高美玲，　王　紅，　張彩云，　蘭　婧，　李夏青△

(1山西醫(yī)科大學(xué)病理生理教研室，山西 太原 030001； 2蘭州大學(xué)第一醫(yī)院，甘肅 蘭州 730000)

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血清型A肉毒桿菌神經(jīng)毒素重鏈對(duì)Neuro-2a細(xì)胞的促神經(jīng)突起再生作用*

高美玲1，王紅1，張彩云2，蘭婧1，李夏青1△

(1山西醫(yī)科大學(xué)病理生理教研室，山西 太原 030001；2蘭州大學(xué)第一醫(yī)院，甘肅 蘭州 730000)

[摘要]目的： 觀察血清型A肉毒桿菌神經(jīng)毒素重鏈(botulinum neurotoxin serotype A heavy chain，BoNT/A HC)對(duì)Neuro-2a細(xì)胞的促神經(jīng)突起再生作用并探討與其相關(guān)的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)機(jī)制。方法: 采用體外細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，在培養(yǎng)液中加入不同濃度的BoNT/A HC(0.01 nmol/L、0.1 nmol/L、1 nmol/L和10 nmol/L)進(jìn)行干預(yù)，于24 h、48 h和72 h時(shí)收集細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光染色，再計(jì)算細(xì)胞突起長度及有突起細(xì)胞的百分比；在此基礎(chǔ)上，選擇最有效的BoNT/A HC濃度作為處理劑量加入細(xì)胞培養(yǎng)液，于BoNT/A HC作用后不同時(shí)點(diǎn)收集全細(xì)胞蛋白，采用Western blot檢測p-ERK1/2及p-Akt的蛋白水平。 結(jié)果: 當(dāng)BoNT/A HC 濃度為0.1 nmol/L、1 nmol/L和10 nmol/L時(shí)，細(xì)胞突起的長度及有突起細(xì)胞的百分比與對(duì)照組相比皆明顯增加，差異顯著(P<0.05)，其中1 nmol/L效果最顯著。在細(xì)胞培養(yǎng)液內(nèi)加入1 nmol/L BoNT/A HC 后，p-ERK1/2的蛋白水平呈增加趨勢，其中BoNT/A HC作用60 min后，p-ERK1/2的增加與對(duì)照組相比差異顯著(P<0.05)；與p-ERK1/2變化趨勢類似，細(xì)胞培養(yǎng)液內(nèi)加入1 nmol/L的BoNT/A HC后， p-Akt的蛋白水平也呈增加趨勢，其中BoNT/A HC作用15 min和60 min 時(shí)，p-Akt增加顯著(P<0.05)。結(jié)論: 一定劑量的BoNT/A HC可以促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞突起再生和生長； BoNT/A HC對(duì)Neuro-2a細(xì)胞的促神經(jīng)突起再生作用機(jī)制可能通過激活與神經(jīng)再生相關(guān)的信號(hào)蛋白ERK1/2和Akt的磷酸化而實(shí)現(xiàn)。

[關(guān)鍵詞]血清型A肉毒桿菌神經(jīng)毒素重鏈； Neuro-2a細(xì)胞株； 神經(jīng)突起再生； 細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶； 蛋白激酶B

肉毒桿菌神經(jīng)毒素(botulinum neurotoxin，BoNT)是一種由肉毒桿菌產(chǎn)生并釋放的細(xì)菌外毒素，是一種致病力極強(qiáng)的神經(jīng)肌肉毒素，可導(dǎo)致致命肉毒癥。BoNT也是迄今為止所發(fā)現(xiàn)的致死率極強(qiáng)的生物毒素之一[1]。目前BoNT已經(jīng)廣泛用于臨床治療與肌肉反應(yīng)性過強(qiáng)相關(guān)的一些疾病，如斜視、眨眼癥、斜頸、面肌痙攣及腦癱引起的外周肌肉強(qiáng)直等[2]。根據(jù)血清型將BoNT分為A型、B型、C型、D型、E型、F型和G型7種類型，其中A型BoNT(BoNT/A)毒力最強(qiáng)，也是目前主要的市售BoNT[3]。BoNT/A為蛋白多肽，其分子由一條包含結(jié)合域的重鏈(heavy chain，HC)和一條包含酶域的輕鏈(light chain，LC)所組成，二者借二硫鍵相互連接[4]。HC有氨基端和羧基端兩個(gè)功能區(qū)域，氨基端稱為穿膜域，主要形成離子通道；羧基端稱為結(jié)合域，主要介導(dǎo)毒素的內(nèi)吞。LC具有鋅金屬蛋白酶活性，是毒素的催化單位[5]。

