毛　霞,　高麗華,　鄧昌明

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院心血管內(nèi)科，重慶 400010)

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小白菊內(nèi)酯對球囊損傷后新生內(nèi)膜增殖的影響

毛霞,高麗華,鄧昌明△

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院心血管內(nèi)科，重慶 400010)

[摘要]目的： 研究小白菊內(nèi)酯(PN)對球囊損傷(balloon injury,BI)后新生內(nèi)膜的影響及機(jī)制。方法: 將30只雄性新西蘭兔2.0～2.3 kg在高脂適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后隨機(jī)分為6組：假手術(shù)+生理鹽水(sham+NS)組; 假手術(shù)+二甲基亞砜(sham+DMSO)組；球囊損傷+生理鹽水(BI+NS)組；球囊損傷+DMSO(BI+DMSO)組；球囊損傷+PN低劑量(BI+PN low)組；球囊損傷+PN高劑量(BI+PN high)組。PN溶解于DMSO，術(shù)后立即按分組腹腔注射同體積藥物治療，每日1次。繼續(xù)高脂喂養(yǎng)4周后取血清及髂總動(dòng)脈，分析比較血管內(nèi)-中膜厚度、半胱氨酰天冬氨酸蛋白酶(caspase)-1、白細(xì)胞介素(IL)-1β和IL-8的表達(dá)量以及血清總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL)和高密度脂蛋白(HDL)的含量。 結(jié)果: BI+DMSO組較sham+DMSO組內(nèi)膜厚度、caspase-1、IL-1β和 IL-8的表達(dá)量增加(P<0.05)；與BI+DMSO組比較，上述指標(biāo)在PN高、低劑量組有不同程度降低，但僅PN高劑量組與其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；各組血脂指標(biāo)差異不明顯。結(jié)論: PN能抑制球囊損傷后的內(nèi)膜增殖，其機(jī)制可能與抗炎作用有關(guān)。

[關(guān)鍵詞]小白菊內(nèi)酯； 內(nèi)膜增殖； Caspase-1

動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)作為心腦血管疾病的重要的病因[1]，嚴(yán)重影響人類的健康。AS是一種內(nèi)皮損傷后血管增殖性疾病，以血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)表型改變、遷移以及過度增殖為特征，因此抑制VSMCs的異常增殖成為防治AS的措施之一[2]。炎癥貫穿于AS發(fā)生發(fā)展的全過程[3]，內(nèi)膜損傷后多種炎癥細(xì)胞侵潤并分泌大量促炎因子，導(dǎo)致VSMCs增殖并向內(nèi)膜遷移，血管內(nèi)膜增厚，管腔狹窄，研究表明抑制炎癥可達(dá)到改善內(nèi)膜增殖的目的[4]。小白菊內(nèi)酯(parthenolide，PN)是提取于墨西哥印度草藥的一種倍半萜烯內(nèi)酯，廣泛用于抗腫瘤研究，近年來PN因其抗炎作用而受到關(guān)注。本實(shí)驗(yàn)通過高脂喂養(yǎng)聯(lián)合球囊損傷(balloon injury,BI)建立模型，觀察PN對兔髂動(dòng)脈損傷后內(nèi)膜增殖的影響并探討其機(jī)制，為臨床防治AS提供新思路。

材料和方法

1材料和儀器

30只雄性新西蘭白兔，體重2.0～2.3 kg，由重慶醫(yī)科大學(xué)試驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號為SCXK(渝)2012-0001。

2主要材料和儀器

PN(天津士蘭生物科技公司)；二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)購于Sigma；免疫組化試劑盒(北京中杉金橋生物科技公司)；Western blot配膠試劑盒、ECL發(fā)光液及總蛋白提取試劑盒(上海碧云天生物科技公司)；膽固醇及蛋白濃度測定試劑盒(北京鼎國昌盛生物科技公司)；Caspase-1 p20抗體、IL-1β抗體(北京博奧森生物科技公司)；β-actin抗體(北京康為世紀(jì)生物科技公司)；IL-8 ELISA試劑盒(北京欣博盛生物科技公司)；3.0 Fogarty球囊導(dǎo)管(Edwards Life Science)；AUI1000自動(dòng)生化分析儀(Olympus)。

