李嚴(yán)嚴(yán)，　徐曉燕，　張家君，　方永奇，　田　華，　焦　鵬，　?！』? ，　秦樹存△，　姚樹桐, △

(泰山醫(yī)學(xué)院 1動(dòng)脈粥樣硬化研究所，山東省高校動(dòng)脈粥樣硬化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,2藥學(xué)院, 3附屬醫(yī)院， 4基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，山東 泰安 271000)

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蜂膠醇提物通過抑制caspase-12減輕氧化低密度脂蛋白誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞凋亡*

李嚴(yán)嚴(yán)1▲，徐曉燕2▲，張家君3，方永奇4，田華1，焦鵬1，?；?, 4，秦樹存1△，姚樹桐1, 4△

(泰山醫(yī)學(xué)院1動(dòng)脈粥樣硬化研究所，山東省高校動(dòng)脈粥樣硬化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,2藥學(xué)院,3附屬醫(yī)院，4基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，山東 泰安 271000)

[摘要]目的： 研究蜂膠醇取物(ethanol extract of propolis，EEP)對(duì)氧化低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein，ox-LDL)誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞凋亡的抑制作用，并探討可能的分子機(jī)制。方法: 體外培養(yǎng)RAW264.7巨噬細(xì)胞，給予EEP(7.5、15和30 mg/L)、4-苯丁酸(4-phenylbutyric acid，PBA；5 mmol/L)或二亞苯基碘鎓(diphenyleneiodo-nium，DPI；5 μmol/L)預(yù)處理1 h，再加入ox-LDL(100 mg/L)或衣霉素(tunicamycin，TM；4 mg/L)繼續(xù)培養(yǎng)24 h。分別采用MTT法和Annexin V-FITC雙染法檢測細(xì)胞活力和凋亡情況；試劑盒測定細(xì)胞內(nèi)超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性、活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)和丙二醛(malondialdehyde，MDA)的水平。采用免疫印跡技術(shù)檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress，ERS)凋亡途徑關(guān)鍵蛋白caspase-12的表達(dá)變化。結(jié)果: 與ERS抑制劑PBA相似，EEP呈劑量依賴性減輕ox-LDL所致的巨噬細(xì)胞損傷，表現(xiàn)為細(xì)胞活力增加(P<0.01)，凋亡率降低(P<0.05)，且可抑制ERS誘導(dǎo)劑TM所引起的巨噬細(xì)胞活力下降和凋亡(P<0.05)；與氧化應(yīng)激抑制劑DPI相似，EEP可抑制ox-LDL誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激反應(yīng)，表現(xiàn)為ROS和MDA生成減少(P<0.01)，SOD活性增加(P<0.05)；EEP顯著抑制ox-LDL和TM所誘導(dǎo)的caspase-12活化(P<0.05)；與ox-LDL組比較，PBA和DPI預(yù)處理組caspase-12活性也受到明顯抑制(P<0.01)。結(jié)論: EEP可減輕 ox-LDL 所誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能與抑制氧化應(yīng)激和caspase-12活化有關(guān)。

[關(guān)鍵詞]蜂膠醇取物； 半胱天冬酶12； 氧化低密度脂蛋白； 巨噬細(xì)胞； 細(xì)胞凋亡

巨噬細(xì)胞凋亡是動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)斑塊的重要病理學(xué)特征和造成斑塊不穩(wěn)定的決定性因素，進(jìn)而導(dǎo)致急性心血管事件如急性心肌梗死和心源性猝死的發(fā)生[1]。因此，減輕巨噬細(xì)胞凋亡被認(rèn)為是增強(qiáng)AS斑塊穩(wěn)定性、降低急性血管事件發(fā)生率的有效途徑[2]。蜂膠是蜜蜂采集植物幼芽分泌物、樹脂等并混入其上鄂腺分泌物混合加工而成的一種膠狀物，因其具有抗腫瘤、抗氧化、抗炎、調(diào)節(jié)血糖和機(jī)體免疫功能等藥理作用而廣泛應(yīng)用于傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)[3]。研究表明富含黃酮類化合物的蜂膠醇取物(ethanol extract of propolis，EEP)可抑制巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)[4]。本室既往研究證實(shí)，EEP促進(jìn)膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(yùn)、抑制AS病變發(fā)展[5-6]，且新近研究表明EEP可通過抑制凝集素樣氧化低密度脂蛋白受體1(lectin-like oxidized low-density lipoprotein receptor-1，LOX-1)介導(dǎo)的氧化應(yīng)激減輕氧化低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein，ox-LDL)誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞損傷[7]。然而EEP是否可減輕ox-LDL所誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞凋亡？其機(jī)制是否通過抑制caspase-12介導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress，ERS)凋亡途徑實(shí)現(xiàn)？上述問題的解決將為深入認(rèn)識(shí)蜂膠的抗AS作用機(jī)制提供新的思路。本工作分別在ox-LDL和ERS誘導(dǎo)劑衣霉素(tunicamycin，TM)誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細(xì)胞損傷模型上研究EEP對(duì)細(xì)胞凋亡和caspase-12活化的影響，探討其對(duì)巨噬細(xì)胞的保護(hù)作用及機(jī)制。