關(guān)于BoNT/A 在中毒的神經(jīng)末梢可以誘導(dǎo)軸突出芽的現(xiàn)象早已有一些研究報(bào)道[6]。近些年發(fā)現(xiàn)，BoNT/A除了抑制乙酰膽堿等神經(jīng)遞質(zhì)釋放外，在體外還可以直接刺激運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元突起增長、分枝增多[6]?；贐oNT/A LC的主要作用是裂解突觸相關(guān)蛋白，是BoNT引起中毒的主要活性單位，而BoNT/A HC為BoNT的主要膜結(jié)合蛋白，當(dāng)其與宿主膜蛋白結(jié)合后不僅介導(dǎo)輕鏈入胞，同時(shí)還有可能通過受體-配體結(jié)合而激活細(xì)胞內(nèi)多種信號(hào)通路，因此提出設(shè)想：BoNT/A HC與宿主細(xì)胞膜受體結(jié)合所引發(fā)的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路有可能與毒素所引發(fā)的神經(jīng)末梢出芽、運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元突起生長及分枝增多現(xiàn)象有關(guān)。因此本研究采用小鼠腦神經(jīng)母細(xì)胞瘤Neuro-2a細(xì)胞驗(yàn)證BoNT/A HC對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的促神經(jīng)突起增生作用，并探討其作用機(jī)制。

材料和方法

1細(xì)胞系及主要試劑

Neuro-2a細(xì)胞購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫；DMEM高糖培養(yǎng)基(HyClone)；胎牛血清(ExCell Bio)；青鏈霉素(索來寶)；多聚賴氨酸(Sigma)；0.25%胰蛋白酶含0.02% EDTA和酚紅(全式金)；人工重組BoNT/A HC(List Biological Labotories Inc.)

2細(xì)胞培養(yǎng)

Neuro-2a細(xì)胞用DMEM 高糖培養(yǎng)液(含10%胎牛血清和1%青鏈霉素)，于37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱(Thermo)中培養(yǎng)。每隔2 d 按50%換液1次，并在倒置光學(xué)顯微鏡下連續(xù)觀察細(xì)胞生長情況，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到培養(yǎng)瓶80%時(shí)進(jìn)行傳代。

3方法

3.1細(xì)胞接種及處理取10代以內(nèi)細(xì)胞以每孔1×104接種到預(yù)先用多聚賴氨酸鋪被的96孔培養(yǎng)板中，每孔50 μL培養(yǎng)液。并輕搖培養(yǎng)板使細(xì)胞均勻分布，然后放置在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中維持4 h，使細(xì)胞充分貼壁后加入BoNT/A HC干預(yù)，濃度分別為0 nmol/L、0.01 nmol/L、0.1 nmol/L、1 nmol/L及10 nmol/L。

3.2免疫熒光法分別加入BoNT/A HC于培養(yǎng)液24 h、48 h和72 h后按下列方法收集細(xì)胞進(jìn)行β-tubulin免疫熒光染色。棄掉培養(yǎng)液，用0.1 mol/L、pH 7.4的PBS洗去殘存的培養(yǎng)液，用4%多聚甲醛固定30 min，0.1 mol/L 的PBS洗滌(5 min×3次)，10%正常血清封閉30 min，加入鼠抗β-tubulin單克隆抗體(1∶1 000；Invitrogen)，4 ℃冰箱孵育過夜。棄去 I 抗，PBS充分沖洗(5 min×3次)，加入Alexa Fluor? 594結(jié)合的羊抗鼠IgG II 抗(1∶500； Invitrogen)，室溫避光孵育1 h，PBS充分沖洗后加入含有DAPI熒光封片劑(Invitrogen)，置于倒置熒光顯微鏡(Olympus)下進(jìn)行觀察并采集圖片。

