惠　雙

(南陽市中心醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，河南 南陽 473009)

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黃岑苷對宮頸癌細胞株HeLa的放射增敏作用*

惠雙△

(南陽市中心醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，河南 南陽 473009)

[摘要]目的： 探討黃岑苷對宮頸癌細胞株HeLa的放射增敏作用及機制。方法： MTT法檢測不同濃度黃岑苷對HeLa細胞的活力抑制能力，并計算IC50篩選實驗藥物濃度；克隆形成實驗檢測放射組與聯(lián)合組在不同照射劑量下細胞的放射增敏作用；流式細胞術(shù)檢測單藥組、放射組與聯(lián)合組的細胞周期變化；Western blot檢測不同組細胞中Akt、p-Akt、Bad和p-Bad的蛋白水平。結(jié)果： 黃岑苷呈濃度依賴性抑制HeLa細胞的活力，IC50為43.65 mg/L，采用20% IC50濃度8 mg/L進行放射增敏實驗。克隆形成實驗結(jié)果顯示8 mg/L黃岑苷聯(lián)合放射治療可使生存曲線左移，D0、Dq值顯著小于放射組(P<0.05)。流式細胞儀檢測結(jié)果顯示黃岑苷阻滯HeLa細胞于G2/M期。聯(lián)合組細胞中p-Akt和p-Bad的蛋白水平均顯著高于其它各組(P<0.05)。結(jié)論： 黃岑苷對HeLa細胞具有放射增敏作用，其機制可能與其阻滯細胞于G2/M期和活化PI3K/Akt信號通路有關(guān)。

[關(guān)鍵詞]黃岑苷; HeLa細胞; 放射增敏; PI3K/Akt信號通路

宮頸癌是由正常宮頸上皮內(nèi)瘤變，進而逐漸發(fā)展為浸潤性宮頸癌，其發(fā)生是一個多因素、多步驟的過程[1]。宮頸癌在全球發(fā)病率居于女性惡性腫瘤中第2位，僅次于乳腺癌，大多數(shù)患者來自發(fā)展中國家[2]。治療早期以手術(shù)為主，處于中晚期的患者常以同步放化療為主[3]。臨床上局部腫瘤過大或術(shù)后發(fā)現(xiàn)具有高危因素的患者優(yōu)先的方案是進行放射治療。由于宮頸癌細胞對中低劑量的放射性治療的敏感性較低，因此，要獲得良好的治療效果需要提高宮頸癌細胞對放射的敏感性[4]。近年來中藥的放射增敏作用日益受到關(guān)注，已有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)某些中藥單體，如青蒿琥酯、三氧化二砷、銀杏葉多糖等，對宮頸癌細胞具有放射增敏作用[5]。本實驗探究黃岑苷對宮頸癌細胞株HeLa的放射增敏作用，并對其相關(guān)機制進行初步研究。

材料和方法

1材料

黃岑苷(baicalin)純度95.0%，購自Sigma；宮頸癌HeLa細胞株購自北京裕恒豐科技有限公司；RPMI-1640和胎牛血清購自Gibco；Akt和p-Akt抗體購于CST；Bad、p-Bad和β-actin抗體購于Santa Cruz；細胞周期試劑盒由上海碧云天生物科技有限公司提供；其它試劑均為國產(chǎn)分析純。

2實驗方法

2.1細胞培養(yǎng)與照射方法將HeLa細胞置于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，每天換液1次。收集對數(shù)生長期的細胞，用0.25%胰酶消化，調(diào)整細胞密度為5×109/L，加入至96孔板中。將培養(yǎng)板置于照射野(20 cm×20 cm)內(nèi)，距射野邊緣為2 cm，用直線加速器6MV-X線照射，源皮距(SSD)為100 cm，劑量率為300 cGy/min。

2.2MTT法檢測不同濃度黃岑苷對HeLa細胞的生長抑制率調(diào)整細胞濃度為1×108/L，接種于96孔板中，置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細胞貼壁后，分別加入黃岑苷，用培養(yǎng)基調(diào)節(jié)使終濃度分別為5、10、20、40和80 mg/L，設(shè)置調(diào)零孔和細胞對照組。培養(yǎng)24 h后，每孔加入5 mg/L MTT溶液20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后終止培養(yǎng)，吸去培養(yǎng)液，每孔加入150 μL二甲基亞砜，于570 nm波長處，用酶聯(lián)免疫檢測各孔吸光度值，通過細胞活力的變化計算生長抑制率。實驗重復(fù)3次。