材料和方法

1試劑

2’, 7’-二氯熒光素二乙酸酯(2’,7’-dichlorofluorescein diacetate，DCHF-DA)購自Molecular Probes；抗β-actin抗體、TM、4-苯丁酸(4-phenylbuty-ric acid，PBA)和二亞苯基碘鎓(diphenyleneiodo-nium，DPI)購自Sigma；DMEM高糖培養(yǎng)基和RIPA裂解液分別購自Gibco和Solarbio；四甲基偶氮唑藍(lán)[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide，MTT]和 Annexin V-FITC凋亡檢測試劑盒分別購自Genview和南京凱基生物科技公司；兔抗caspase-12多克隆抗體和辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG分別為Abcam和北京中杉金橋公司產(chǎn)品；增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光(enhanced chemiluminescence，ECL)試劑盒和二氟化樹脂(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜分別為Pierce和Millpore產(chǎn)品。超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)和丙二醛(malondialdehyde，MDA)測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所，其余試劑均為分析純產(chǎn)品。

2方法

2.1EEP的制備和總黃酮測定采集新鮮泰山松柏蜂膠，烘干、粉碎，按本室既往報(bào)道的方法[7]制備EEP。取100克蜂膠溶于1升95%乙醇中，40 ℃超聲處理3 h。然后將上清液用濾紙過濾，收集殘?jiān)?，?5%乙醇再提取2次。合并上清液，50 ℃條件下經(jīng)減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器蒸發(fā)。然后在烘箱中干燥，-20 ℃保存。按照國家標(biāo)準(zhǔn)分光光度比色法(GB/T 20574-2006)測定EEP總黃酮含量，結(jié)果為(213.46±2.93)mg蘆丁當(dāng)量/g。使用前將EEP溶于二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)中，并用細(xì)胞培養(yǎng)基稀釋成適當(dāng)濃度。

2.2ox-LDL的制備按照本室既往報(bào)道的方法[8]制備ox-LDL，即采用序列超速離心法分離健康人新鮮血漿LDL，并與10 μmol/L CuSO437 ℃孵育18 h。測定硫代巴比妥酸反應(yīng)物質(zhì) MDA 濃度>30 μmol/g，且瓊脂糖凝膠電泳顯示ox-LDL電泳遷移率增快，為LDL的2.0～2.5倍。

2.3細(xì)胞培養(yǎng)與實(shí)驗(yàn)分組鼠源RAW264.7巨噬細(xì)胞由中國科學(xué)院上海生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所細(xì)胞庫提供，用DMEM高糖培養(yǎng)基(含10%胎牛血清、1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素)于5% CO2培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)。隨機(jī)分為：(1)正常對(duì)照(control)組：培養(yǎng)液中常規(guī)培養(yǎng)；(2)ox-LDL組：培養(yǎng)液中加入100 mg/L ox-LDL；(3)EEP預(yù)處理組：培養(yǎng)液中先加入EEP(7.5、15和30 mg/L)預(yù)處理1 h，再加入100 mg/L ox-LDL；(4)ERS抑制劑PBA預(yù)處理組：培養(yǎng)液中先加入5 mmol/L PBA預(yù)處理1 h，再加入100 mg/L ox-LDL；(5)氧化應(yīng)激抑制劑DPI預(yù)處理組：培養(yǎng)液中先加入5 μmol/L DPI預(yù)處理1 h，再加入100 mg/L ox-LDL。另外培養(yǎng)RAW264.7巨噬細(xì)胞，先給予30 mg/L EEP預(yù)處理1 h，然后與ERS誘導(dǎo)劑TM(4 mg/L)共孵育24 h。除EEP預(yù)處理組和TM組外，其它各組均加入0.1%的DMSO，培養(yǎng) 24 h 收集細(xì)胞。