3.3神經(jīng)突起長度及有突起細(xì)胞的百分比的測量應(yīng)用ImageJ軟件對(duì)所攝取的β-tubulin免疫熒光染色圖片上的細(xì)胞進(jìn)行突起長度測定及有突起細(xì)胞占圖片所有細(xì)胞百分比的測定。凡長度大于細(xì)胞胞體最大直徑的突起被認(rèn)定為生長突起。每個(gè)濃度為一組，每組包含6孔，每組平均攝取圖像20張圖片，每張圖片上測定符合標(biāo)準(zhǔn)的8個(gè)細(xì)胞的突起，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，在Photoshop下分別計(jì)數(shù)有突起細(xì)胞數(shù)量及圖片上細(xì)胞總數(shù)。

3.4Western blot檢測p-ERK1/2及p-Akt的蛋白水平Neuro-2a細(xì)胞長至70%～ 80%時(shí)加入1 nmol/L的BoNT/A HC，于加入BoNT/A HC后不同時(shí)點(diǎn)用0.25%胰蛋白酶含0.02% EDTA消化收集各時(shí)點(diǎn)細(xì)胞，2 000 r/min離心5 min后，用RIPA 裂解液[含1%蛋白酶抑制劑和1%磷酸酶抑制劑(Sigma)]冰上裂解蛋白60 min，4 ℃，Bradford法蛋白濃度測定試劑盒(上海生工)蛋白定量。取30 μg 蛋白，煮沸10 min，10% SDS-PAGE分離蛋白，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入抗p-ERK1/2 (1∶2 000；CST)、抗p-Akt(1∶1 000；CST)、抗ERK1/2 (1∶1 000；CST)及抗Akt抗體(1∶1 000；CST)，4 ℃搖床孵育過夜充分洗滌后加入HRP 標(biāo)記的羊抗兔IgG(1∶5 000；上海生工)室溫孵育1 h,EasySee Western blot kit發(fā)光液(全式金) 測定反應(yīng)條帶灰度值，以GAPDH 作為內(nèi)參照。

4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。所有數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，應(yīng)用單因素方差分析(One-way ANOVA)分析數(shù)據(jù)差異的顯著性，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1BoNT/A HC對(duì)Neuro-2a細(xì)胞軸突生長的影響

免疫熒光觀察3個(gè)時(shí)點(diǎn)的細(xì)胞均收集于同一代細(xì)胞，且培養(yǎng)條件一致。加入不同濃度BoNT/A HC后24 h、48 h和72 h時(shí)其神經(jīng)軸突長度均較對(duì)照組細(xì)胞明顯增長，而且尤以BoNT/A HC 濃度為1 nmol/L時(shí)最為明顯(P<0.01)。具體來講，BoNT/A HC 作用24 h時(shí)，0.01 nmol/L與對(duì)照組相比細(xì)胞軸突長度雖有所增加，但差異不顯著。而其它各濃度組與對(duì)照組比較, 細(xì)胞突起明顯增長, 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，當(dāng)BoNT/A HC作用48 h和72 h時(shí)，0.1 nmol/L、1 nmol/L及10 nmol/L組的細(xì)胞突起長度與對(duì)照組相比其差異也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P< 0.05)。歸納起來，3個(gè)時(shí)點(diǎn)不同濃度BoNT/A HC均對(duì)Neuro-2a細(xì)胞突起的生長具有刺激作用，尤以濃度為1 nmol/L最為明顯，見圖1。

