì)胞變圓并有大量脂滴出現(xiàn)，表明3T3-L1已被誘導(dǎo)成為成熟的脂肪細(xì)胞。收取細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2方法

2.1實(shí)驗(yàn)分組及體外饑餓微環(huán)境模擬按照文獻(xiàn)[3]所描述的缺糖缺氧(oxygen-glucose deprivation，OGD)方法在體外模擬饑餓微環(huán)境。將脂肪細(xì)胞隨機(jī)分為對(duì)照組和OGD組。對(duì)照組分為空白對(duì)照組和RAP處理組；OGD組分為單純OGD處理組及RAP預(yù)處理后進(jìn)行OGD組。OGD模擬方法如下，將RAP按照10 nmol/L濃度加入細(xì)胞培養(yǎng)基中孵育4 h，然后用不含葡萄糖及胎牛血清的培養(yǎng)基更換正常培養(yǎng)基并將培養(yǎng)皿放入37 ℃無氧培養(yǎng)箱中孵育8 h。

2.2Western blotting用細(xì)胞蛋白裂解液處理脂肪細(xì)胞后收集細(xì)胞上清，然后行15% SDS-PAGE分離蛋白，使用Bio-Rad的標(biāo)準(zhǔn)濕式轉(zhuǎn)膜裝置將凝膠中蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上，設(shè)定轉(zhuǎn)膜電流為250 mA，轉(zhuǎn)膜時(shí)間為60 min，加入Western blot封閉液，在搖床上緩慢搖動(dòng)，室溫封閉60 min，再分別以兔抗微管相關(guān)蛋白1輕鏈3 (microtubule-associated protein 1-light chain 3, LC3)及兔抗活化半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3蛋白(cleaved caspase-3)單抗為Ⅰ抗，以標(biāo)記有辣根過氧化物酶的羊抗兔Ig為Ⅱ抗孵育電轉(zhuǎn)膜。內(nèi)參照蛋白選用β-actin。使用Thermo的ECL試劑為底物，曝光X光片，顯色、定影。最后通過Quantity One 4.6軟件對(duì)發(fā)光條帶的灰度值進(jìn)行分析，通過比較各組LC3-II/LC3-I及cleaved caspase-3/β-actin的比值分別檢測(cè)自噬水平及活化caspase-3表達(dá)水平。

2.3透射電鏡標(biāo)本制備及自噬結(jié)構(gòu)斷面積統(tǒng)計(jì)在不同處理組的脂肪細(xì)胞中加入2.5%戊二醛，在4 ℃條件下預(yù)固定2 h。用0.1 mol/L磷酸漂洗液漂洗3次，每次15 min。然后用1%鋨酸固定3 h，再用0.1 mol/L磷酸漂洗液漂洗3次，每次15 min。50%→70%→90%乙醇逐級(jí)脫水，各15 min。在4 ℃條件下，用90%乙醇和90%丙酮混合液(1∶1)置換乙醇，再用90%丙酮置換，各15 min。然后，在室溫下用純丙酮置換3次，每次20 min。將細(xì)胞放入純丙酮和Jpurr樹脂(2∶1)的混合液中浸透，室溫條件下放置3 h。然后，在純丙酮和Jpurr樹脂(1∶2)的混合液中過夜。在37 ℃條件下，在Jpurr樹脂中放置2 h。依次于37 ℃烘箱中過夜，45 ℃烘箱中放置12 h，60 ℃烘箱中放置24 h。首先將包埋后的細(xì)胞塊于超薄切片機(jī)上切取厚度為1.5 mm的半薄切片，將其移到涂有蛋白甘油加水滴的載玻片上，然后于37 ℃烘箱內(nèi)烘干。將甲苯胺藍(lán)染液(10 g/L)滴在切片上，5 min后，用洗瓶沖洗切片上多余的染液，濾紙吸干水分，自然干燥。光學(xué)顯微鏡下觀察半薄切片確定含有細(xì)胞，用Reichert-ultracut E型超薄切片機(jī)做超薄切片，厚度為50～60 nm。在透射電鏡下觀察細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)的自噬前體和自噬體等自噬相關(guān)結(jié)構(gòu)。用VLCDS圖像分析儀檢測(cè)并分析單位細(xì)胞斷面面積內(nèi)的自噬結(jié)構(gòu)數(shù)目，比較OGD各組與對(duì)照組之間的差異。

