張春杰　陳松彪　程相朝　廖成水　李　靜　何　雷　張明亮　郁　川　余祖華　賈艷艷　趙戰(zhàn)勤

(河南省動物疫病與公共安全院士工作站/河南科技大學動物疫病與公共衛(wèi)生重點實驗室，洛陽471003)

鼠傷寒沙門菌SL1344株侵襲性蛋白B缺失株asd平衡致死系統(tǒng)的構(gòu)建及特性的研究①

張春杰陳松彪程相朝廖成水李靜何雷張明亮郁川余祖華賈艷艷趙戰(zhàn)勤

(河南省動物疫病與公共安全院士工作站/河南科技大學動物疫病與公共衛(wèi)生重點實驗室，洛陽471003)

[摘要]目的：為研究用于能夠穩(wěn)定攜帶外源基因的口服活疫苗載體。方法：本研究以減毒鼠傷寒沙門菌SL1344ΔsipB為研究對象，利用自殺性質(zhì)粒pREΔasd介導的細菌同源重組技術(shù)，構(gòu)建SL1344ΔsipBΔasd宿主-載體平衡致死系統(tǒng)，并進一步研究其生物學特性。結(jié)果：PCR及測序結(jié)果表明SL1344ΔsipBΔasd構(gòu)建成功。生物學特性結(jié)果表明SL1344ΔsipBΔasd的血清型與SL1344ΔsipB相同，并能夠穩(wěn)定遺傳缺失后的asd基因；其生長速度和生化特性與親本株SL1344基本相同，并且該缺失株仍然具有運動性的能力，小鼠攻毒試驗表明SL1344ΔsipBΔasd電轉(zhuǎn)了攜帶asd基因的互補質(zhì)粒pYA3493后，其毒力較親本菌株SL1344約降低至1.4%。結(jié)論：以上結(jié)果證明，減毒鼠傷寒沙門菌SL1344ΔsipBΔasd菌株構(gòu)建成功，為深入研究以鼠傷寒沙門菌為載體的口服多價疫苗奠定基礎(chǔ)。

[關(guān)鍵詞]自殺性質(zhì)粒；宿主-載體平衡致死系統(tǒng)；SL1344ΔsipBΔasd(pYA3493);口服活疫苗載體

沙門菌能夠利用Ⅲ型分泌系統(tǒng)(T3SS)運輸毒力因子到宿主細胞中，從而侵害宿主細胞，導致人類和哺乳動物的傷寒和胃腸炎，在公共衛(wèi)生學上具有十分重要的意義[1]。

已有研究表明沙門菌入侵宿主細胞的過程中主要是由一系列的轉(zhuǎn)運蛋白在發(fā)揮作用，這些轉(zhuǎn)運蛋白包括:SipB、SipC、 SipD，它們在細菌的一些毒力因子侵入宿主細胞通過細胞膜的過程中會形成一個離子通道[2]。越來越多的證據(jù)表明：SipB,毒力島1介導的一個效應蛋白，通過Capase-1 介導的激活I(lǐng)L-1b 和 IL-18從而促進宿主細胞壞死和凋亡[3,4]。SipB是沙門菌的一種效應蛋白，與介導細菌的侵入有關(guān)，該基因的缺失勢必會影響細菌對宿主細胞的入侵能力，從而影響細菌對宿主的毒力，而asd基因主要編碼天冬氨酸β-半乳糖脫氫酶，該酶是二氨基庚二酸(Dia minopimelic acid,DAP)生物合成途徑中的必需酶，而DAP是革蘭氏陰性菌細胞壁主要成分。asd缺失株在無外源DAP條件下溶菌死亡。因此，利用asd基因互補系統(tǒng)能夠與asd缺失株表型互補，使重組菌在無外源DAP的情況下仍能夠存活，從而保證減毒沙門菌攜帶外源抗原能夠持續(xù)穩(wěn)定表達[5]。

