鄒麗莉，　葉　東，　呂瑞玲，　汪　源，　孫曉雪，　朱林燕，　陳麗新△，　王立偉△

(暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院 1生理學(xué)系， 2藥理學(xué)系，廣東 廣州 510632； 3廣東藥學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院，廣東 廣州 510006)

?

敲低IK1鉀通道抑制ClC-3氯通道的表達(dá)和功能*

鄒麗莉1▲，葉東3▲，呂瑞玲1，汪源2，孫曉雪2，朱林燕2，陳麗新2△，王立偉1△

(暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院1生理學(xué)系，2藥理學(xué)系，廣東 廣州 510632；3廣東藥學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院，廣東 廣州 510006)

[摘要]目的： 探討ClC-3氯通道是否為IK1鉀通道的調(diào)節(jié)靶點(diǎn)，重點(diǎn)研究鼻咽癌細(xì)胞IK1鉀通道對(duì)ClC-3氯通道功能及蛋白表達(dá)的影響。方法: 采用siRNA轉(zhuǎn)染技術(shù)抑制低分化鼻咽癌上皮細(xì)胞(CNE-2Z)IK1基因的表達(dá)；real-time PCR技術(shù)檢測ClC-3 mRNA的表達(dá)；Western blot檢測ClC-3的蛋白表達(dá)；細(xì)胞免疫熒光結(jié)合激光共聚焦顯微鏡技術(shù)檢測ClC-3和IK1蛋白在細(xì)胞內(nèi)分布；全細(xì)胞膜片鉗記錄細(xì)胞氯電流。結(jié)果: IK1 siRNA可以成功轉(zhuǎn)染CNE-2Z細(xì)胞，有效抑制鼻咽癌細(xì)胞IK1鉀離子通道的表達(dá)；用IK1 siRNA抑制鼻咽癌細(xì)胞IK1鉀離子通道的表達(dá)后， ClC-3的mRNA表達(dá)上調(diào)而ClC-3蛋白卻表達(dá)減少：在低分化鼻咽癌上皮細(xì)胞，低滲刺激可激活氯通道，產(chǎn)生一個(gè)較大的氯電流，在成功轉(zhuǎn)染IK1 siRNA的細(xì)胞，此氯電流明顯減弱。結(jié)論: 敲低IK1鉀離子通道可抑制ClC-3氯離子通道的表達(dá)和功能。

[關(guān)鍵詞]ClC-3氯通道； IK1鉀通道； 鼻咽癌; 膜片鉗技術(shù)

細(xì)胞生長、分化和凋亡失去調(diào)控等多種因素都可能導(dǎo)致細(xì)胞生長發(fā)展失去既定的程序和缺乏分化而異常增生，最終導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。相對(duì)正常細(xì)胞而言，腫瘤細(xì)胞生長旺盛并且與人體正常的機(jī)能代謝不協(xié)調(diào)，并可遷移以及進(jìn)一步侵犯正常組織和器官。腫瘤細(xì)胞往往處于一種增殖迅速、低分化程度的狀態(tài)。細(xì)胞周期調(diào)控在細(xì)胞增殖、分化、凋亡和癌變等生理病理過程起基礎(chǔ)作用，腫瘤的發(fā)生發(fā)展中的關(guān)鍵問題之一就是細(xì)胞周期失去調(diào)控。

細(xì)胞周期的調(diào)控是一個(gè)異常復(fù)雜而精密的過程。我們前期的研究表明，用氯通道阻斷劑能降低細(xì)胞的增殖，使處于G0/G1期的細(xì)胞百分比增加。此外，氯通道還參與細(xì)胞分化、凋亡和遷移等[1-2]， ClC-3氯離子通道蛋白被認(rèn)為是容積敏感性氯通道候選蛋白之一[3-7]，參與細(xì)胞的多種生理活動(dòng)。有研究表明ClC-3氯離子通道作為周期蛋白cyclin D1的作用靶點(diǎn)參與細(xì)胞周期的調(diào)控[8]，提示ClC-3氯離子通道對(duì)于細(xì)胞的增殖必不可少且是細(xì)胞周期調(diào)節(jié)中的關(guān)鍵因素之一。鉀離子通道是分布最廣泛的陽離子通道之一，存在于大多數(shù)的生物細(xì)胞中，參與諸多的細(xì)胞生物功能。IK1鉀離子通道廣泛表達(dá)于多種細(xì)胞[9]。IK1鉀離子通道基因表達(dá)受抑制后細(xì)胞增殖能力減弱并且細(xì)胞周期停滯于G0/G1期[10-14],提示IK1鉀離子通道參與細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期的調(diào)控。

