陳　思，魯克慶，馬興銘

(1.蘭州大學第二醫(yī)院檢驗中心； 2.甘肅省泌尿系疾病臨床醫(yī)學中心；3.蘭州大學基礎(chǔ)醫(yī)學院,蘭州　730030)

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綜述與專論

微核試驗方法及應用研究進展

陳思1,3，魯克慶2，馬興銘3

(1.蘭州大學第二醫(yī)院檢驗中心； 2.甘肅省泌尿系疾病臨床醫(yī)學中心；3.蘭州大學基礎(chǔ)醫(yī)學院,蘭州730030)

【摘要】微核(micronucleus,MN)試驗，作為一種常規(guī)的基因毒性檢測方法，已經(jīng)得到了廣泛的應用。其檢測的標本也從骨髓擴展到血液和組織。除常規(guī)的藥物基因毒性檢測外，在基因改變性疾病的診斷，療效的評估和預防等方面具有重要的作用。另外，微核試驗也是藥品，保健品注冊上市的安全檢測的一項重要的指標。本文就目前的微核試驗的染色方法以及疾病和病毒學等領(lǐng)域的應用加以綜述。

【關(guān)鍵詞】微核試驗；基因毒；疾病

微核(micronucleus，MN)是一種獨立于主核之外的核小體，存在于細胞質(zhì)中，體積大約為主核的1/16到1/3，其染色與主核相一致，通過染色可以在光學顯微鏡下觀察到。微核的形成是由于基因組的不穩(wěn)定性和染色體的損傷有關(guān)。因此，可用于輔助診斷某些基因改變導致的疾病或遺傳病。腫瘤作為一種公認的基因突變性疾病，它的治療、診斷和預防仍是醫(yī)學界的一大挑戰(zhàn)，MN可以作為一種生物標記用來預測早期的癌前病變，對高風險人群進行普查，具有重要的應用價值[1-3]。MN實驗作為一種快速、簡便、經(jīng)濟的基因毒性檢測方法，已成為遺傳毒性檢測的常規(guī)檢測手段。美國食品藥品管理局(Food and Drug administration，F(xiàn)DA)，歐洲藥監(jiān)局(European Medicines Agency, EMA)等部門均要求：基因毒性的檢測應為藥物安全性評估的必須一部分[4]。微核試驗也是我國藥物遺傳毒性研究技術(shù)指導原則和國際人用藥品注冊技術(shù)要求協(xié)調(diào)會(International Conference on Harmonization of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use，ICH)新藥遺傳毒性評價指導原則共同推薦的遺傳毒性檢測方法之一。衛(wèi)生部《保健食品檢驗與評價技術(shù)規(guī)范》(2003年版)和《食品安全毒理學評價程序和檢驗方法規(guī)范》中均要求保健食品和具有保健作用的藥品進行安全性評價時必須進行遺傳毒性試驗的毒理學研究。

在過去的幾十年內(nèi)，微核試驗的應用不再局限于藥物的遺傳毒性的檢測，已擴大到環(huán)境污染的檢測、臨床疾病的診斷和治療后的評估、病毒學等相關(guān)領(lǐng)域，本文就目前微核試驗的方法和微核試驗的應用加以綜述。

1微核形成的機制

MN的形成主要有兩種機制，一種是染色體的斷裂，另外一種是有絲分裂過程的紊亂[5]。當正常的個體暴露于污染的環(huán)境，放射或服用致畸藥物和有毒化學物等條件下，均可促進MN的形成。另外，慢性炎癥[6]、癌前病變[7, 8]、腫瘤[9]和一些其它的基因遺傳性疾病[10]均可以引起MN的增加。此外，病毒的感染也是MN形成的一個重要的原因。另外，使用抗著絲?？贵w可以是細胞的有絲分裂過程紊亂，促進 MN的形成[11]。

