陳　杰，黃小波，張雨迪，卿　盈，李亞青，文心田，曹三杰，文翼平，伍　銳

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冠狀病毒的氨基肽酶N受體的研究進展

陳杰，黃小波，張雨迪，卿盈，李亞青，文心田，曹三杰，文翼平，伍銳

四川農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，豬病研究中心/動物傳染病與基因芯片室，成都611130

摘要：氨基肽酶N(Aminopeptidase N, APN)是一種鋅離子依賴性膜結(jié)合II型的金屬跨膜糖蛋白，其廣泛存在于人和哺乳動物的多種組織細胞中。APN是多種冠狀病毒的黏附性受體，參與冠狀病毒的粘附與侵襲，與病毒感染密切相關。本文對多種冠狀病毒(HCoV-229E、FCoV、CCoV、TGEV、PEDV)的APN受體的結(jié)構(gòu)、功能、抑制劑等研究進展進行了總結(jié)，重點介紹了其作為人和豬冠狀病毒功能受體的進展。本文為深入研究和應用冠狀病毒APN受體提供參考。

關鍵詞：氨基肽酶N；冠狀病毒；受體

1氨基肽酶N概述

氨基肽酶N(Aminopeptidase N, APN)，曾稱為氨基肽酶M、亮氨酸氨基肽酶和CD13抗原，相對分子量約150 kDa，由于各自氨基肽酶N糖基化程度不同，所以在相對分子量上有差異，大約為960-980 aa。它是一類鋅離子依賴性的膜結(jié)合II型金屬糖蛋白，存在于細胞表面，主要是I型冠狀病毒的黏附性受體，廣泛分布于哺乳動物的多種組織細胞的表面，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的突觸膜、粒細胞和單核細胞、腎近曲小管上皮和肺臟細胞表面都有高水平的表達，尤其在小腸微絨毛表面大量存在，主要功能是水解肽、酰胺等結(jié)構(gòu)中的酰胺鍵，從而釋放出不同的N-中性氨基酸[1]。APN作用的天然底物包括血管作用肽(賴氨酸-緩激肽、血管緊張素III)、神經(jīng)肽激素(亮氨酸和蛋氨酸腦磷脂、神經(jīng)激肽A)、細胞因子和免疫調(diào)節(jié)劑(IL-8、吞噬刺激素、胸腺肽)等，因此它能參與很多重要過程的深度反應，比如細胞生長、免疫調(diào)節(jié)和血壓調(diào)節(jié)[2]。研究表明APN對IL-8的降解，淋巴細胞參與機制，白細胞生長功能，降低T細胞對MHC II型抗原決定簇的識別能力等方面都有很大的影響[3-4]。

冠狀病毒中主要是I型冠狀病毒以APN作為細胞受體結(jié)合感染宿主。早先報道的人冠狀病毒229E(HCoV-229E)、豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)、貓冠狀病毒(FCoV)的細胞受體都是APN[5-7]，這些冠狀病毒都是通過S蛋白與APN發(fā)生粘附來介導感染的，主要依賴各自S蛋白來識別APN具有種屬特異性的氨基酸從而感染宿主細胞[8-9]。S蛋白中S1區(qū)中含有受體結(jié)合區(qū)(receptor-binding domains, RBDs)，TGEV、FCoV、CCoV的RBDs在579-655aa是高度保守的，而HCoV-229E 則在417-547aa高度保守，這些結(jié)合區(qū)域的改變會影響S蛋白對各自APN的識別作用[10-11]。APN作為冠狀病毒感染的受體具有種屬特異性，如感染人的HCoV-229E只能特異性結(jié)合人體內(nèi)的hAPN，但報道貓的氨肽酶fAPN可作為多種I型冠狀病毒的感染受體[6]，而豬流行性腹瀉病毒(PEDV)也可與北京鴨小腸上皮細胞表達的APN受體結(jié)合從而在其上增殖[12]。

2冠狀病毒受體結(jié)構(gòu)與功能

2.1人氨基肽酶(hAPN)hAPN長3 740 bp，基因編碼序列有20個外顯子，編碼966個氨基酸，在腫瘤細胞表面表達較高，特別是在腫瘤血管內(nèi)皮細胞表面，因此其可以調(diào)節(jié)與惡性腫瘤相關的肽，從而調(diào)節(jié)惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移，分化，增殖，凋亡以及血管生成；由于APN能夠降解抗原呈遞細胞上免疫活性物質(zhì)，從而削弱巨噬細胞和自然殺傷細胞對腫瘤的識別和殺傷能力[13]，因此它也被看作是抗癌藥物設計的靶點。在人冠狀病毒當中，HCoV-229E的受體為氨基肽酶N，而其他冠狀病毒SARS-CoV、HCoV-NL63的受體為血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2(ACE2)[14-15]，MERS-CoV的受體可能為二肽基肽酶4(DPP4)[16]，HCoV-OC43的受體為乙酰神經(jīng)氨酸(N-acetyl-9-O-acetylneuraminic acid)[17]。