2BoNT/A HC刺激細(xì)胞突起數(shù)量增多

分別計(jì)數(shù)每張圖片中有軸突細(xì)胞數(shù)占細(xì)胞總數(shù)的百分比發(fā)現(xiàn)，隨著BoNT/A HC濃度的增加，有突起細(xì)胞所占百分比也隨之增加。BoNT/A HC 作用24 h后，0.01 nmol/L、0.1 nmol/L及1 nmol/L組具有突起的細(xì)胞百分比均較對(duì)照組有所增加。與促進(jìn)細(xì)胞突起增長一樣，BoNT/A HC 濃度為1 nmol/L時(shí)，有突起細(xì)胞的百分比增多最為明顯。然而，實(shí)驗(yàn)中觀察到，當(dāng)BoNT/A濃度為10 nmol/L時(shí)，具有突起的細(xì)胞百分比并未繼續(xù)增加，反而稍有降低。BoNT/A HC 作用48 h及72 h后有突起細(xì)胞所占百分比與24 h類似，仍以1 nmol/L作用最為顯著。與此同時(shí)，0.01 nmol/L在各個(gè)時(shí)點(diǎn)與對(duì)照組相比雖有增加趨勢，但差異皆不顯著?？傊?，BoNT/A HC單一濃度作用的不同時(shí)點(diǎn)，有軸突細(xì)胞的百分比隨著作用時(shí)間的延長呈增加的趨勢，見圖2。

3BoNT/A HC促進(jìn)Neuro-2a細(xì)胞中信號(hào)蛋白ERK1/2和Akt的磷酸化

基于前述實(shí)驗(yàn)，采用1 nmol/L BoNT/A HC作為干預(yù)劑量，對(duì)BoNT/AHC作用于Neuor-2a細(xì)胞后不同時(shí)點(diǎn)信號(hào)蛋白ERK1/2和Akt的蛋白表達(dá)及磷酸化激活狀態(tài)進(jìn)行檢測。

加入1 nmol/L 的BoNT/A HC后，ERK1/2的總量各組間無明顯差異，但是p-ERK1/2的水平則呈增加趨勢，BoNT/A HC作用時(shí)間≥60 min時(shí)， p-ERK1/2 的水平明顯增加，與對(duì)照組相比差異顯著(P<0.05)，同時(shí)，p-ERK1/2的免疫熒光染色也呈現(xiàn)相同的趨勢。實(shí)驗(yàn)中觀察到的另一個(gè)現(xiàn)象是：盡管在BoNT/A HC后，Neuro-2a細(xì)胞ERK1/2的磷酸化水平整體呈增加趨勢，但呈現(xiàn)60 min和4 h 2個(gè)時(shí)間峰值，見圖3。

加入1 nmol/L BoNT/A HC后，Western blot顯示Akt的總體水平無明顯變化，但p-Akt的水平呈現(xiàn)增加趨勢，尤以15 min和60 min明顯，與對(duì)照組比較差異顯著(P<0.05)。更有意思的是，Akt的磷酸化程度在加入BoNT/A HC后也呈現(xiàn)2個(gè)時(shí)間峰值, 分別是15 min 和60 min，見圖4。

上述結(jié)果均表明，BoNT/A HC可促進(jìn)Neuro-2a細(xì)胞中ERK1/2和Akt信號(hào)蛋白磷酸化。加入BoNT/A HC后，p-ERK1/2和p-Akt的增強(qiáng)皆呈現(xiàn)時(shí)間上的雙峰值，且p-Akt激活峰值的出現(xiàn)早于p-ERK1/2。

討論

本研究表明BoNT/AHC具有促進(jìn)神經(jīng)突起再生的效應(yīng)，其表現(xiàn)為BoNT/A HC作用于培養(yǎng)的Neuro-2a細(xì)胞不同時(shí)間后可刺激細(xì)胞突起增長，同時(shí)具有神經(jīng)突起的Neuro-2a細(xì)胞的百分比明顯增加。BoNT/A HC的這種促神經(jīng)突起再生效應(yīng)在一定范圍內(nèi)具有濃度依賴性。隨著BoNT/A HC濃度增加，其促神經(jīng)突起增長的作用增強(qiáng)，這與前人有關(guān)肉毒素中毒后期神經(jīng)末梢的出芽現(xiàn)象及體外肉毒素刺激運(yùn)動(dòng)神經(jīng)突起再生有關(guān)的報(bào)道是一致的。研究中還觀察到，如果BoNT/A HC的劑量過高，譬如達(dá)到10 nmol/L時(shí)，其刺激神經(jīng)突起再生的作用并不會(huì)進(jìn)一步增加，反而有所降低。很少有研究調(diào)查這種發(fā)芽的細(xì)胞及分子機(jī)制，然而，關(guān)于肉毒素中毒后期的神經(jīng)末梢出芽或體外促進(jìn)神經(jīng)突起再生的機(jī)制目前并不清楚，大多數(shù)人僅僅認(rèn)為這種出芽很大程度上只是一種非特異性的化學(xué)去神經(jīng)反應(yīng)[6]。