SL1344ΔsipB是筆者在親本菌株SL1344的基礎(chǔ)上構(gòu)建的減毒株[6]，其毒力較親本菌株相比發(fā)生了明顯的下降，并且還具有較好的免疫原性。本研究旨在SL1344ΔsipB的基礎(chǔ)上構(gòu)建減毒鼠傷寒沙門菌SL1344ΔsipBΔasd缺失株平衡致死載體系統(tǒng)，進而為研發(fā)更加安全有效的鼠傷寒沙門菌弱毒疫苗以及開發(fā)以鼠傷寒沙門菌SL1344為載體的多價疫苗奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1細菌菌株、質(zhì)粒和培養(yǎng)條件鼠傷寒沙門菌SL1344強毒株由南京農(nóng)業(yè)大學惠贈；鼠傷寒沙門菌SL1344△sipB[7]缺失株均由河南科技大學動物與疫病公共衛(wèi)生實驗室構(gòu)建并保存；鼠傷寒沙門菌在37℃靜止或振搖培養(yǎng)；細胞在37℃和5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。

1.1.2引物根據(jù)GenBank上已公布的鼠傷寒沙門菌LT2(GenBank No.AE008859)asd基因序列設(shè)計引物，根據(jù)鼠傷寒沙門菌invA基因序列合成用于沙門菌的擴增鑒定的特異性引物。各引物均由上海生物工程公司合成(表1)。

表1PCR擴增所用的引物序列

Tab.1Primer sequences for PCR amplification

1.2方法

1.2.1鼠傷寒沙門菌SL1344ΔsipBΔasd缺失株的構(gòu)建參照HE等[8,9]的方法并加以改進，吸取100 μl供體菌χ7213(pREΔasd)和受體菌SL1344ΔsipB到1 ml含DAP的LB液體培養(yǎng)基試管中混合培養(yǎng)過夜。取100 μl菌液涂布于含Cm的LB固體平板上培養(yǎng)24 h，挑取Cm抗性(Cmr)結(jié)合子，用引物pa1/pa2擴增鑒定。將陽性接合子在含DAP和5%蔗糖的無NaCl的LB(NB)液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，選取合適的稀釋度涂布于含DAP和蔗糖的NB(無NaCl的LB固體平板上，篩選白色細小菌落。挑取單菌落分別劃線于含蔗糖的NB固體平板和含DAP及蔗糖的NB固體平板上，篩選蔗糖抗性(SUCr)及DAP依賴菌落，并用引物pa1/pa2擴增鑒定。

1.2.2缺失株SL1344ΔsipBΔasd的表型鑒定將培養(yǎng)好的細菌SL1344ΔsipBΔasd、SL1344ΔsipB與親本株SL1344分別轉(zhuǎn)接到含DAP和不含DAP的葡萄糖、蔗糖、鼠李糖、甘露醇、麥芽糖等生化鑒定管，研究其生化特性。

1.2.3缺失株SL1344ΔsipBΔasd的遺傳穩(wěn)定性將缺失株SL1344ΔsipBΔasd接種于含DAP的LB液體培養(yǎng)基中連續(xù)傳代培養(yǎng)60代，挑取第10、20、30、40、50、60代單菌落利用引物pa1/pa2研究asd缺失基因在缺失株中的遺傳穩(wěn)定性。

1.2.4缺失株SL1344ΔsipBΔasd的生長特性分別挑取SL1344、SL1344ΔsipB和ΔsipBΔasdSL1344的單菌落，接種于含DAP和普通的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，將培養(yǎng)好的菌液連續(xù)稀釋至合適濃度涂板計數(shù)，然后調(diào)整菌液初始濃度約至1×106CFU/ml，37℃、180 r/min振搖培養(yǎng)。每1 h取一次樣，平板計數(shù)并繪制生長曲線。

1.2.5缺失株SL1344ΔsipBΔasd的流動性測定將缺失菌株和親本菌株調(diào)整至相同的初始濃度，將兩種菌株分別吸取2 μl的菌液滴到含0.3%瓊脂的含DAP的LB半固體平板上面，置于細菌恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。

1.2.6缺失株SL1344ΔsipBΔasd的回復試驗將原核表達質(zhì)粒pYA3493電轉(zhuǎn)化至缺失株SL1344ΔsipBΔasd中，之后涂布普通的LB固體平板，篩選出重組菌株SL1344ΔsipBΔasd(pYA3493)。

1.2.7重組菌株SL1344ΔsipBΔasd(pYA3493)的毒力測定重組菌株SL1344ΔsipBΔasd(pYA3493)與強毒株SL1344分別在LB液體培養(yǎng)基中37℃振蕩培養(yǎng)過夜，5 000 r/min離心10 min收集菌體，并用PBS溶液重懸細菌調(diào)整細菌濃度。每個濃度口服感染6只6周齡BALB/c小鼠，每只200 μl，不斷觀察直至無小鼠死亡，同時設(shè)空白對照組。