2.3克隆形成實驗檢測黃岑苷對HeLa細胞放射敏感性的影響實驗分為2組，放射組(RA組)僅給予照射處理；聯(lián)合組(baicalin+RA組)給予8 mg/L黃芩苷和照射處理。照射劑量為0、2、4、6、8 Gy，收集處于對數(shù)生長期的HeLa細胞，制成單細胞懸液，并進行稀釋：0 Gy組，每孔250個細胞;2 Gy組，每孔500個細胞;4 Gy組，每孔1 000個細胞；6 Gy組，每孔2 000個細胞;8 Gy組，每孔4 000個細胞；聯(lián)合組在照射前先給予黃岑苷培養(yǎng)24 h后，再與放射組一起接受X射線照射，24 h后更換10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)14 d。PBS液洗滌，用甲醛固定，吉姆薩液染色，自然晾干后克隆計數(shù)。依據(jù)多靶單擊型模型公式SF=1-(1-e-D/D0)N擬合細胞存活曲線，其中SF為細胞存活分數(shù)，D為放射劑量(Gy)，D0代表平均致死劑量，Dq代表準域劑量，N為外推數(shù)，lnN=Dq/D0。并計算黃岑苷的放射增敏比(SER)，SER=D0放射/D0放射+藥物。

2.4流式細胞術(shù)檢測細胞周期收集對數(shù)生長期細胞，調(diào)節(jié)細胞密度為5×108/L，實驗分為4組：空白對照(control,CON)組僅加入培養(yǎng)基；baicalin組僅給予8 mg/L黃芩苷培養(yǎng)24 h；RA組僅給予6 Gy X射線照射24 h；baicalin+RA組給予8 mg/L黃芩苷培養(yǎng)24 h后，再給予6 Gy X射線照射24 h。各組干預(yù)完成后，消化、離心、收集細胞、PBS重懸、加入70%預(yù)冷無水乙醇，4 ℃過夜；離心棄去上清液，加入碘化丙啶(propidium iodide，PI) 5 μL，混勻，避光室溫反應(yīng)30 min，流式細胞儀檢測細胞周期各時期的細胞數(shù)百分比。

2.5Western blot檢測相關(guān)蛋白實驗分組同細胞周期檢測。收集經(jīng)相應(yīng)處理的各組細胞，按試劑盒說明書提取總蛋白并測定蛋白濃度，進行SDS-PAGE分離蛋白，濕轉(zhuǎn)將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜，在含5%脫脂牛奶的PBST緩沖液內(nèi)封閉1 h，加入 I 抗[Akt(1∶400)、p-Akt (1∶200)、Bad (1∶400)、p-Bad (1∶200)]4 ℃過夜，洗膜后加入相應(yīng) II 抗(1∶5 000)，室溫孵育1 h，洗膜，化學(xué)發(fā)光法顯色，沖洗顯色，凝膠成像系統(tǒng)掃描分析蛋白條帶。

3統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 15.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。各組數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，均數(shù)間比較采用單因素方差分析，兩兩組間采用Bonferroni校正的t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

1黃岑苷對HeLa細胞生長抑制率的影響

為了確定黃岑苷聯(lián)合X射線處理細胞時的濃度，我們先采用MTT實驗檢測黃岑苷對HeLa細胞生長抑制率的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同濃度的黃岑苷，均能使HeLa的細胞生長抑制率增加，且其作用具有明顯的濃度依賴性。與0 mg/L組相比，實驗中采用的不同濃度黃岑苷均能抑制HeLa細胞生長(P<0.05)。如圖1所示，計算得到IC50為43.65 mg/L，在放射生物學(xué)中常以IC50的20%濃度進行放射增敏研究，因此，在后續(xù)克隆形成實驗中采用的濃度為8 mg/L。

Figure 1.The effects of baicalin on the HeLa cells viability. Mean±SD.n=3.*P<0.05vs0 mg/L group.