3主要方法

3.1模型構(gòu)建在既往建?；A(chǔ)上進(jìn)行改良[5-6]，將30只家兔用高脂(1%膽固醇+6%豬油+93%基礎(chǔ)飼料)適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后隨機(jī)分為6組，每組5只：假手術(shù)+生理鹽水(sham+NS)組; 假手術(shù)+二甲基亞砜(sham+DMSO)組；球囊損傷+生理鹽水(BI+NS)組；BI+DMSO組；BI+PN低劑量(BI+PN low)組,PN劑量為1 mg/kg；BI+PN高劑量(BI+PN high)組，PN劑量為2 mg/kg。用3%戊巴比妥鈉30 mg/kg耳緣靜脈注射進(jìn)行麻醉，右側(cè)腹股溝區(qū)備皮，鈍性分離血管鞘，暴露股動(dòng)脈，送入球囊導(dǎo)管至髂總動(dòng)脈，以0.69 ATM的壓力充盈球囊并回拉導(dǎo)管損傷內(nèi)膜，重復(fù)3次，每次間歇約1 min，抽空球囊后退出血管，結(jié)扎股動(dòng)脈，逐層縫合皮膚。對照組只分離結(jié)扎股動(dòng)脈，不行球囊損傷。術(shù)后給予兔子耳緣靜脈注射普通肝素100 U/kg抗凝，肌肉注射青霉素8×105U/d，連續(xù)3 d預(yù)防感染。術(shù)后立即按照分組腹腔注射給藥(PN溶解于4% DMSO)，每天1次，共4周。

3.2標(biāo)本采集繼續(xù)高脂喂養(yǎng)4周后，取出標(biāo)本。家兔麻醉后固定，鈍性分離血管鞘，股靜脈采血，然后空氣栓塞處死，取出建模后髂血管(約4 cm)，生理鹽水沖洗，分成2段，1段立即放入-80 ℃冰箱儲存，另1段用4%多聚甲醛固定。采集血液靜置1.5 h后3 000 r/min離心15 min，取出血清置-80 ℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

3.3HE及免疫組織化學(xué)(immunohistochemistry,IHC)法染色固定后的髂血管行石蠟包埋切片(4 μm)，HE染色用于觀察髂血管的組織學(xué)特點(diǎn)并測量血管內(nèi)-中膜厚度。根據(jù)試劑盒說明書對caspase-1(1∶100)和IL-1β(1∶100)進(jìn)行IHC染色，細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性細(xì)胞。用Image Pro Plus 6.0軟件測量血管內(nèi)-中膜厚度以及各組caspase-1、IL-1β的表達(dá)(取5個(gè)400倍視野陽性細(xì)胞數(shù)的平均值作為上述指標(biāo)的相對表達(dá)量)。

3.4Western blot檢測caspase-1和IL-1β的水平提取各組髂血管標(biāo)本中總蛋白后，上樣80 μg蛋白量用于電泳和膜轉(zhuǎn)移，PVDF膜用5%脫脂奶粉封閉1 h，Ⅰ抗caspase-1 p20 (1∶200)、IL-1β (1∶200) 和β-actin(1∶200) 孵育4 ℃過夜。次日山羊抗兔多抗(1∶500)37 ℃孵育1 h，ECL發(fā)光液暗室曝光。以β-actin作為內(nèi)參照，Quantity One 軟件采集分析結(jié)果，以目的蛋白灰度值與β-actin灰度值的比值作為其相對表達(dá)量。

3.5ELISA檢測IL-8的含量取血清約200 μL，根據(jù)兔IL-8試劑盒說明書進(jìn)行檢測。

3.6血清總膽固醇(total cholesterol,TC)、甘油三酯(triglyceride,TG)、低密度脂蛋白(low-density lipoprotein,LDL)和高密度脂蛋白(high-density lipoprotein，HDL)測定取血清500 μL置于Olympus AUI1000自動(dòng)生化分析儀檢測各組血脂水平。

4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。多組之間的比較采用單因素方差分析，各組均數(shù)之間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)，若方差不齊則采用Dunnett’s T3檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1家兔存活情況及PN對新生內(nèi)膜增殖影響

建模后30只新西蘭兔均存活并最終納入實(shí)驗(yàn)。在前期的準(zhǔn)備工作中，為了排除溶劑DMSO的影響，分別設(shè)置了相關(guān)溶劑對照組，結(jié)果顯示本實(shí)驗(yàn)中所采用的4% DMSO對內(nèi)-中膜厚度無明顯影響。HE結(jié)果顯示sham+NS及sham+DMSO組無內(nèi)膜增殖，內(nèi)膜光滑連續(xù)，中膜平滑肌細(xì)胞排列整齊；而BI+NS及BI+DMSO組內(nèi)膜增殖明顯，中膜平滑肌細(xì)胞排列紊亂；PN低、高劑量組內(nèi)膜增殖有不同程度改善，但僅PN高劑量組與BI+DMSO組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖1、2。

Figure 1.The HE staining for the effect of PN on neointimal hyperplasia (×400).