2.4脫氧核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記 (TdT-mediated dUTP nick-end labeling, TUNEL)法檢測(cè)細(xì)胞凋亡按照上海碧云天生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒說明書，將貼壁生長的脂肪細(xì)胞用冰冷PBS清洗2次,用4%多聚甲醛固定30 min，PBS清洗1次，用0.1%的Triton X-100于冰浴上孵育2 min，將配置好的TUNEL染色液50 μL加入后置于37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)避光孵育1 h。然后在熒光顯微鏡下觀察并統(tǒng)計(jì)細(xì)胞凋亡率，綠色熒光細(xì)胞為TUNEL染色陽性的凋亡細(xì)胞。

3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)均獨(dú)立重復(fù)3次，采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，各組間的差別采用單因素方差分析進(jìn)行比較，各組均數(shù)間兩兩比較采用Bonferroni檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1RAP預(yù)處理提高了OGD條件下脂肪細(xì)胞的自噬水平

與空白對(duì)照組細(xì)胞相比，RAP預(yù)處理增強(qiáng)了正常生長細(xì)胞LC3-I向LC3-II的轉(zhuǎn)化率(P<0.01)。OGD處理組細(xì)胞的LC3-II表達(dá)水平較對(duì)照組明顯增加(P<0.01)。與OGD處理組相比，RAP預(yù)處理增加了OGD條件下LC3-I向LC3-II的轉(zhuǎn)換(P<0.01)，見圖1。

2RAP預(yù)處理對(duì)OGD條件下脂肪細(xì)胞自噬超微結(jié)構(gòu)的影響

本實(shí)驗(yàn)中我們觀察到自噬前體呈馬蹄形樣雙層膜結(jié)構(gòu)，其不完全包裹胞質(zhì)樣物質(zhì)，自噬體呈多層膜包裹的橢圓形結(jié)構(gòu)，其包裹物為細(xì)胞胞質(zhì)樣的物質(zhì)。自噬溶酶體則為單層膜結(jié)構(gòu)，其內(nèi)容物為自噬體包裹物降解的碎片。統(tǒng)計(jì)分析表明，與對(duì)照組相比，RAP預(yù)處理后正常細(xì)胞組及OGD處理組細(xì)胞單位斷面面積內(nèi)自噬相關(guān)超微結(jié)構(gòu)的數(shù)目顯著增多(P<0.01)，而RAP預(yù)處理繼而OGD處理組細(xì)胞中此參數(shù)較單純OGD組進(jìn)一步增高(P<0.01)，見圖2。

Figure 1.The autophagic level in oxygen-glucose deprivation (OGD)-challenged adipose cells with rapamycin (RAP) preconditioning. Mean±SD.n=3.##P<0.01vscontrol group;**P<0.01vsOGD group.

圖1Western blot方法檢測(cè)細(xì)胞自噬水平

Figure 2.Autophagic ultrastructures observed by transmission electron microscopy and statistical analysis. A: the autophagosome precursor (↑) was a hippocrepiform and had double membrane structure; B: the autophagosome was coated by multi-membrane (↑); the contents of the autophagosome may be cytoplasm; C: the autophagolysosome was a structure with single membrane and contained degraded cellular content (↑); D: quantitative analysis of the number of autophagosomes in different groups. Mean±SD.n=3.##P<0.01vscontrol group;**P<0.01vsOGD group.

圖2自噬超微結(jié)構(gòu)圖像及統(tǒng)計(jì)分析

3提高自噬水平改善了OGD引發(fā)的脂肪細(xì)胞凋亡

與對(duì)照組相比，RAP處理正常細(xì)胞組caspase-3表達(dá)無明顯變化，但OGD組細(xì)胞cleaved caspase-3水平明顯升高(P<0.01)。與單純OGD組相比，RAP預(yù)處理則顯著降低了OGD組細(xì)胞的cleaved caspase-3的水平(P<0.05)，見圖3。

Figure 3.The effects of autophagy on the protein levels of cleaved caspase-3 in OGD-challenged adipose cells.Mean±SD.n=3.#P<0.05,##P<0.01vscontrol group;*P<0.05vsOGD group.