Figure 1. Concentration-dependent effect of BoNT/A HC on the neurite outgrowth of Neuro-2a cells. The neurons were labeled with mouse anti-β-tubulin (red). Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vs0 nmol/L.

圖1BoNT/A HC對(duì)Neuro-2a細(xì)胞神經(jīng)軸突長度的濃度依賴性影響

Figure 2.The neurite positive percentage of the Neuro-2a cells treated with different concentrations of BoNT/A HC at 24 h, 48 h and 72 h. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vs0 nmol/L.

圖2不同濃度的BoNT/A HC在不同時(shí)點(diǎn)有軸突細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)的百分比

ERK1/2和Akt是目前公認(rèn)的與細(xì)胞存活、再生相關(guān)的重要細(xì)胞內(nèi)信號(hào)蛋白，二者通過上游信號(hào)分子激活后被磷酸化，以磷酸化的活性形式參與對(duì)下游信號(hào)通路的干預(yù)。ERK1/2是MAPK家族的主要成員之一，又稱p44/p42絲裂原活化蛋白激酶，為信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要分子[7]。已經(jīng)有報(bào)道一些神經(jīng)生長因子如IGF-1、NGF和BDNF會(huì)促進(jìn)MAPK/ERK再生信號(hào)通路而導(dǎo)致神經(jīng)再生[8]，而以前的研究也表明ERK1/2能夠參與細(xì)胞的增殖、分化、細(xì)胞形態(tài)的維持及骨架的構(gòu)建[9]。Akt是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，PI3K/Akt信號(hào)通路的激活主要參與抑制細(xì)胞凋亡、促進(jìn)細(xì)胞存活機(jī)制。PI3K可誘導(dǎo)無活性的 Akt 轉(zhuǎn)移至漿膜內(nèi)表面，使其Ser473和Thr308位點(diǎn)磷酸化，從而使 Akt 活化(磷酸化)[10]。在上述基礎(chǔ)上，本研究的結(jié)果發(fā)現(xiàn)BoNT/A HC作用于Neuro-2a細(xì)胞后可引起細(xì)胞內(nèi)ERK1/2和Akt信號(hào)蛋白磷酸化過程增強(qiáng)，且二者磷酸化增強(qiáng)皆表現(xiàn)出時(shí)間上的雙峰現(xiàn)象，其中p-ERK1/2的2個(gè)峰值為加入BoNT/A HC 后60 min和4 h；而p-Akt的增強(qiáng)則分別是15 min和60 min，比p-ERK1/2的激活呈現(xiàn)較早。由此，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)p-ERK1/2和p-Akt磷酸化的改變有可能是BoNT/A HC促進(jìn)神經(jīng)突起再生的重要信號(hào)蛋白和分子機(jī)制。目前已經(jīng)證實(shí)，在神經(jīng)系統(tǒng)里ERK1/2和Akt通常被神經(jīng)營養(yǎng)因子(NGF和BDNF)激活，表現(xiàn)為磷酸化過程增強(qiáng)，從而參與促進(jìn)神經(jīng)元存活或神經(jīng)突起再生[11]。文獻(xiàn)報(bào)道激活的Akt信號(hào)通路在神經(jīng)細(xì)胞的生長發(fā)育、增殖、髓鞘形成、軸突再生和細(xì)胞凋亡方面起著重要的作用[12]；抑制 Akt 降解和促進(jìn) Akt 活化均可以促進(jìn)軸突的形成和生長[13]。近年的研究也表明，PI3K/Akt 信號(hào)通路在微管組裝和動(dòng)力學(xué)方面具有非常重要的作用[14]。微管系統(tǒng)和肌動(dòng)蛋白絲是組成軸突細(xì)胞骨架的主要部分，它們之間的相互影響，對(duì)軸突的生長和延伸至關(guān)重要[15]。Markus等[16]的研究證實(shí)ERK1/2及Akt的磷酸化可以被同一種刺激所激活，在同一時(shí)點(diǎn)，Akt激活的倍數(shù)明顯高于ERK1/2。