ClC-3氯離子通道是細(xì)胞通過G1-S期關(guān)卡的關(guān)鍵因素之一，IK1鉀離子通道作為體內(nèi)常見的陽離子通道也參與細(xì)胞的周期調(diào)控，在調(diào)控細(xì)胞從G0/G1期進(jìn)入S期起決定性作用。這2種離子通道在細(xì)胞周期調(diào)控中都起關(guān)鍵性作用，但目前這2種通道間的關(guān)系尚不清楚。本研究旨在探索在細(xì)胞周期調(diào)控中ClC-3氯通道是否為IK1鉀通道的調(diào)節(jié)靶點(diǎn)，試圖從離子通道之間調(diào)控作用的角度探討細(xì)胞周期調(diào)控，拓展對(duì)細(xì)胞周期調(diào)控機(jī)制的理解和認(rèn)識(shí)。

材料和方法

1細(xì)胞

本課題的研究對(duì)象為人鼻咽癌上皮細(xì)胞株 CNE-2Z，由廣東醫(yī)學(xué)院病理教研室惠贈(zèng)后于本室長期保存。

2主要試劑

ATP購自Gibco；脂質(zhì)體LipofectamineTM2000購自Invitrogen；三羥甲基氨基甲烷購自Amresco；兔抗IK1多抗、鼠抗ClC-3單抗均購自Abcam；BCA蛋白濃度測定試劑盒和ECL化學(xué)發(fā)光試劑購自中國碧云天生物技術(shù)研究所；偶聯(lián)辣根過氧化物酶羊抗小鼠IgG購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；偶聯(lián)辣根過氧化物酶羊抗兔IgG購自武漢博士德生物工程有限公司；siRNA由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)合成。

3主要方法

3.1細(xì)胞培養(yǎng)用含有10%新生小牛血清、1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素的1640培養(yǎng)液培養(yǎng)CNE-2Z細(xì)胞，置于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中，48 h后傳代。

3.2轉(zhuǎn)染IK1 siRNA取處于對(duì)數(shù)生長期的人低分化鼻咽癌上皮細(xì)胞進(jìn)行消化，并用不含有抗生素的1640培養(yǎng)液接種于6孔板中，24 h后取出孔板換液，并將siRNA和轉(zhuǎn)染試劑混勻成的轉(zhuǎn)染復(fù)合體加至培養(yǎng)板中進(jìn)行轉(zhuǎn)染，在正常培養(yǎng)條件下繼續(xù)培養(yǎng)。siRNA終濃度為100 nmol/L。本研究使用的IK1 siRNA為對(duì)應(yīng)于人體來源的IK1鉀離子通道基因的siRNA雙鏈，正義鏈序列為5’-GCCGUGCGUGCAGGAUUUA-3’，反義鏈序列為5’-UAAAUCCUGCACGCACGGC-3’；無序siRNA正義鏈序列為5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’，反義鏈序列為5’-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3’。本實(shí)驗(yàn)同時(shí)設(shè)立空白對(duì)照組、轉(zhuǎn)染試劑組、無序?qū)φ战M和IK1 si-RNA轉(zhuǎn)染組。

3.3IK1 siRNA轉(zhuǎn)染率檢測由于本研究使用的IK1 siRNA標(biāo)記有5-FAM綠色熒光基團(tuán)，轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞在熒光顯微鏡下能檢測到綠色熒光。在轉(zhuǎn)染細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)24 h后用無菌PBS洗3次，再用熒光顯微鏡觀測熒光強(qiáng)度并分析轉(zhuǎn)染效率。