圖1黃芩苷對HeLa細胞生長抑制率的影響

2細胞克隆形成實驗檢測黃岑苷對HeLa細胞的放射增敏作用

依據(jù)接種細胞數(shù)和細胞克隆數(shù)計算存活分數(shù)，利用多靶單擊模型擬合細胞存活曲線，如圖2所示，聯(lián)合組的生存曲線相對于放射組左移，且聯(lián)合組在各照射劑量下的存活分數(shù)均低于放射組。放射生物學(xué)參數(shù)結(jié)果見表1。

3流式細胞術(shù)檢測HeLa細胞周期

Baicalin組和RA組中G2/M期的細胞數(shù)所占百分數(shù)顯著高于空白對照組(P<0.05)，其中RA組高于baicalin組。而baicalin+RA組中G2/M期的細胞數(shù)所占百分數(shù)顯著高于RA組(P<0.05)，具體各組細胞周期比例見圖3、表2。

Figure 2.The effects of baicalin on the survival curve of HeLa cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsRA group.

圖2黃岑苷對照射后HeLa細胞存活曲線的影響

表1　黃岑苷對HeLa細胞的放射生物學(xué)參數(shù)的影響

*P<0.05vsRA group.

Figure 3.The cell cycle distribution in the HeLa cells after corresponding treatments.

圖3不同處理組宮頸癌細胞株HeLa細胞在各細胞周期中的分布

表2各組HeLa細胞各周期細胞數(shù)分布

Table 2.Cell cycle distribution in HeLa cells (%. Mean±SD.n=3)

GroupG0/G1G2/MSCON69.15±1.157.53±0.5823.32±1.32Baicalin53.25±1.43*12.47±1.02*34.28±1.23*RA55.31±1.05*15.43±0.85*29.26±0.69*Baicalin+RA52.38±0.96*#39.52±1.41*#8.10±0.42*#

*P<0.05vsCON;#P<0.05vsbaicalin+RA.

4Western blot檢測Akt、p-Akt、Bad和p-Bad的蛋白水平

各組細胞中Akt和Bad蛋白表達無顯著變化；RA組和baicalin組中p-Akt和p-Bad蛋白水平顯著高于CON組，而baicalin+RA組細胞中p-Akt和p-Bad的蛋白水平顯著高于RA組(P<0.05)，見圖4。

討論

黃岑苷是提取自中藥黃岑的主要有效成分之一，在中醫(yī)理論中被認為具有清熱抗炎的作用。近年來許多研究表明黃岑苷具有抗炎、抗氧化、抗病毒、抗腫瘤等作用[6-7]，但尚未有研究表明黃岑苷對腫瘤的放射具有增敏作用。因此，本實驗將對黃岑苷對宮頸癌細胞的增敏作用進行了初步的研究。

Figure 4.The protein levels of p-Akt and p-Bad in different groups. Meran±SD.n=3.*P<0.05vsCON;#P<0.05vsbaicalin+RA.

圖4不同處理組宮頸癌細胞株HeLa細胞中p-Akt和p-Bad的蛋白表達水平

宮曉梅等[8]采用多靶單擊模型發(fā)現(xiàn)青蒿素對HeLa細胞具有放射增敏的作用。陳玩珊等[9]也發(fā)現(xiàn)大黃酰纈氨酸體外能明顯增加HeLa細胞的放射增敏性。但尚未有文獻報道黃岑苷對HeLa細胞的放射增敏作用。我們研究發(fā)現(xiàn)黃岑苷呈濃度依賴性抑制HeLa細胞的增殖，由于理想的放射增敏劑本身對腫瘤組織作用不強且較小劑量即有放射增敏的作用，因此選用半數(shù)致死量的20%，即接近無毒濃度進行放射增敏研究，結(jié)合實驗的可操作性要求，我們選用8 mg/L作為下一步實驗的藥物增敏濃度。通過多靶單擊模型繪制放射存活曲線可見，在各個照射劑量下，聯(lián)合組的生存分數(shù)均低于RA組，提示黃岑苷可增強X射線對HeLa細胞的殺傷作用；再者，相對于RA組而言，聯(lián)合組的曲線左移，Dq值減小，肩區(qū)減少，提示黃岑苷可使HeLa細胞的亞致死性損傷修復(fù)能力減弱；經(jīng)黃岑苷作用后，HeLa細胞對X射線的敏感性增加。通過計算得出SER為1.55，進一步表明黃岑苷對HeLa細胞具有放射增敏作用。