小鼠神經(jīng)母細(xì)胞瘤Neuro-2a細(xì)胞是由Klebe和Ruddle經(jīng)A株白鼠的自生腫瘤建立[17]。Neuro-2a細(xì)胞株的主要組織來源是腦神經(jīng)母細(xì)胞瘤和神經(jīng)母細(xì)胞，形態(tài)似神經(jīng)和阿米巴樣干細(xì)胞，具有神經(jīng)干細(xì)胞的特征，培養(yǎng)時(shí)呈單層貼壁細(xì)胞生長狀態(tài)，普通培養(yǎng)條件下部分細(xì)胞可形成神經(jīng)突起。另外，Neuro-2a細(xì)胞含有與BoNT/A HC結(jié)合的膜蛋白成分，因此培養(yǎng)液內(nèi)加入BoNT/A HC可以引起Neuro-2a細(xì)胞膜上出現(xiàn)受體-配體復(fù)合物形成并激活相應(yīng)細(xì)胞內(nèi)再生相關(guān)信號(hào)蛋白。

除上述之外，本實(shí)驗(yàn)中還觀察到BoNT/A HC作用于Neuro-2a細(xì)胞后ERK1/2和Akt的磷酸化增強(qiáng)呈現(xiàn)2個(gè)時(shí)間高峰。從時(shí)間的延續(xù)性看，Akt高峰值的出現(xiàn)早于ERK1/2，結(jié)果提示，當(dāng)BoNT/A HC與細(xì)胞表面相應(yīng)受體結(jié)合而激活細(xì)胞內(nèi)信號(hào)蛋白時(shí)，Akt的激活要早于ERK1/2。但是這種時(shí)間延續(xù)上的信號(hào)蛋白磷酸化雙峰值的跳躍性增加的機(jī)制還不是十分清楚。Steinmetz等[18]采用卵巢癌原代細(xì)胞培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)ERK1/2的磷酸化在癌細(xì)胞增殖過程中也呈時(shí)間上的雙峰表達(dá)現(xiàn)象, 并認(rèn)為這種時(shí)間延續(xù)上的ERK1/2磷酸化的變化可能與MEK依賴性和非依賴性2種機(jī)制有關(guān)。有文獻(xiàn)報(bào)道，Akt和ERK1/2皆參與應(yīng)激反應(yīng)[19]。因此本研究中外源性給予BoNT/A HC時(shí)，Neuro-2a細(xì)胞是否也表現(xiàn)有早期應(yīng)激反應(yīng)尚待進(jìn)一步證實(shí)，但是，ERK1/2及Akt磷酸化時(shí)間序列上的第一個(gè)峰值與應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)的可能性是存在的。如果有這樣的可能，2種信號(hào)蛋白第一個(gè)磷酸化的高峰可能屬于應(yīng)激反應(yīng)，而隨后的長時(shí)程磷酸化增強(qiáng)高峰則可能才是受體-配體激活引起的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)蛋白的激活。

Figure 3.Phosphorylation of ERK1/2 affected by 1 nmol/L of BoNT/A HC treatment for different incubation time in Neuro-2a cells. Mean±SD.n=4.*P<0.05,**P<0.01vscontrol.