2結(jié)果

2.1缺失株SL1344ΔsipBΔasd的構(gòu)建及鑒定缺失株SL1344ΔsipB與大腸桿菌χ7213(pREΔasd)在LB液體培養(yǎng)基中混合培養(yǎng)后，自殺性質(zhì)粒pREΔasd被整合至SL1344ΔsipB染色體上，因而接合子同時具有asd基因的兩個拷貝,即缺失型(315 bp)和野生型(1 803 bp),其表型呈氯霉素抗性且對蔗糖敏感。因而用上臂內(nèi)部引物pa1和下臂內(nèi)部引物pa2進行擴增，可以同時得到缺失型(315 bp)和野生型(1 803 bp)兩個條帶。將陽性接合子在含DAP及5%蔗糖且不含NaCl的LB(NB)液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)會發(fā)生第二次同源重組。重組之后的結(jié)果只有兩種，恢復為SL1344ΔsipB或突變?yōu)镾L1344 ΔsipBΔasd。挑取單菌落用引物pa1/pa2進行擴增鑒定，可得到315 bp的缺失型大小和1 803 bp(SL1344ΔsipB)野生型大小兩條帶。PCR和測序結(jié)果表明SL1344ΔsipBΔasd構(gòu)建成功。

2.2缺失株SL1344ΔsipBΔasd的表型鑒定玻片凝集試驗結(jié)果顯示SL1344ΔsipBΔasd的血清型為1,4,5,12:i:1,2，同親本株SL1344ΔsipB和強毒株SL1344相同。生化鑒定結(jié)果顯示，缺失株與強毒株相比沒有發(fā)生明顯的變化。

2.3缺失株SL1344ΔsipBΔasd的穩(wěn)定遺傳性鑒定將SL1344ΔsipBΔasd在含DAP的LB液體培養(yǎng)基中連續(xù)培養(yǎng)60代，挑取第10、20、30、40、50、60代單菌落用引物pa1/pa2做PCR擴增鑒定，結(jié)果表明缺失株均能穩(wěn)定遺傳缺失的315 bp的asd片段(圖2)。

2.4缺失株SL1344ΔsipBΔasd的生長特性的測定SL1344ΔsipBΔasd、SL1344ΔsipB及親本株SL1344生長特性結(jié)果表明缺失株SL1344ΔsipBΔasd、SL1344ΔsipB的生長速度略慢于親本菌株SL1344的生長特性，而兩種缺失株生長速度無明顯差異(圖3)。

2.5缺失株SL1344ΔsipBΔasd的流動性的測定將兩種細菌在0.3%瓊脂的半固體平板上培養(yǎng)48 h后觀察，親本菌株SL1344和缺失菌株均能夠形成較明顯的運動圈(圖4)，說明該基因缺失后對細菌的運動性沒有明顯的影響。

2.6重組菌株SL1344ΔsipBΔasd的基因互補試驗將重組菌株在普通的LB固體培養(yǎng)基中能夠連續(xù)傳30代，這表明構(gòu)建的重組菌株能夠穩(wěn)定存在，并且可以表達asd基因。

2.7重組菌株SL1344ΔsipBΔasd(pYA3493)的毒力測定口服感染SL1344ΔsipBΔasd(pYA3493)的LD50是1.60×108CFU，SL1344的LD50是2.30×105CFU,說明SL1344ΔsipBΔasd(pYA3493)的毒力較親本株約下降至1.5%。

3討論

近年來，由于重組DNA技術(shù)的發(fā)展和應用，給新型疫苗的制備提供了新的方法。其中，以基因工程減毒細菌活疫苗及其作為載體遞呈外源抗原被認為是最有發(fā)展前景的研究領(lǐng)域之一[9]。通過基因工程減毒的沙門菌，其減毒后具有有限的侵襲潛能，在體內(nèi)生長緩慢，能夠有效的持續(xù)刺激機體產(chǎn)生強有力的細胞免疫、體液免疫以及局部黏膜免疫[10]。更重要的是，基因工程減毒沙門菌還以其有效地呈遞抗原、發(fā)揮免疫佐劑作用以及激發(fā)黏膜免疫的優(yōu)勢被廣泛應用于DNA疫苗新型細菌載體的研究中。