3.4Real-time PCR檢測 IK1鉀通道m(xù)RNA的表達(dá)轉(zhuǎn)染siRNA后繼續(xù)培養(yǎng)36 h，常規(guī)方法提取細(xì)胞總RNA，對(duì)提取的總RNA進(jìn)行定量、逆轉(zhuǎn)錄，加入2×qPCR Taq Mix 12.5 μL，10 μmol/L各基因上、下游引物混合物0.5 μL，cDNA模板1 μL，加DEPC水補(bǔ)齊至25 μL； 振蕩混勻，置于Bio-Rad PCR儀中；設(shè)定條件為：95 ℃ 5 min；95 ℃ 15 s，65 ℃ 40 s，44個(gè)循環(huán)。用Bio-Rad軟件分析所得數(shù)據(jù)。

3.5Western blot檢測IK1鉀通道蛋白的表達(dá)轉(zhuǎn)染siRNA 48 h后繼續(xù)培養(yǎng)48 h，常規(guī)方法提取細(xì)胞總蛋白，將得到的總蛋白采用BCA蛋白定量試劑盒定量分析后變性，然后行10% SDS-PAGE和半干轉(zhuǎn)膜、5%脫脂牛奶封閉2 h，4 ℃孵育 I 抗過夜；TBST洗3次后室溫孵育 II 抗1 h；TBST洗3次，ECL化學(xué)發(fā)光顯影。掃描儀掃描得到圖片并用ImageJ軟件分析圖像。

3.6流式細(xì)胞術(shù)常規(guī)培養(yǎng)細(xì)胞并消化，種入6孔板中，置入細(xì)胞培養(yǎng)箱中12 h；轉(zhuǎn)染IK1 siRNA繼續(xù)培養(yǎng)48 h，無菌PBS洗孔板中的細(xì)胞3次，每次1 min，胰酶消化使細(xì)胞變成單個(gè)細(xì)胞懸浮液，收集細(xì)胞移入新的干凈無菌EP管中，800 r/min離心5 min，去上清液；加入無菌PBS，輕柔吹打混勻后800 r/min 離心5 min；再重復(fù)上一步2次；加入70%乙醇，輕柔吹打混勻，使細(xì)胞重新呈單個(gè)細(xì)胞懸浮狀態(tài)；4℃固定1 h；BD流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期分布。

3.7細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)常規(guī)培養(yǎng)CNE-2Z細(xì)胞并消化成單個(gè)細(xì)胞的懸浮液，將細(xì)胞懸浮液滴在干凈的無菌圓形載玻片上，放入培養(yǎng)箱中正常培養(yǎng)6 h完成細(xì)胞爬片。用4%的多聚甲醛滴在爬片上，加0.5 mL 0.5% Triton X-100至玻片，室溫靜置20 min，滴加正常山羊血清，室溫封閉30 min；滴加足夠量的稀釋好的 I 抗并放入濕盒，4 ℃孵育過夜；取出玻片，去除 I 抗，放入暗室并滴加稀釋好的熒光 II 抗，濕盒中室溫避光孵育1 h；滴加DAPI避光孵育5 min，對(duì)標(biāo)本進(jìn)行染核，用含抗熒光淬滅劑的封片液封片，中性樹脂封邊，然后在激光共聚焦顯微鏡下觀察并采集圖像。

3.8膜片鉗實(shí)驗(yàn)用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)記錄氯電流，指令電壓按照0 mV、±40 mV、±80 mV反復(fù)循環(huán)，每個(gè)鉗制脈沖波寬為200 ms, 間隔時(shí)間為4 s。等滲灌流液(300 mOsm/L)配方：70 NaCl，0.5 MgCl2，2 CaCl2,10 Hepes，140 D-mannitol；47%低滲灌流液(160 mOsm/L)不含D-mannitol，其它成分與等滲液相同；電極內(nèi)液含：70 N-methyl-D-glucamine chloride，1.2 MgCl2，1 EGTA，10 Hepes，140 D-mannitol，2 ATP。所有配制液體中所用試劑單位均為mmol/L。灌流液和電極內(nèi)液的pH值分別調(diào)至7.4 和7.2。