2.4MTT法檢測細(xì)胞活力將細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板，經(jīng)處理后每孔加入0.5 g/L的MTT，避光37 ℃培養(yǎng)4 h，棄培養(yǎng)基，每孔加入150 μL DMSO，置水平搖床振蕩10 min，用多功能酶標(biāo)儀(Tecan)在490 nm處測定吸光度(A)。以正常對(duì)照組細(xì)胞活力為100%，其余各組細(xì)胞活力以其A值占正常對(duì)照組A值的百分比表示。

2.5流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡用Annexin V-FITC/PI雙染色法分析細(xì)胞凋亡情況。細(xì)胞經(jīng)處理后，收集并重懸于500 μL上樣緩沖液，與5 μL Annexin V-FITC和5 μL碘化丙啶(propidium iodide，PI)室溫避光孵育15 min。細(xì)胞凋亡率由流式細(xì)胞儀(Becton-Dickinson)分析測定?？偧?xì)胞凋亡率(%)=早期凋亡率(Annexin+/PI-)+晚期凋亡率(Annexin+/PI+)。

2.6活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)水平的測定將細(xì)胞接種于96孔板，經(jīng)處理后，裝載探針，使DCHF-DA終濃度為10 μmol/L。37 ℃孵育30 min后，無血清培養(yǎng)液洗細(xì)胞3次。多功能酶標(biāo)儀檢測，激發(fā)波長為488 nm，發(fā)射波長為525 nm。以對(duì)照組ROS水平為100%，其它各組ROS水平以其熒光強(qiáng)度占對(duì)照組熒光強(qiáng)度的百分比表示。

2.7SOD活性和MDA含量的測定細(xì)胞經(jīng)處理后，收集并重懸于0.5 mL裂解緩沖液中充分裂解，1 500 r/min離心10 min，取上清液檢測SOD活性和MDA含量，分別用×103U/g protein和μmol/g protein表示，實(shí)驗(yàn)操作按照試劑盒說明書進(jìn)行。

2.8免疫印跡分析按本室既往報(bào)道的方法[9]提取細(xì)胞總蛋白，等量的各組總蛋白經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，經(jīng)封閉、洗脫后與caspase-12多克隆抗體(1∶1 000)和β-actin(1∶6 000)單克隆抗體室溫孵育4 h，洗膜后與辣根過氧化物酶標(biāo)記的相應(yīng) II 抗室溫孵育1 h?？乖?抗體復(fù)合物用ECL法顯示，應(yīng)用化學(xué)發(fā)光成像儀(上海歐翔科學(xué)儀器有限公司)進(jìn)行圖像采集。采用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件(Media Cybernetics)分析蛋白條帶積分吸光度(IA)值，以靶蛋白IA值/β-actinIA值的比值反映靶蛋白相對(duì)水平。

3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)來表示。應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差(one-way ANOVA)分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1EEP抑制ox-LDL誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞活力降低

MTT結(jié)果顯示，以100 mg/L ox-LDL處理24 h，細(xì)胞活力降低為正常對(duì)照組的55.3%(P<0.01)，而EEP則明顯減輕ox-LDL所誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性，呈劑量依賴性(P<0.01)，且其對(duì)細(xì)胞的保護(hù)作用與ERS抑制劑PBA相似，見圖1。

Figure 1.EEP inhibited ox-LDL-induced decrease in viability of RAW264.7 cells. The cells were pretreated with EEP (7.5, 15 and 30 mg/L) or PBA (5 mmol/L) for 1 h and then incubated with ox-LDL (100 mg/L) for 24 h. The cell viability was measured by MTT assay. Mean±SD.n=6.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsox-LDL group.