本研究中使用的自殺性質(zhì)粒pRE△asd含有正向選擇的氯霉素(Cm)抗性基因和反向選擇的蔗糖敏感基因(sacB)兩種選擇標記，選擇重組菌就十分方便、快速，并且定位明確，不影響生物體其他遺傳性狀，能夠完全在自然的生物體環(huán)境內(nèi)研究某一基因的功能，最終獲得的重組缺失菌不含任何抗生素抗性基因，就十分便于推廣應用。在前期研究中我們發(fā)現(xiàn)鼠傷寒沙門菌sipB基因缺失后其毒力會發(fā)生顯著的降低，并且還有較好的免疫原性[6]。因此，本研究以鼠傷寒沙門菌SL1344△sipB株為研究對象，采用接合轉(zhuǎn)移的方法將含有缺失315 bp的asd基因的重組自殺性質(zhì)粒導入鼠傷寒沙門菌SL1344△sipB中，通過同源重組、抗性篩選標記和PCR檢測技術(shù)，最終篩選出不含任何抗性的鼠傷寒

沙門菌SL1344△sipB△asd基因缺失突變株。并對它們的生物學特性進行了比較，缺失菌株和與親本菌株相比沒有發(fā)生太明顯的變化。生長速度及生化特性與sipB單缺失株基本保持一致，細菌流動性檢測結(jié)果表明缺失株仍然具有運動性的能力，說明該基因缺失后不會影響細菌鞭毛相關(guān)蛋白的表達。經(jīng)小鼠毒力測試，SL1344△sipB△asd(pYA3493)雙缺失株毒力較親本株SL1344約下降至1.5%，與SL1344△sipB單缺失株毒力相當，說明Δasd作為營養(yǎng)缺陷型基因，由于與含有asd基因的無抗性質(zhì)?；パa，可能不影響其毒力，因此其作為疫苗載體具有良好的安全性，并且其構(gòu)成的宿主載體平衡致死系統(tǒng)，可用于外源基因的穩(wěn)定表達，為將鼠傷寒沙門菌開發(fā)為一種安全高效的口服多價疫苗活載體奠定了基礎(chǔ)。

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[收稿2015-04-21修回2015-06-01]

(編輯張曉舟)

Construction and characterization of invasion protein B gene deleted mutantasdhost-vector balanced lethal system

ZHANGChun-Jie,CHENSong-Biao,CHENGXiang-Chao,LIAOCheng-Shui,LIJing,HELei,ZHANGMing-Liang,YUChuan,YUZu-Hua,JIAYan-Yan，ZHAOZhan-Qin.AnimalDiseaseandPublicSecurityAcademicianWorkstationofHenanProvince/TheKeyLabofAnimalDiseaseandPublicSecurity,HenanUniversityofScienceandTechnology,Luoyang471003，China

[Abstract]Objective:To develop an oral live vaccine vector which stably carries exogenous genes.Methods: SL1344ΔsipBΔasd host-vector balanced lethal system was constructed by the method of recombinant suicide plasmid-mediated allelic exchange on the basis of attenuated Salmonella typhinurium SL1344ΔsipB.Then,the biological characteristics of SL1344ΔsipBΔasd was analyzed.Results: The results showed that the mutant was stabile with the Δasd gene in vitro;the serotype and growth rate of SL1344ΔsipBΔasd strain was almost same as the parent SL1344ΔsipB and SL1344 strain.And the mutant strains remain swim ming zones.Virulence test in mice showed that the virulence of SL1344ΔsipBΔasd which carried complementary plasmid pYA3493 by electrotransformation decreased by 1.4% compared with SL1344.Conclusion: These results showed that the SL1344ΔsipBΔasd mutant was successfully constructed.It is likely that this mutant should be used as a live vector to express foreign genes.

[Key words]Suicide plasmid;Host-vector balanced lethal system;SL1344ΔsipBΔasd(pYA3493);Oral live vaccine vector

作者簡介：張春杰(1964年-)，女，教授，碩士生導師，主要從事動物疫病防控和分子免疫學方面的研究，E-mail:cjzhang@sina.com。

中圖分類號S852.612
①本文受河南省科技攻關(guān)項目(152102110078)資助。

文獻標志碼A

文章編號1000-484X(2016)02-0210-04

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2016.02.014