4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS 12.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，各組均數(shù)間比較采用Student-Newman-Keuls檢驗(yàn)，以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1IK1 siRNA轉(zhuǎn)染CNE-2Z細(xì)胞的轉(zhuǎn)染率

用帶5-FAM綠色熒光基團(tuán)的IK1 siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞并培養(yǎng)12 h后觀測轉(zhuǎn)染率。空白對(duì)照組細(xì)胞并未轉(zhuǎn)染IK1 siRNA，無綠色熒光；IK1 siRNA轉(zhuǎn)染組細(xì)胞在熒光照射下出現(xiàn)大量綠色熒光，說明IK1 siRNA成功轉(zhuǎn)染進(jìn)入鼻咽癌上皮細(xì)胞，見圖1。

Figure 1.Transfection efficiency of IK1 siRNA observed under fluorescence microscope in poorly differentiated nasopharyngeal carcinoma CNE-2Z cells(×10).

圖1熒光顯微鏡下觀察IK1 siRNA轉(zhuǎn)染低分化鼻咽癌CNE-2Z細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率

2IK1 siRNA抑制IK1鉀通道蛋白的表達(dá)

在轉(zhuǎn)染IK1 siRNA并培養(yǎng)48 h后，冰上裂解細(xì)胞并收集總蛋白，用Western blot檢測蛋白含量。結(jié)果如圖2所示，轉(zhuǎn)染試劑對(duì)照組(Lipo組)IK1蛋白的表達(dá)和無序列siRNA對(duì)照組(negative siRNA組)與空白對(duì)照組(control組)相比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。IK1 siRNA組與空白對(duì)照組相比，IK1蛋白表達(dá)明顯減少(P<0.05)。Real-time PCR的結(jié)果顯示，IK1 siRNA組的IK1 mRNA較control組減少(79.3±2.5)%(P<0.01)，結(jié)果未顯示。

Figure 2.Inhibition of IK1 protein expression by IK1 siRNA in the CNE-2Z cells.Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol.

圖2IK1 siRNA抑制CNE-2Z細(xì)胞中IK1鉀通道蛋白的表達(dá)

3IK1 siRNA轉(zhuǎn)染促進(jìn)ClC-3 mRNA的表達(dá)

轉(zhuǎn)染siRNA后36 h,IK1 siRNA組ClC-3 mRNA較control組增加90% (P<0.05)，見圖3。

Figure 3.The increase in the mRNA expression of ClC-3 by IK1 siRNA in the CNE-2Z cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol.

圖3IK1 siRNA促進(jìn)CNE-2Z細(xì)胞ClC-3 mRNA的表達(dá)

4IK1 siRNA轉(zhuǎn)染使細(xì)胞內(nèi)ClC-3綠色熒光減弱

激光共聚焦顯微鏡下觀察免疫熒光，藍(lán)色為細(xì)胞核，綠色為ClC-3氯通道蛋白，紅色為IK1鉀通道蛋白。如圖4所示，對(duì)照組細(xì)胞中可以檢測到帶綠色熒光的ClC-3氯通道蛋白，而且在細(xì)胞核和細(xì)胞膜上分布較多。與對(duì)照組細(xì)胞的紅色熒光相比較，IK1 siRNA組細(xì)胞的紅色熒光明顯減弱，提示IK1 siRNA能有效抑制IK1蛋白在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)。IK1 siRNA組細(xì)胞中可以檢測到較弱帶綠色熒光的ClC-3氯通道蛋白，其綠色熒光明顯弱于對(duì)照組，表明IK1鉀通道蛋白表達(dá)被抑制后，ClC-3氯通道蛋白的表達(dá)受到抑制。

5IK1 siRNA抑制CNE-2Z細(xì)胞內(nèi)ClC-3蛋白的表達(dá)

Western blot結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組相比， IK1 siRNA組ClC-3蛋白表達(dá)減少(P<0.05)，這提示IK1鉀離子通道可調(diào)控ClC-3氯離子通道蛋白的表達(dá)，見圖5。