2微核試驗的方法

MN實驗的取材可以是骨髓、組織上皮細胞、血液中的淋巴細胞。骨髓的取材一般適用于小鼠的微核試驗，染毒方式一般有兩種：一是單劑量給藥后24~48 h內(nèi)取材；二是多次染毒，在最后一次給藥后18~24 h內(nèi)取材。給藥的方案應超過1 d，計數(shù)大約2 000個嗜多染紅細胞(PCE)，觀察微核細胞的比例[11]。血液中淋巴細胞MN的檢測[12]，將采到的全血置于肝素抗凝管中，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)44 h，然后加入細胞松弛素-B后，對全血進行染毒，繼續(xù)培養(yǎng)72 h后，離心去除上清液，然后加入0.075 mmol/L的KCl混勻后，加入1.5 mL固定液(甲醇和冰醋酸)，離心去除上清液，再次加入3 mL的固定液，離心去除上清液，將0.5 mL的固定液吹散后滴片，10%的Giemsa液染色10~15 min，晾干待測。組織中的微核試驗檢[13]，將所需組織取出后，使用蛋白溶解酶(膠原酶)分離細胞，進行染色，以小鼠的肝組織為例：將1 g左右的肝臟切碎，然后用100 U/mL的膠原酶分離肝細胞，分離后的肝細胞固定于4%的甲醛溶液固定液中，使用500 μg/mL吖啶橙或10%的4,6-二咪基-2-苯基吲哚進行染色。歐洲替代試驗有效性驗證中心(European Centre for the Validation of Alternative Methods，ECVAM)證實體外微核試驗可以替代體外染色體畸變試驗用于遺傳毒性檢測[14]。近年來，自動化檢測技術(shù)在體外微核試驗中探索性應用取得了進步，已應用于微核自動化計數(shù)，流式細胞術(shù)[15]、計算機圖像分析系統(tǒng)[16, 17]、激光掃描細胞儀[18]，高分辨率熒光細胞成像[19]檢測計數(shù)等，使體外微核試驗操作更簡單、快速，結(jié)果更準確、客觀。

3微核實驗的方法評估

在細胞之中，胞質(zhì)中核小體的出現(xiàn)并不一定是微核細胞，它應該與凋亡細胞和壞死細胞細胞核溶解造成的MN相區(qū)別。微核細胞的特征包括：核小體的位置靠近主核，一般為細胞膜和細胞核中間的細胞質(zhì)內(nèi)；大小約為主核的1/16到1/3；染色與主核相一致或比主核染色更深；形態(tài)為圓形或橢圓形；MN的數(shù)量一般少于3個。另外，MN細胞的細胞膜完整，主核清晰。凋亡的細胞細胞膜完整，無明顯的主核，核小體數(shù)量超過3個以上[5]。壞死細胞細胞膜不不完整，細胞核結(jié)構(gòu)破壞，核小體出現(xiàn)于胞漿中，形態(tài)不規(guī)則。在進行微核試驗時，微核細胞的計數(shù)應注意與壞死和凋亡的細胞相區(qū)別，以免造成實驗結(jié)果的假陽性，影響實驗結(jié)果的準確性。

4微核實驗的應用

微核試驗主要應用于藥物的遺傳毒性檢測和環(huán)境中化學致畸物質(zhì)的檢測[20]。Cigerci等[21]使用微核試驗的方法評估了氯化鈷(cobalt chloride, CoCl2)在環(huán)境污染中的危害，發(fā)現(xiàn)CoCl2能夠損傷DNA，造成染色體的斷裂。Valdiglesias等[22]比較了正常人與體弱人群之間外周血中微核細胞的比例差異，但結(jié)果沒有統(tǒng)計學意義。Recio等[23]檢測了乙基甲磺酸(ethylmethane sufonate, EMS)、丙烯酰胺(acrylamide, ACM)、環(huán)磷酰胺(cylophosphamide, CP)、長春新堿(vincristine sulfate, VS)四中物質(zhì)在遺傳學中的作用，結(jié)果顯示在ACM、EMS、CP給藥之后微核細胞的比例升高，VS結(jié)果陰性。另外，在評估放射性遺傳物質(zhì)的損傷方面也有重要的作用。隨著基因組學研究的進展，發(fā)現(xiàn)許多疾病的發(fā)生與基因的突變，染色體的缺失或基因修復機制的受損有關(guān)，從基因水平上來尋找病因，診斷和監(jiān)控疾病。另外，在病毒學中，微核試驗也是檢測病毒是否能夠?qū)е禄蛲蛔兊囊环N重要方法，能夠明確病毒是否具有基因毒性[24]，為某些病毒感染性疾病的預防提供指導。

4.1疾病的診斷和預防

4.1.1在腫瘤中的應用：與正常的細胞和良性病變相比，惡性腫瘤的基因組不穩(wěn)定，基因修復機制受到損傷，突變率明顯增加[25]。將人子宮頸癌和正常的宮頸組織或炎性病變的組織相比，子宮頸癌組織中，微核細胞的比例明顯增加，并且不同級別的子宮頸癌，MN細胞的比例也有明顯的不同[26, 27]。另外，乳腺導管癌與乳腺的良性病變相比，MN細胞的比例存在明顯的差異，并且不同級別的乳腺導管癌，MN細胞的數(shù)量也存在明顯的不同[28]。Arora等[29]的研究表明在非典型尿路上皮癌中，MN的比例也明顯的提高。為此，MN可以作為尿路上皮癌的一種輔助性診斷方法。另外在癌前病變， MN的比例也明顯的增加[8]。為此，它可以作為癌前病變的一個篩查指標。放療后，早期的MN的比例明顯的增加[30]，腫瘤進行MN檢測時，應在放射治療之前，以免造成數(shù)據(jù)的假陽性。