圖3自噬對(duì)OGD條件下脂肪細(xì)胞凋亡基因caspase-3表達(dá)的影響

我們進(jìn)一步用TUNEL染色法檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。與對(duì)照組細(xì)胞凋亡率相比，單純RAP預(yù)處理組細(xì)胞凋亡率改變不明顯，而OGD處理后細(xì)胞凋亡率明顯上升(P<0.01)。與單純OGD組相比，RAP預(yù)處理后OGD處理組細(xì)胞凋亡率下降(P<0.05)，見圖4。

討論

本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了OGD條件下脂肪細(xì)胞的自噬變化并研究了自噬對(duì)OGD微環(huán)境下脂肪細(xì)胞凋亡及存活的影響。與對(duì)照組相比，OGD條件下脂肪細(xì)胞的自噬水平升高，cleaved caspase-3的蛋白水平上調(diào)，細(xì)胞凋亡率明顯升高。預(yù)先用RAP提高自噬水平后，明顯降低了OGD誘發(fā)的細(xì)胞凋亡率。本文提出，適度提高自噬有利于降低OGD條件下脂肪細(xì)胞的凋亡，從而促進(jìn)細(xì)胞存活。

游離脂肪組織移植后致高吸收率和低存活率問題的主要原因是脂肪細(xì)胞對(duì)缺糖缺氧環(huán)境的耐受力差，在重新建立血運(yùn)之前脂肪細(xì)胞處于饑餓狀態(tài)，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡、壞死發(fā)生[1]。我們的研究也進(jìn)一步驗(yàn)證了這個(gè)過程。OGD方法體外模擬饑餓環(huán)境中，脂肪細(xì)胞的活化caspase-3水平及凋亡率較對(duì)照組明顯升高。同樣，OGD環(huán)境下細(xì)胞自噬水平較對(duì)照組明顯上調(diào)。為了進(jìn)一步明確自噬與凋亡之間的相互作用關(guān)系，我們用RAP預(yù)處理提高細(xì)胞自噬水平。我們發(fā)現(xiàn)自噬水平提高的脂肪細(xì)胞在OGD條件下，活化的caspase-3蛋白水平及凋亡率均較單純OGD條件下細(xì)胞降低。這表明，自噬對(duì)細(xì)胞凋亡發(fā)生抑制作用。既往研究表明，活化的caspase-3是凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)的最初激活激酶。我們推斷，caspase-3很可能是OGD條件下自噬發(fā)揮其凋亡抑制作用的主要調(diào)節(jié)靶點(diǎn)之一。除此之外，自噬可能通過其它作用發(fā)揮凋亡抑制作用。研究表明，細(xì)胞通過自噬包裹受損的線粒體，由此減少了損傷線粒體內(nèi)諸如細(xì)胞色素C等一系列促凋亡因子的釋放，從而抑制了凋亡的啟動(dòng)[10]。這些過程對(duì)于移植后脂肪細(xì)胞在建立新的血液循環(huán)前饑餓環(huán)境下的存活是有益的。

Figure 4.The effect of autophagy on the apoptotic rate of adipose cells challenged by OGD (TUNEL assay). Promoting autophagy with RAP alleviated OGD-induced apoptosis of the adipose cells. Mean±SD.n=3.#P<0.05,##P<0.01vscontrol group;*P<0.05vsOGD group.