6IK1 siRNA抑制CNE-2Z細(xì)胞氯電流

在空白對(duì)照組，細(xì)胞外灌流47%等滲液可激活氯通道。在鉗制電壓為-80 mV時(shí)，記錄到的氯電流平均電流密度為(-55.2±7.2)pA/pF， +80 mV時(shí)的平均電流密度為(78.0± 4.3)pA/pF，此電流可被胞外灌流氯通道阻斷劑DIDS (100 μmol/L) 所抑制。在IK1 siRNA轉(zhuǎn)染48 h后的細(xì)胞，胞外灌流47%低滲灌流液激活的氯電流較為微弱，在鉗制電壓為-80 mV時(shí)，平均電流密度為(-22.5± 3.4)pA/pF， +80 mV時(shí)平均電流密度為(49.9± 5.7)pA/pF，胞外灌流氯通道阻斷劑DIDS (100 μmol/L)后，該氯電流基本被抑制，與空白對(duì)照組相比差異顯著(P<0.01)。結(jié)果表明IK1 siRNA轉(zhuǎn)染能有效抑制細(xì)胞的容積激活性氯電流，見圖6。

Figure 4.ClC-3 protein distribution detected by the confocal immunofluorescence microscopy in the CNE-2Z cells. DIC： differential interference contrast image.

圖4激光共聚焦顯微鏡下檢測ClC-3蛋白的細(xì)胞內(nèi)分布

Figure 5.The effects of IK1 siRNA on the protein expression of ClC-3 in the CNE-2Z cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol.

圖5IK1 siRNA對(duì)ClC-3蛋白表達(dá)的影響

討論

氯離子通道參與細(xì)胞周期的調(diào)控、細(xì)胞分化、細(xì)胞遷移和細(xì)胞凋亡[15-21]，氯離子通道阻斷劑能導(dǎo)致細(xì)胞周期的停滯和使細(xì)胞增殖減少[1]，提示氯離子通道在細(xì)胞周期和細(xì)胞增殖過程中發(fā)揮重要作用。ClC-3氯離子通道作為電壓門控氯離子通道，是具有容積敏感性的氯離子通道之一[22-26]，對(duì)細(xì)胞的生命活動(dòng)是必不可少的，ClC-3氯離子通道蛋白的表達(dá)呈現(xiàn)周期依賴性，ClC-3氯離子通道參與調(diào)節(jié)細(xì)胞體積、細(xì)胞分化和細(xì)胞凋亡。我們的前期研究表明，沉默ClC-3氯離子通道能抑制細(xì)胞增殖并且使細(xì)胞停滯在G0/G1期，提示在細(xì)胞周期進(jìn)程中，ClC-3氯離子通道是調(diào)節(jié)細(xì)胞通過G1-S關(guān)卡的關(guān)鍵因素之一，參與細(xì)胞周期的調(diào)控。

鉀離子通道作為體內(nèi)最多的陽離子通道在很多研究領(lǐng)域并不陌生，鉀離子通道蛋白在增殖較活躍的細(xì)胞中表達(dá)增多，鉀離子通道阻斷劑能阻斷細(xì)胞周期進(jìn)程并且抑制細(xì)胞的增殖。IK1基因被下調(diào)后，細(xì)胞的增殖受抑制，使用siRNA沉默IK1鉀離子通道基因后，能阻斷細(xì)胞周期進(jìn)程并且使細(xì)胞增殖受到抑制。這些都提示IK1鉀離子通道在細(xì)胞周期進(jìn)程中是必不可少。

Figure 6.Inhibition of hypotonicity (Hypo)-activated chloride current by IK1 siRNA in the CNE-2Z cells.Mean±SD.n=5.*P<0.05vscontrol.