4.1.2自身免疫性疾?。涸谧陨砻庖咝约膊≈?，自身抗體的產(chǎn)生扮演著重要的角色，它是檢測、診斷、評估和分類自身免疫性疾病的重要標志，最新的研究表明：自身抗體可以誘發(fā)染色體的斷裂[26]。此外，在自身免疫性疾病中，慢性炎癥和氧化還原平衡的失調(diào)也發(fā)揮著重要的作用，它們也是誘發(fā)染色體斷裂，促進MN形成的重要原因之一[31]。在器官組織特異性疾病之中，糖尿病(Diabetes mellitus, DM)是最為典型的一種，在2007年的研究發(fā)現(xiàn)：與正常人相比，DM的病人血中淋巴細胞中MN比例的增加，與1型糖尿病相比，2型糖尿病中MN細胞的比例更高，但是給予葉酸30天后，MN的比例明顯的降低了[32]。在系統(tǒng)性組織特異性疾病中，系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)的病人，與正常人的口腔頰粘膜的細胞涂片分析中，MN細胞的比例也是升高的[33]。此外，Karaman等的研究表明在風濕性關(guān)節(jié)炎病人的血中淋巴細胞MN的比例明顯增加[31]。因此，MN有可能成為自身免疫性疾病的輔助診斷和復發(fā)監(jiān)控和療效評估的重要生物靶標之一[34]。

4.2在病毒學中的應用

MN實驗在病毒學中，也具有廣泛的應用，在EB病毒的研究中發(fā)現(xiàn)，MN細胞的比例明顯的增加[35]。Cassel AP等人的研究發(fā)現(xiàn)HPV感染的女性患者，在子宮頸涂片和外周血中的MN的比例也是明顯增加的[36]，這可能與HPV產(chǎn)生的癌蛋白E6和E7的誘導相關(guān)[37]。

5展望

MN的形成并不一定是受到外界環(huán)境的刺激引起的，在生理情況下，也可產(chǎn)生，在各種實驗之中已被證實。MN的形成也可能來源于細胞有絲分裂從G0到G1期過程之中，雙鏈DNA斷裂的生理性損傷，為此在正常的細胞之中，也可以出現(xiàn)MN，會造成一定的假陽性率的出現(xiàn)，所以只有當MN的比例明顯增加升高時，才能說明存在基因毒性，另外微核試驗的檢驗標準沒有準確的定義，無比較精確的范圍，這是其重要的缺點之一。盡管如此，微核試驗以其簡單、快速、經(jīng)濟的優(yōu)勢廣泛的應用于藥品基因毒性的檢測；多種自身疾病的輔助診斷、預防復發(fā)和療效的評估；惡性腫瘤和癌前病變輔助性的診斷；另外在環(huán)境污染和病毒學引起的染色體的突變的研究中，也廣泛應用。

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〔修回日期〕2016-01-07

Research progress of the methods and applications of micronucleus assay

CHEN Si, LU Ke-qing, MA Xing-ming

(1.Department of Medical laboratory, Second Hospital of Lanzhou University, 2. Gansu Urological Clinical Center,3. School of Basic Medical Sciences, Lanzhou University, Lanzhou 730030, China)

【Abstract】Micronucleus (MN) assay as a routine examination for genotoxicity has been widely used. The testing specimens were taken from bone marrow and extended from blood and tissues. In addition to testing genotoxicity of drugs, it is also applied in disease diagnosis for genetic mutation, evaluation of curative effectiveness and disease prevention. Moreover, MN assay is also an important safety indicator for drugs and health foods registration. This review will discuss the staining method of MN test and its application in the field of diseases and virology.

【Key words】Micronucleus assay; Genotoxicity; Disease

doi:10.3969.j.issn.1671-7856. 2016.02.017

【中圖分類號】R-33

【文獻標識碼】A

【文章編號】1671-7856(2016) 02-0083-04

[作者簡介]陳思(1977-)，女，在讀研究生，主要從事醫(yī)學檢驗。Email： lncsi@126.com。[通訊作者]馬興銘，教授，博導，主要從事醫(yī)學免疫學研究。Email： maxm@lzu.edu.cn。