圖1PN對內(nèi)-中膜增殖的作用

Figure 2.The intima-medium thickness in different groups. Mean±SD.n=5.#P<0.05vsBI+DMSO.

圖2各組內(nèi)-中膜厚度比較

2IHC結(jié)果

Sham+DMSO組中的caspase-1和IL-1β水平較低,BI+DMSO組與其比較， caspase-1和IL-1β的水平明顯增高(P<0.05)；caspase-1和IL-1β的水平在PN高劑量組中顯著下降(P<0.05)，見圖3、4。

Figure 3.The expression of caspase-1 and IL-β in different groups(IHC，×400).

圖3免疫組織化學(xué)分析caspase-1 及IL-β的表達(dá)

Figure 4.The number of positive cells in different groups. Mean±SD.n=5.#P<0.05vsBI+DMSO.

圖4各組caspase-1 及IL-β的陽性細(xì)胞數(shù)比較

3Western blot結(jié)果

與sham+DMSO組比較，BI+DMSO組中的caspase-1/pro-caspase-1和IL-1β/pro-IL-1β的比值明顯升高(P<0.05)；PN高劑量組中caspase-1/pro-caspase-1和IL-1β/pro-IL-1β的比值較BI+DMSO組顯著減少(P<0.05)，見圖5。

4血清IL-8含量

血清IL-8于球囊損傷后含量為(40.51±4.42)ng/L,較sham+DMSO組[(25.18±3.27)ng/L]明顯增加；而給予高劑量PN后，血清IL-8含量降至(29.45±1.33) ng/L(P<0.05)，低劑量PN組減少不明顯。

Figure 5.The level of caspase-1/pro-caspase-1, IL-1β/pro-IL-1β in different groups. Mean±SD.n=3.#P<0.05vsBI+DMSO.

圖5各組caspase-1和IL-1β的蛋白表達(dá)

5血脂TC、TG、LDL和HDL含量

各組血脂指標(biāo)含量組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

討論

炎癥在AS的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。VSMCs是動(dòng)脈血管壁的主要成分之一，其增殖和遷移被認(rèn)為是AS等血管增殖性疾病的重要原因。在炎癥作用下，VSMCs可向內(nèi)膜下遷移，并在此過程中分裂增殖形成新生內(nèi)膜[7]。Duewell等[8]研究表明通過NOD樣受體家族蛋白(NOD-like receptor protein，NLRP)-3炎性小體途徑可促進(jìn)AS病變形成，caspase-1是NLRP3炎性小體的重要組成部分[9]，同時(shí)NLRP3炎性小體是caspase-1活化的分子平臺，活化后的caspase-1能促進(jìn)pro-IL-1β轉(zhuǎn)化為具有活性的IL-1β[10]。IL-1β是一種重要的炎癥細(xì)胞因子，研究表明它通過多個(gè)環(huán)節(jié)參與AS發(fā)生發(fā)展：(1)通過上調(diào)黏附因子、趨化蛋白合成以及破壞凝血-抗凝平衡，導(dǎo)致血管內(nèi)凝血，減緩血流，促進(jìn)炎性細(xì)胞黏附于血管壁[11]；(2)誘導(dǎo)血小板衍化生長因子和血漿溶酶原激活物抑制劑-1的合成和釋放，進(jìn)而刺激VSMCs的有絲分裂增殖，內(nèi)皮細(xì)胞再生和細(xì)胞外基質(zhì)的沉著，促進(jìn)新生內(nèi)膜形成；(3)上調(diào)氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)及其受體的表達(dá)，ox-LDL可介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞損傷和凋亡，并促進(jìn)VSMCs的增生;(4)通過激活NF-κB信號通路，誘導(dǎo)IL-6、IL-8、TNF-α等炎癥因子產(chǎn)生，擴(kuò)大炎癥反應(yīng)級聯(lián)。其中IL-8是一種強(qiáng)有力的促血管生成因子，能促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞和VSMCs的增殖和遷移;(5)誘導(dǎo)VSMC和巨噬細(xì)胞吞噬大量的LDL并轉(zhuǎn)化成為泡沫細(xì)胞[12];(6)促進(jìn)金屬基質(zhì)蛋白的表達(dá)，使AS斑塊不穩(wěn)定甚至破裂。本實(shí)驗(yàn)對NLRP3炎性小體通路的研究主要集中于caspase-1，因?yàn)樗巧删呱锘钚訧L-1β的關(guān)鍵酶，此外，阻斷caspase-1的激活是抑制炎性小體形成的新型抗炎策略[13]。本實(shí)驗(yàn)通過高脂喂養(yǎng)聯(lián)合球囊損傷建立模型，結(jié)果顯示血管內(nèi)膜增殖明顯，caspase-1、IL-1β和IL-8表達(dá)顯著增加，推測內(nèi)膜損傷后促進(jìn)pro-caspase-1的募集及轉(zhuǎn)化為活性caspase-1增加，并上調(diào)下游促炎因子，加重炎癥反應(yīng)，從而促進(jìn)內(nèi)膜增殖。