圖6IK1 siRNA抑制細(xì)胞低滲激活的氯電流

目前已知ClC-3氯離子通道和IK1鉀離子通道參與細(xì)胞周期的調(diào)控，但這2種通道間的關(guān)系并不清楚。本研究究旨在探索IK1鉀離子通道對(duì)ClC-3氯離子通道是否具有調(diào)控作用，從離子通道之間的調(diào)控作用的全新出發(fā)點(diǎn)來探索腫瘤細(xì)胞的周期調(diào)控。結(jié)果顯示，IK1 siRNA能被成功轉(zhuǎn)染進(jìn)入低分化鼻咽癌上皮細(xì)胞，并且有效抑制IK1鉀離子通道蛋白的表達(dá)，表明所設(shè)計(jì)的siRNA可有效干擾鼻咽癌細(xì)胞IK1基因的表達(dá)。

Real-time PCR結(jié)果提示，在細(xì)胞的mRNA水平，低表達(dá)IK1能使細(xì)胞ClC-3在基因水平表達(dá)增高，即IK1鉀離子通道在mRNA水平對(duì)ClC-3氯離子通道具有負(fù)調(diào)控作用。用免疫熒光技術(shù)在激光共聚焦顯微鏡下觀察不同組內(nèi)細(xì)胞中ClC-3 蛋白的分布情況，結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組相比， IK1 siRNA組細(xì)胞中的ClC-3綠色熒光較弱，提示了IK1 siRNA能抑制細(xì)胞中ClC-3蛋白的表達(dá)，也就是說IK1的低表達(dá)使ClC-3蛋白質(zhì)表達(dá)減少，IK1鉀離子通道蛋白對(duì)ClC-3氯離子通道蛋白的表達(dá)具有正調(diào)控作用，這種調(diào)控作用在Western blot分析中得到進(jìn)一步的證實(shí)。Western blot結(jié)果表明，IK1 siRNA可抑制ClC-3蛋白的表達(dá)，即低表達(dá)IK1后ClC-3蛋白的表達(dá)受到抑制。在上述結(jié)果中，IK1 siRNA促進(jìn)了ClC-3 mRNA的表達(dá)卻抑制了ClC-3蛋白的表達(dá)。這可能與真核細(xì)胞基因的表達(dá)過程中，基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯是2個(gè)不同的過程，在某些特定的條件下脫節(jié)相關(guān)。在轉(zhuǎn)錄和翻譯2個(gè)水平，同一個(gè)基因可以有不同的轉(zhuǎn)錄本，而且mRNA可以有不同的剪接方式，因此一個(gè)基因可以有多個(gè)蛋白質(zhì)?；蜣D(zhuǎn)錄至mRNA后再到蛋白質(zhì)還有眾多的調(diào)控，從ClC-3的 mRNA到ClC-3 蛋白是一個(gè)復(fù)雜的調(diào)控過程，可能ClC-3 mRNA沒有翻譯為蛋白就降解了，也可能翻譯到一定水平后，獲得另外的信號(hào)，而停止翻譯從而導(dǎo)致ClC-3 mRNA的表達(dá)水平升高而ClC-3蛋白表達(dá)水平下降的結(jié)果。ClC-3 mRNA在成功翻譯為ClC-3 蛋白之后還存在一個(gè)翻譯后加工問題，如果翻譯后加工不正確，ClC-3 蛋白可能被內(nèi)肽酶降解，也有可能活性降低，而導(dǎo)致最終ClC-3蛋白表達(dá)水平下降。在ClC-3蛋白受到抑制而表達(dá)水平下降后，細(xì)胞可能在mRNA水平反饋調(diào)節(jié)，最終導(dǎo)致ClC-3蛋白表達(dá)水平降低而mRNA的表達(dá)水平升高。

全細(xì)胞膜片鉗記錄細(xì)胞容積激活性氯通道的結(jié)果表明，IK1 siRNA作用組的細(xì)胞與空白對(duì)照組的細(xì)胞相比，其容積激活性氯電流明顯減小，說明IK1 siRNA可抑制細(xì)胞容積激活性氯電流，進(jìn)一步提示敲低IK1 鉀通道可以抑制氯通道的功能。

綜上所述， 敲低IK1鉀離子通道對(duì)ClC-3氯離子通道的表達(dá)和功能可能具有抑制作用。

[參考文獻(xiàn)]

[1]Chen LX, Zhu LY, Jacob TJ, et al. Roles of volume-activated Cl-currents and regulatory volume decrease in the cell cycle and proliferation in nasopharyngeal carcinoma cells[J]. Cell Proliferation, 2007, 40(2):253-267.