圖4自噬對(duì)OGD條件下脂肪細(xì)胞凋亡率的影響

RAP因具有抑制炎癥反應(yīng)的作用而最初主要用于抑制臨床上器官移植后的免疫排斥。近年來，研究證實(shí)RAP可以通過抑制哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)的活性而誘導(dǎo)自噬水平[7]。我們?cè)诒狙芯恐邪l(fā)現(xiàn)，RAP預(yù)處理可以有效上調(diào)OGD條件下脂肪細(xì)胞的自噬水平，并明顯降低了細(xì)胞凋亡率。在饑餓、缺血缺氧等應(yīng)激狀態(tài)下，細(xì)胞內(nèi)無菌性炎癥反應(yīng)的發(fā)生是致細(xì)胞凋亡、壞死的主要原因之一。我們?cè)谥把芯恐邪l(fā)現(xiàn)，低劑量RAP可以有效誘導(dǎo)體外模擬缺血再灌注微環(huán)境中肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞自噬，并減輕細(xì)胞死亡及損傷，此作用絕大部分源于其對(duì)細(xì)胞自噬的誘導(dǎo)作用[11]。其它研究也證實(shí)，RAP的作用呈劑量依賴性，低劑量RAP發(fā)揮的免疫抑制作用微乎其微，高劑量則發(fā)揮明顯抗炎作用，甚至易導(dǎo)致細(xì)胞轉(zhuǎn)化為腫瘤細(xì)胞[12]。本研究中使用的藥物劑量遠(yuǎn)低于其免疫抑制或致瘤性所需劑量。所以，將低劑量RAP用于臨床脂肪細(xì)胞移植治療具有可行性，可同時(shí)發(fā)揮其抗炎及促自噬的雙重作用而促進(jìn)細(xì)胞存活，并且避免了高劑量可能致腫瘤形成等不良作用。

綜上所述，本研究明確了低劑量RAP預(yù)處理可有效提高脂肪細(xì)胞的自噬水平。而提高自噬水平可通過抑制活化凋亡相關(guān)蛋白酶caspase-3的活化而降低了OGD模擬的饑餓狀態(tài)下細(xì)胞凋亡，從而提高脂肪細(xì)胞在體外饑餓條件下的存活。我們的研究為進(jìn)一步闡明移植后脂肪細(xì)胞存活、死亡機(jī)制提供了新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，并且本研究結(jié)果表明低劑量RAP干預(yù)自噬有望作為未來改善脂肪細(xì)胞移植治療效果的新手段。

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(責(zé)任編輯： 林白霜， 羅森)

*[基金項(xiàng)目]寧波市社會(huì)發(fā)展計(jì)劃(No. 2011C50021)

▲并列第1作者

Autophagy promotes survival of adipose cells by inhibiting apoptosis underinvitrostarvation LI Chi-chi1, LI Li-qun1, HUANG Chun-xia1, ZHANG Dan2

(1DepartmentofPlasticSurgery,2DepartmentofRespiratoryandCriticalCareMedicine,TheFirstAffiliatedHospitalofWenzhouMedicalUniversity,Wenzhou325000，China.E-mail:zhangdan6250@yeah.net)

[ABSTRACT]AIM: To detect the changes of autophagy in adipose cells under starvation, and to clarify the effects of autophagy on the cell survival and apoptosis under starvation. METHODS: Rapamycin (RAP) was applied to promote autophagy of adipose cells. These cells were then incubated under oxygen-glucose deprivation (OGD) condition. After exposure of the cells to OGD, the changes of autophagy and apoptosis were determined by Western blotting, transmission electron microscopy and TUNEL assay. RESULTS: Compared with the control cells, OGD-challenged cells had much higher level of autophagy. The apoptotic rate in OGD group was much higher than that in control group, which was reflected by increased protein level of activated caspase-3 and percentages of TUNEL positive cells. Preconditioning with RAP effectively improved OGD-induced autophagy, but did not affect the cell survival and apoptosis under normal condition, and obviously decreased the apoptotic rate of the cells under OGD condition. CONCLUSION: Autophagy protects adipose cells against starvation-induced apoptosis. Promotion of autophagy is helpful for attenuating starvation-induced apoptosis of the cells under OGD condition.

[KEY WORDS]Adipose cells; Starvation; Autophagy; Apoptosis; Rapamycin

通訊作者△Tel: 0574-87035808； E-mail: yexiaolei@gmail.com

[收稿日期]2015- 04- 13[修回日期] 2015- 09- 20

[文章編號(hào)]1000- 4718(2015)12- 2233- 06

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2015.12.019

[中圖分類號(hào)]R622; R363

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A