圖1蜂膠醇提物抑制ox-LDL所誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細(xì)胞活力降低

2EEP抑制TM誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞活力降低

ERS誘導(dǎo)劑TM明顯造成巨噬細(xì)胞損傷，其細(xì)胞活力較正常對(duì)照組降低38.3%(P<0.01)；而以30 mg/L EEP預(yù)處理后，細(xì)胞活力較TM組明顯升高(P<0.05)，見圖2。

Figure 2.EEP inhibited TM-induced decrease in viability of RAW264.7 cells. The cells were pretreated with EEP (30 mg/L) for 1 h and then treated to TM (4 mg/L) for 24 h. The cell viability was measured by MTT assay. Mean±SD.n=6.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group;#P<0.05vsTM group.

圖2蜂膠醇提物抑制TM所誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細(xì)胞活力降低

3EEP抑制ox-LDL誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞凋亡

以100 mg/L ox-LDL處理24 h，細(xì)胞凋亡率是正常對(duì)照組的3.37倍(P<0.01)，而EEP則明顯減輕ox-LDL所誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，以30 mg/L EEP預(yù)處理組最為明顯(P<0.05)，且其對(duì)細(xì)胞凋亡的抑制作用與ERS抑制劑PBA相似，見圖3。

4EEP抑制TM誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞凋亡

與正常對(duì)照組比較，ERS誘導(dǎo)劑TM處理組細(xì)胞凋亡率顯著增加(P<0.01)；而以30 mg/L EEP預(yù)處理后，細(xì)胞凋亡率較TM組明顯降低(P<0.05)，見圖4。

5EEP抑制ox-LDL誘導(dǎo)的caspase-12活化

采用可同時(shí)識(shí)別caspase-12 酶原(procaspase-12)和剪切活化形式caspase-12(cleavedcaspase-12)的特異性抗體，進(jìn)行免疫印跡檢測，以經(jīng)β-actin校準(zhǔn)后的cleaved caspase-12條帶IA值表示caspase-12活化的相對(duì)水平。結(jié)果顯示ox-LDL處理組cleaved caspase-12水平較正常對(duì)照組顯著增加(P<0.01)；而EEP則明顯減輕ox-LDL所誘導(dǎo)的caspase-12活化(P<0.05)，且其作用與ERS抑制劑PBA和氧化應(yīng)激抑制劑DPI相似，見圖5。

Figure 3.EEP inhibited ox-LDL-induced apoptosis of RAW264.7 cells. The cells were treated as described in Figure 1. Cell apoptosis was detected by flow cytometry and the total apoptotic cells (early and late-stage apoptosis) were represented by the right side of the panel (Annexin V staining alone or together with PI). Mean±SD.n=4.**P<0.01vscontrol group;#P<0.05vsox-LDL group.

圖3蜂膠醇提物抑制ox-LDL所誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細(xì)胞凋亡

Figure 4.EEP inhibited TM-induced apoptosis of RAW264.7 cells. The cells were treated as described in Figure 2, and the cell apoptosis was detected by flow cytometry. Mean±SD.n=4.**P<0.01vscontrol group;#P<0.05vsTM group.

圖4蜂膠醇提物抑制TM所誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細(xì)胞凋亡

Figure 5.EEP inhibited ox-LDL-induced activation of caspase-12. The RAW264.7 cells were pretreated with EEP (7.5, 15 and 30 mg/L), PBA (5 mmol/L)or DPI (5 μmol/L) for 1 h and then incubated with ox-LDL (100 mg/L) for 24 h. The protein levels of caspase-12 were examined by Western blot analysis. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsox-LDL group.

圖5蜂膠醇提物抑制ox-LDL所誘導(dǎo)的caspase-12活化

6EEP抑制TM誘導(dǎo)的caspase-12活化

TM處理組cleaved caspase-12水平較正常對(duì)照組顯著增加(P<0.01)；而以30 mg/L EEP預(yù)處理后，則明顯抑制TM所誘導(dǎo)的caspase-12活化(P<0.05)，見圖6。

Figure 6.EEP inhibited TM-induced activation of caspase-12. The RAW264.7 cells were treated as described in Figure 2, and the protein levels of caspase-12 were examined by Western blot analysis. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group;#P<0.05vsTM group.

圖6蜂膠醇提物抑制TM所誘導(dǎo)的caspase-12活化

7EEP抑制ox-LDL誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激反應(yīng)

如表1所示，與正常對(duì)照組比較，ox-LDL處理組ROS和MDA水平顯著增加(P<0.01)，SOD活性顯著降低(P<0.01)；而與氧化應(yīng)激抑制劑DPI相似，以30 mg/L EEP預(yù)處理則顯著抑制ox-LDL所誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激反應(yīng)，表現(xiàn)為ROS和MDA生成減少(P<0.01)，SOD活性增加(P<0.05)。

表1　蜂膠醇提物對(duì)ox-LDL所致氧化應(yīng)激反應(yīng)的影響

*P<0.05,**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsox-LDL group.