[2]Zhu L, Yang H, Zuo W, et al. Differential expression and roles of volume-activated chloride channels in control of growth of normal and cancerous nasopharyngeal epithelial cells[J]. Biochem Pharmacol, 2012, 83(3):324-334.

[3]Duan D, Zhong J, Hermoso M, et al. Functional inhibition of native volume-sensitive outwardly rectifying anion channels in muscle cells and Xenopus oocytes by anti-ClC-3 antibody[J]. J Physiol, 2001, 531(Pt 2):437-444.

[4]Hermoso M, Satterwhite CM, Andrade YN, et al. ClC-3 is a fundamental molecular component of volume-sensitive outwardly rectifying Cl-channels and volume regulation in HeLa cells and Xenopus laevis oocytes[J]. J Biol Chem, 2002, 277(42):40066-40074.

[5]Wang L, Chen L, Jacob TJ. The role of ClC-3 in volume-activated chloride currents and volume regulation in bovine epithelial cells demonstrated by antisense inhibition[J]. J Physiol, 2000, 524( Pt 1):63-75.

[6]Mao J, Yuan J, Wang L, et al. Tamoxifen inhibits migration of estrogen receptor-negative hepatocellular carcinoma cells by blocking the swelling-activated chloride current[J]. J Cell Physiol, 2013, 228(5):991-1001.

[7]Yang L, Ye D, Ye W, et al. ClC-3 is a main component of background chloride channels activated under isotonic conditions by autocrine ATP in nasopharyngeal carcinoma cells[J]. J Cell Physiol, 2011, 226(10):2516-2526.

[8]Zhang H, Zhu L, Zuo W, et al. The ClC-3 chloride channel protein is a downstream target of cyclin D1 in nasopharyngeal carcinoma cells[J]. Int J Biochem Cell Biol, 2013, 45(3):672-683.

[9]Smets I, Ameloot M, Steels P, et al. Loss of cell volume regulation during metabolic inhibition in renal epithelial cells (A6): role of intracellular pH[J]. Am J Physiol Cell Physiol, 2002, 283(2):C535-C544.

[10]Semtner M, Schaefer M, Pinkenburg O, et al. Potentiation of TRPC5 by protons[J]. J Biol Chem, 2007, 282(46):33868-33878.

[11]Cha SK, Jabbar W, Xie J, et al. Regulation of TRPV5 single-channel activity by intracellular pH[J]. J Membrane Biol, 2007, 220(1-3):79-85.

[12]Tao R, Lau CP, Tse HF, et al. Regulation of cell proliferation by intermediate-conductance Ca2+-activated potassium and volume-sensitive chloride channels in mouse mesenchymal stem cells[J]. Am J Physiol Cell Physiol, 2008, 295(5):C1409-C1416.

[13]Jang SH, Choi C, Hong SG, et al. Silencing of Kv4.1 potassium channels inhibits cell proliferation of tumorigenic human mammary epithelial cells[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2009, 384(2):180-186.

[14]Lallet-Daher H, Roudbaraki M, Bavencoffe A, et al. Intermediate-conductance Ca2+-activated K+channels (IKCa1) regulate human prostate cancer cell proliferation through a close control of calcium entry[J]. Oncogene, 2009, 28(15):1792-1806.

[15]Schwab A, Wulf A, Schulz C, et al. Subcellular distribution of calcium-sensitive potassium channels (IK1) in migrating cells[J]. J Cell Physiol, 2006, 206(1):86-94.

[16]Schmidt J, Friebel K, Schonherr R, et al. Migration-associated secretion of melanoma inhibitory activity at the cell rear is supported by KCa3.1 potassium channels[J]. Cell Res, 2010, 20(11):1224-1238.

[17]Gilliham M, Sullivan W, Tester M, et al. Simultaneous flux and current measurement from single plant protoplasts reveals a strong link between K+fluxes and current, but no link between Ca2+fluxes and current[J]. Plant J, 2006, 46(1):134-144.

[18]Bortner CD, Cidlowski JA. Cell shrinkage and monovalent cation fluxes: role in apoptosis[J]. Arch Biochem Biophys, 2007, 462(2):176-188.