表1　各組血脂水平比較

PN分子式為C15H20O3，屬于艾葉菊屬的提取物，具有抗腫瘤、抗血小板聚集等特性。近年研究表明PN通過烷基化caspase-1的半胱氨酸殘基來抑制其表達(dá)，從而發(fā)揮抗炎作用[14]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，給予PN 2 mg·kg-1·d-1治療后，內(nèi)膜增殖受到抑制，同時(shí)血管局部活性caspase-1表達(dá)顯著下降，下游IL-1β和IL-8含量減少，與既往研究結(jié)果一致[15]，表明PN可以通過下調(diào)caspase-1起到減輕炎癥反應(yīng)，進(jìn)而抑制內(nèi)膜增殖。

脂質(zhì)代謝異常也能通過刺激炎癥反應(yīng)加速AS的發(fā)生和發(fā)展[16]，本實(shí)驗(yàn)通過檢測血清中TC、TG、LDL和HDL水平以研究PN與脂質(zhì)代謝的關(guān)系，結(jié)果顯示各組血脂無明顯差異，說明PN對內(nèi)膜的影響與降脂作用無關(guān)。

綜上所述，PN可以通過抑制caspase-1及下游炎癥介質(zhì)的表達(dá)從而減少炎癥反應(yīng)，減少球囊損傷后的內(nèi)膜增殖。然而對于NLRP3炎性小體通路作用的研究尚處于起步階段，更明確的機(jī)制尚未闡明，因此關(guān)于PN抑制新生內(nèi)膜增殖的機(jī)制也有待更進(jìn)一步的研究。

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(責(zé)任編輯： 陳妙玲， 余小慧)

*[基金項(xiàng)目]國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. 81171178)； 山西省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. 2012011036-3)； 山西省歸國人員科研基金資助項(xiàng)目(No. 2013011054-2)

Effect of parthenolide on neointimal hyperplasia after balloon injuryMAO Xia, GAO Li-hua, DENG Chang-ming

(DepartmentofCardiology,TheSecondAffiliatedHospitalofChongqingMedicalUniversity,Chongqing400010,China.E-mail:dy070308@126.com)

[ABSTRACT]AIM: To detect the effect and underlying mechanism of parthenolide (PN) on neointimal hyperplasia. METHODS: After 1 week of high-fat feeding, 30 male New Zealand white rabbits (2.0～2.3 kg) were randomly divided into 6 groups: sham+NS, rabbits received 0.9% normal saline after sham operation; sham+DMSO, rabbits received DMSO after sham operation; balloon injury(BI)+NS, rabbits received NS after balloon injury; BI+DMSO, rabbits received DMSO after balloon injury; BI+PN low, rabbits received PN at 1 mg/kg after balloon injury; BI+PN high, rabbits received PN at 2 mg/kg after balloon injury. The drugs were intraperitoneal injected once a day after the operation until sacrifice. After fed with high-fat diet for 4 weeks, the intima-media thickness, the expression of caspase-1, IL-1β, the levels of IL-8, TC, TG, LDL and HDL in the serum were measured. RESULTS: Compared with sham+DMSO group, the thickness of intima, the amount of caspase-1, IL-1β and IL-8 in BI+DMSO group were significantly increased (P<0.05). The levels of caspase-1, IL-1β and IL-8 were significantly decreased in BI+PN high group compared with BI+DMSO group (P<0.05). CONCLUSION: Neointimal hyperplasia is suppressed by PN after balloon injury, the potential mechanism may be associated with its anti-inflammatory role.

[KEY WORDS]Parthenolide; Intimal hyperplasia; Caspase-1

通訊作者△Tel: 0351-4135067； E-mail： xqli2013@126.com

[收稿日期]2015- 05- 28[修回日期] 2015- 09- 29

[文章編號]1000- 4718(2015)12- 2221- 07

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2015.12.017

[中圖分類號]R541.4; R363.2

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A