討論

AS是一個(gè)復(fù)雜的多細(xì)胞參與的慢性炎癥性病理過程，其中巨噬細(xì)胞與AS進(jìn)展尤其與晚期粥樣斑塊的破裂密切相關(guān)。巨噬細(xì)胞凋亡不僅直接導(dǎo)致凋亡的平滑肌細(xì)胞和巨噬細(xì)胞不能被有效吞噬，促進(jìn)脂質(zhì)核心的形成及增大，而且富含游離膽固醇的凋亡巨噬細(xì)胞通過釋放基質(zhì)降解蛋白酶損傷纖維帽，并產(chǎn)生白細(xì)胞介素1β(interleukin-1β,IL-1β)、腫瘤壞死因子α等炎癥因子，引起繼發(fā)性炎癥反應(yīng)和壞死，從而促進(jìn)斑塊不穩(wěn)定[1]。研究表明，EEP可抑制脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)所誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞中一氧化氮(nitric oxide，NO)、IL-1β和IL-6等炎癥因子的生成與釋放[4, 10]，并可減輕ox-LDL誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞損傷[7]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，給予ox-LDL處理RAW264.7巨噬細(xì)胞24 h，細(xì)胞活力降低，凋亡率顯著增加，而EEP則明顯減輕ox-LDL所引起的巨噬細(xì)胞損傷，表現(xiàn)為細(xì)胞活力增加，凋亡率降低，且呈濃度依賴性，表明EEP對(duì)ox-LDL所誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用。

目前已知細(xì)胞凋亡調(diào)控機(jī)制除死亡受體途徑和線粒體途徑外，越來越多證據(jù)表明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)也是損傷感知或凋亡信號(hào)整合的主要位點(diǎn)，因而提出了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)凋亡途徑。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是調(diào)控細(xì)胞內(nèi)蛋白合成、折疊和鈣穩(wěn)態(tài)的重要細(xì)胞器，其對(duì)環(huán)境變化十分敏感，氧化應(yīng)激、鈣穩(wěn)態(tài)失衡、膽固醇超負(fù)荷等理化改變均可導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能紊亂，出現(xiàn)以未折疊/錯(cuò)誤折疊蛋白聚集和鈣穩(wěn)態(tài)失衡為主要特征的ERS反應(yīng)。一定程度ERS通過暫時(shí)性抑制蛋白合成、激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)蛋白降解途徑和上調(diào)糖調(diào)節(jié)蛋白78(glucose-regulated proteins 78，GRP78)、GRP94等分子伴侶調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能，維持細(xì)胞生存。但是過強(qiáng)或長時(shí)間ERS則可觸發(fā)細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致不可逆損傷，其中caspase-12是介導(dǎo)ERS相關(guān)凋亡途徑的重要分子之一[11]。在靜息狀態(tài)下，caspase-12以酶原形式存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜胞漿側(cè)，而在ERS時(shí)被特異激活，通過激活caspase-9和caspase-3而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[12]。來自人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的研究表明，ox-LDL通過激活caspase-12誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[13]。我們前期工作證實(shí)ERS-C/EBP同源蛋白(C/EBP homologous protein，CHOP)信號(hào)途徑介導(dǎo)ox-LDL誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞凋亡，而載脂蛋白A1模擬肽D4F可通過抑制該信號(hào)途徑減輕ox-LDL對(duì)巨噬細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用[8, 14]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，EEP對(duì)ox-LDL所誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞損傷的保護(hù)作用與ERS抑制劑PBA相似，而且可減輕ERS誘導(dǎo)劑TM所誘導(dǎo)的細(xì)胞活力降低和凋亡率增加。另外，與PBA相似，EEP不僅可抑制ox-LDL所誘導(dǎo)的caspase-12活化而且可減輕TM所誘導(dǎo)的caspase-12活化，表明EEP可通過抑制caspase-12活化減輕ox-LDL所誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞凋亡。