[19]Messerli MA, Collis LP, Smith PJ. Ion trapping with fast-response ion-selective microelectrodes enhances detection of extracellular ion channel gradients[J]. Biophys J, 2009, 96(4):1597-1605.

[20]Strotmann R, Harteneck C, Nunnenmacher K, et al. OTRPC4, a nonselective cation channel that confers sensitivity to extracellular osmolarity[J]. Nature Cell Biol, 2000, 2(10):695-702.

[21]Okada Y, Sato K, Numata T. Pathophysiology and puzzles of the volume-sensitive outwardly rectifying anion channel[J]. J Physiol, 2009, 587(Pt 10):2141-2149.

[22]Borg JJ, Hancox JC, Spencer CI, et al. Tefluthrin modulates a novel anionic background conductance (IAB) in guinea-pig ventricular myocytes[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2002, 292(1):208-215.

[23]Ransom CB, O’Neal JT, Sontheimer H. Volume-activated chloride currents contribute to the resting conductance and invasive migration of human glioma cells[J]. J Neurosci, 2001, 21(19):7674-7683.

[24]Rinke I, Artmann J, Stein V. ClC-2 voltage-gated channels constitute part of the background conductance and assist chloride extrusion[J]. J Neurosci, 2010, 30(13):4776-4786.

[25]Moore DJ, Chambers JK, Wahlin JP, et al. Expression pattern of human P2Y receptor subtypes: a quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction study[J]. Biochim Biophys Acta, 2001, 1521(1-3):107-119.

[26]Duan D, Hume JR, Nattel S. Evidence that outwardly rectifying Cl-channels underlie volume-regulated Cl-currents in heart[J]. Circ Res, 1997, 80(1):103-113.

(責(zé)任編輯： 陳妙玲， 余小慧)

*[基金項(xiàng)目]國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. 81171741)

Knockdown of IK1 potassium channel inhibits expression and function of ClC-3 chloride channelZOU Li-li1, YE Dong3, Lü Rui-ling1, WANG Yuan2, SUN Xiao-xue2, ZHU Lin-yan2, CHEN Li-xin2, WANG Li-wei1

(1DepartmentofPhysiology,2DepartmentofPharmacology,SchoolofMedicine,JinanUniversity,Guangzhou510632,China;3SchoolofBasicCourses,GuangdongPharmaceuticalUniversity,Guangzhou510006,China.E-mail:twangliwei@jnu.edu.cn;tchenlixin@jnu.edu.cn)

[ABSTRACT]AIM: To investigate whether the ClC-3 chloride channel is an acting target of the IK1 potassium channel, and to study the action of IK1 potassium channel on the functional activities and expression of ClC-3 chloride channels. METHODS: IK1 gene was silenced by IK1 siRNA in poorly-differentiated nasopharyngeal carcinoma cells (CNE-2Z). Real-time PCR and Western blot were used to detect the expression of ClC-3 at mRNA and protein levels. The distribution of ClC-3 protein in the cells was observed under confocal immunofluorescence microscope. The chloride current was recorded by the patch-clamp technique. RESULTS: IK1 siRNA was successfully transfected into the CNE-2Z cells and knocked down the expression of IK1 potassium. The mRNA expression of ClC-3 was increased by the IK1 siRNA. IK1 siRNA inhibited the expression of ClC-3 protein. A chloride current was activated by hypotonic challenges, and the hypotonicity-induced current was reduced in the cells which successfully transfected with IK1 siRNA. CONCLUSION: The knockdown of IK1 potassium channels inhibits the expression and function of ClC-3 chloride channel.

[KEY WORDS]ClC-3 chloride channel; IK1 potassium channel; Nasopharyngeal carcinoma; Patch-clamp techniques

通訊作者△Tel: 0313-3042224； E-mail: drduanyonggang@126.com

[收稿日期]2015- 06- 08[修回日期] 2015- 10- 12

[文章編號(hào)]1000- 4718(2015)12- 2120- 06

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2015.12.001

[中圖分類號(hào)]R730.23; R33-33

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A