放射生物學(xué)研究表明，放射性治療能夠?qū)е履[瘤細胞中DNA鏈的斷鏈和改變細胞周期進程，且細胞在不同周期對放射線的敏感性不同。研究表明細胞在G2/M期對放射線敏感性最強，S后期抵抗放射損傷能力最強[10]。因此可以通過化療藥物有目的地改變細胞周期。我們研究發(fā)現(xiàn)，RA組中S后期細胞有所增加，可能與其抵抗放射損傷及代償性有關(guān)，但放射治療確實能使HeLa細胞主要阻滯于G2/M期，總體上表現(xiàn)出其抑制增殖的作用。Baicalin+RA組細胞中G2/M期的細胞數(shù)所占百分比顯著高于baicalin組和RA組，表明黃岑苷聯(lián)合X射線照射可進一步加強射線對G2/M的阻滯作用。MTT實驗與克隆形成實驗的結(jié)果聯(lián)合說明黃岑苷可抑制HeLa細胞的增殖。為臨床上采用黃岑苷聯(lián)合放射療法對宮頸癌的治療提供了實驗依據(jù)。

PI3K/Akt信號通路在細胞的增殖、衰老和凋亡等活動中起重要作用[11]，射線、輻射和細胞毒性的藥物均可激活PI3K/Akt信號通路，使得腫瘤細胞產(chǎn)生應(yīng)激調(diào)節(jié)。Akt處于PI3K/Akt信號通路的核心位置，通過激活下游底物，從而抑制細胞凋亡，調(diào)控細胞周期以及促進血管形成[12]。Akt激活后可使Bad磷酸化，從而與Bcl-2或Bcl-xL解聚，與抗凋亡結(jié)合蛋白結(jié)合，發(fā)揮促進細胞凋亡的功能[13]。我們發(fā)現(xiàn)baicalin+RA組細胞中的p-Akt 和p-Bad與RA組相比，其磷酸化水平均有進一步的增加，提示黃岑苷增強HeLa細胞的放射增敏作用與PI3K/Akt信號通路有關(guān)，具體的機制還需進一步實驗證實。

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(責(zé)任編輯： 林白霜， 余小慧)

*[基金項目]廣東省科技計劃(No．2012B031800063)；廣東省衛(wèi)生廳基金資助項目(No. B2012111)

Radiosensitizing effect of baicalin on human cervical carcinoma HeLa cellsHUI Shuang

(DepartmentofOncology,NanyangCityCenterHospital,Nanyang473009,China.E-mail:huishuang1976@163.com)

[ABSTRACT]AIM: To investigate the effect of baicalin on the radiosensitization of HeLa cells. METHODS: The cell activity was determined by MTT assay. The radiosensitivity of HeLa cells was detected by colony formation assay. The cell cycle was analyzed by flow cytometry. The protein levels of Akt, p-Akt, Bad and p-Bad were examined by Western blot. RESULTS: The cell growth of the HeLa cells was inhibited by baicalin dose-dependently and IC50was 43.65 mg/L. The results of colony formation assay showed that combination of 8 mg/L baicalin and radiotherapy further improved survival curve and decreased the value of D0 and Dq, as compared with radiotherapy alone (P<0.05). Furthermore, baicalin enhanced the effect of radiotherapy on cell cycle, as evidenced by the increase in cell percentage in G2/M phase (P<0.05). Additionally, after incubation with baicalin, radiotherapy-induced phosphorylation of Akt and Bad were further augmented (P<0.05). CONCLUSION: Baicalin augments radiosensitivity of HeLa cells through the inhibition of cell cycle transition and activation of PI3K/Akt signaling pathway.

[KEY WORDS]Baicalin; HeLa cells; Radiosensitization; PI3K/Akt signaling pathway

通訊作者△Tel: 020-85252230； E-mail： songwangcai@yahoo.com

[收稿日期]2015- 03- 25[修回日期] 2015- 09- 10

[文章編號]1000- 4718(2015)12- 2130- 06

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2015.12.003

[中圖分類號]R737.33; R730.23

[文獻標志碼]A