氧化應(yīng)激是引起ERS反應(yīng)的重要因素之一[15]。研究表明ox-LDL主要氧化脂質(zhì)成分7-酮膽甾醇(7-ketocholesterol，7-KC)可通過氧化應(yīng)激觸發(fā)人動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞ERS的發(fā)生[16]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，氧化應(yīng)激抑制劑DPI可抑制ox-LDL所誘導(dǎo)的caspase-12活化，進(jìn)一步證實(shí)ox-LDL通過氧化應(yīng)激反應(yīng)激活caspase-12介導(dǎo)的ERS凋亡信號(hào)途徑。我們既往研究證實(shí)，EEP可通過抑制LOX-1介導(dǎo)的氧化應(yīng)激減輕ox-LDL誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞損傷[7]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與DPI相似，EEP可抑制ox-LDL所誘導(dǎo)的ROS和MDA生成，上調(diào)SOD活性，提示EEP對(duì)caspase-12介導(dǎo)的ERS凋亡途徑的抑制作用與減輕氧化應(yīng)激有關(guān)。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)EEP可減輕 ox-LDL 所誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能與抑制氧化應(yīng)激和caspase-12活化有關(guān)。

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(責(zé)任編輯： 盧萍， 羅森)

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《中國病理生理雜志》編輯部

2015年12月15日

*[基金項(xiàng)目]國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. 81260025； No. 30800467)

Ethanol extract of propolis protects macrophages from oxidized low-density lipoprotein-induced apoptosis by inhibiting caspase-12LI Yan-yan1, XU Xiao-yan2, ZHANG Jia-jun3, FANG Yong-qi4, TIAN Hua1, JIAO Peng1, SANG Hui1, 4, QIN Shu-cun1, YAO Shu-tong1, 4

(1InstituteofAtherosclerosis,KeyLaboratoryofAtherosclerosisinUniversitiesofShandong,2CollegeofPharmacy,3AffiliatedHospital,4CollegeofBasicMedicalSciences,TaishanMedicalUniversity,Taian271000,China.E-mail:shucunqin@hotmail.com;yst228@126.com)

[ABSTRACT]AIM: To investigate the inhibitory effect of ethanol extract of propolis (EEP) on oxidized low-density lipoprotein (ox-LDL)-induced macrophage apoptosis and the underlying molecular mechanisms. METHODS: RAW264.7 macrophages were pretreated with EEP (7.5, 15 and 30 mg/L), 4-phenylbutyric acid (PBA, 5 mmol/L) or diphenyleneiodonium (DPI, 5 μmol/L) for 1 h and then treated with ox-LDL (100 mg/L) or tunicamycin (TM, 4 mg/L) for 24 h. The cell viability and apoptosis were determined by MTT assay and Annexin V-FITC apoptosis detection kit, respectively. The activity of superoxide dismutase (SOD), and the levels of reactive oxygen species (ROS) and malondialdehyde (MDA) in the cells were measured. The protein levels of caspase-12, a proapoptotic molecule under endoplasmic reticulum stress (ERS), were examined by Western blot analysis. RESULTS: Like PBA (an ERS inhibitor), EEP protected RAW264.7 macrophages from ox-LDL-induced injury in a dose-dependent manner, as assessed by the increased cell viability and the decreased apoptotic rate. The decrease in cell viability and increase in apoptotic rate induced by TM, an ERS inducer, were also attenuated by EEP. Moreover, EEP suppressed ox-LDL-induced oxidative stress as revealed by the decreased generation of ROS and MDA as well as elevated SOD activity, which were similar to DPI, an oxidative stress inhibitor. Furthermore, EEP significantly suppressed ox-LDL- or TM-induced activation of caspase-12. Similar results were observed in the cells pretreated with PBA or DPI and then treated with ox-LDL. CONCLUSION: EEP may protect RAW264.7 macrophages from ox-LDL-induced apoptosis and the mechanism is at least partially involved in the ability of EEP to suppress oxidative stress and subsequent activation of caspase-12.

[KEY WORDS]Ethanol extract of propolis; Caspase-12; Oxidized low-density lipoprotein; Macrophages; Apoptosis

通訊作者△Tel: 0791-86300545; E-mail: wuyanqing01@sina.com.cn

[收稿日期]2015- 03- 18[修回日期] 2015- 10- 27

[文章編號(hào)]1000- 4718(2015)12- 2209- 07

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2015.12.015

[中圖分類號(hào)]R285.5； R363.2

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A