圖3BoNT/A HC(1 nmol/L)作用不同時(shí)間對(duì)Neuro-2a細(xì)胞ERK1/2磷酸化的影響

綜上所述，BoNT/A或BoNT/A HC具有促神經(jīng)再生的作用，其作用機(jī)制可能與其相關(guān)膜受體激活細(xì)胞內(nèi)某些信號(hào)通路相關(guān)，BoNT/A HC與相應(yīng)膜受體結(jié)合所激活的與ERK1/2及Akt相關(guān)的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路可能是BoNT/A HC促進(jìn)神經(jīng)突起增長的主要機(jī)制。然而，鑒于細(xì)胞各種信號(hào)蛋白質(zhì)之間相互作用的復(fù)雜情況，BoNT/A HC與膜受體結(jié)合后所激活的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路尚未完全明了，因此，有關(guān)BoNT/A HC促進(jìn)神經(jīng)突起再生/增長的機(jī)制還需進(jìn)一步深入研究。

Figure 4.Phosphorylation of Akt affected by 1 nmol/L of BoNT/A HC treatment for different incubation periods in cultured Neuro-2 cells. Mean±SD.n=4.*P<0.05vscontrol.

圖4BoNT/A HC(1 nmol/L)作用不同時(shí)間對(duì)Neuro-2a細(xì)胞Akt磷酸化的影響

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(責(zé)任編輯： 盧萍， 羅森)

*[基金項(xiàng)目]浙江省自然科學(xué)基金青年基金資助項(xiàng)目(No.LQ15H150002)；國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.81571923)

Promoting effect of botulinum neurotoxin serotype A heavy chain on neuritogenesis in cultured Neuro-2a cellsGAO Mei-ling1, WANG Hong1, ZHANG Cai-yun2, LAN Jing1, LI Xia-qing1

(1DepartmentofPathophysiology,ShanxiMedicalUniversity,Taiyuan030001,China;2TheFirstHospitalofLanzhouUniversity,Lanzhou730000,China.E-mail:xqli2013@126.com)

[ABSTRACT]AIM: To observe the neuritogenic actions of botulinum neurotoxin serotype A heavy chain (BoNT/A HC) on cultured Neuro-2a cells and to investigate the related signaling mechanisms for the effect of BoNT/A HC. METHODS: Neuro-2a cells were treated with different doses of BoNT/A HC (0.01, 0.1, 1 and 10 nmol/L), and then the cells were harvested at 24 h, 48 h and 72 h of BoNT/A HC exposure for detecting the neurite length and the percen-tage of the cells with neuronal processes by immunofluorescence staining. The most efficient dose of BoNT/A HC was chosen for exposure to Neuro-2a cells as the above. Whole cell protein was harvested at different time points for detecting the protein levels of phosphorylated ERK1/2 (p-ERK1/2) and phosphorylated Akt (p-Akt) by Western blot. RESULTS: Low doses of BoNT/A HC stimulated the neurite outgrowth, and increased the percentage of the cells with neurites compared with the negative controls (P<0.05), especially in the group with 1 nmol/L of BoNT/A HC treatment. Meanwhile, the phosphorylation of ERK1/2 and Akt was increased after treated with BoNT/A HC. There was an increasing tendency for the phosphorylation of ERK1/2 after the exposure of the cells to BoNT/A HC. The obvious increase in p-ERK1/2 was seen from 60 min to 5 h with 1 nmol/L of BoNT/A HC treatment (P< 0.05), and the increased protein level of p-Akt was mainly observed at 15 min and 60 min (P<0.05). CONCLUSION: BoNT/A HC stimulates the neuritogenesis. The neuritogenic mechanism of BoNT/A HC on Neuro-2a cells might be realized by activation of the phosphorylation of ERK1/2 and Akt.

[KEY WORDS]Botulinum neurotoxin serotype A heavy chain; Neuro-2a cell line; Neuritogenesis; Extracellular signal-regulated kinases; Protein kinase B

通訊作者△Tel： 0577-88069280； E-mail： zhangdan6250@yeah.net

[收稿日期]2015- 08- 07[修回日期] 2015- 09- 30

[文章編號(hào)]1000- 4718(2015)12- 2228- 05

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2015.12.018

[中圖分類號(hào)]R392.12

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A