APN作為HCoV-229E粘附性受體的作用機制是：首先病毒的S蛋白受體結(jié)合域在耐聚乙二醇辛基苯基醚微區(qū)與氨基肽酶N發(fā)生粘合，之后與氨基肽酶N叢發(fā)生交聯(lián)，再到達陷窩蛋白區(qū)，最后介導病毒進入靶細胞[18]。hAPN的病毒結(jié)合位點實際上存在相對廣泛變化的[19]，目前它的病毒結(jié)合位點、實驗模型也取得了一定進展。近年來，有研究表明在hAPN的288-295aa或291aa引入糖基化位點將會使其失去與HCoV- 229E的結(jié)合能力[20]。鼠APN 288-290aa所編碼的N段糖基化序列阻斷HCoV-229E的感染實驗也契合了這一點； hAPN中R741若被R741T替代則會增強TGEV的受體活性，而不會增強FCoV和CCoV的受體活性[8]。通過轉(zhuǎn)基因技術獲得能夠表達hAPN的轉(zhuǎn)基因小鼠在體外能夠被HCoV-229E感染[21]；Hela細胞(人宮頸癌細胞)在胰蛋白酶或其他蛋白酶處理后通過APN形成的合胞體而感染HCoV-229E[22]。

2.2豬氨基肽酶T GEV和PEDV是引起新生仔豬損失的重要病原，近年在我國和全球許多國家暴發(fā)[23-26]，造成大量仔豬損失，已成為全球養(yǎng)豬業(yè)共同關注的疫病問題。由于pAPN作為TGEV和PEDV受體的發(fā)現(xiàn)[5, 27]，所以其受體的作用機制和相關抑制劑等研究也成為近年的研究熱點，從病原與宿主受體的關系著手，掌握TGEV和PEDV的感染機制，開發(fā)疫苗、抗病毒藥物和受體抑制劑是防控的一個重要方向。

豬氨基肽酶N(Porcine aminopeptidase N, pAPN)編碼963個氨基酸，可被胰蛋白酶分解成2個亞基，一個95 kDa的N端部分和一個50 kDa的C端部分，在剩余區(qū)域717至813aa含有3個抗原中和位點，其廣泛存在于豬小腸和腎臟。近幾年，豬氨基肽酶N在TGEV和PEDV感染機制的研究中也有了眉目，其相關研究也備受關注。pAPN的抗原表位、受體結(jié)合域的篩選研究逐步增多。劉博奇等[28]初步篩選出pAPN的主要抗原功能區(qū)位于36～153aa、349～591aa、592～963aa區(qū)域。張健等[29]將pAPN基因截短獲得目的基因JP1、JP2，初步鑒定與PEDV結(jié)合的受體功能域可能存在于JP1(466-2 029 bp)。劉穎等[30]測定了梅山豬的pAPN的cDNA序列，發(fā)現(xiàn)梅山豬的pAPN基因與GenBank上公布的標準序列相比有10處氨基酸突變和兩處氨基酸缺失，其中有6處位于酶的催化活性區(qū)域，Gln747His突變、748tyr和749Ser缺失突變位于pAPN病毒結(jié)合區(qū)域，這些位點的突變可能與pAPN結(jié)合病毒的能力有關。

目前pAPN的表達主要包括原核表達、真核表達和昆蟲表達系統(tǒng)。采用真核表達系統(tǒng)pcDNA3.1和原核表達系統(tǒng)pET-28a(+)都能成功表達出pAPN蛋白[31]；桿狀病毒-昆蟲細胞系統(tǒng)也能成功表達出SPA、SPB、SPC 3段分段蛋白[32]。

2.2.1TGEV的豬氨基肽酶N受體氨基肽酶作為TGEV的細胞受體早已確認[5]，目前它作為TGEV的細胞受體的抗體粘附位點和病毒結(jié)合位點的研究也在逐步深入。Sun等[33]人通過His-tag的單克隆抗體技術分析原核表達出的截短pAPN-C重組蛋白與TGEV的粘附能力，發(fā)現(xiàn)rpAPN-C2和rpAPN-C3之間的重疊區(qū)域(673-722aa)是pAPN-C與TGEV結(jié)合的關鍵位點，同時rpAPN-C4也具有一定的病毒粘附能力。Ren等[34]發(fā)現(xiàn)通過原核表達系統(tǒng)制備出的四種截短pAPN蛋白，其中有3種蛋白能夠很好地和抗pAPN特異性血清發(fā)生反應，這3段區(qū)域主要為36-223aa、349-591aa、592-963aa，而這幾種蛋白能夠不同程度地阻斷TGEV對ST細胞的感染。因此pAPN的主要抗體粘附位點與病毒結(jié)合位點可能存在一定聯(lián)系。真核系統(tǒng)可提高表達蛋白的活性，為研究pAPN作為TGEV細胞受體機制奠定基礎。楊震等[35]人構(gòu)建的真核表達系統(tǒng)pEGFP-N1-pAPN-SPC在Vero細胞中成功表達出pAPN-SPC蛋白。

2.2.2PEDV的豬氨基肽酶N受體Lee等[36]發(fā)現(xiàn)APN是PEDV的受體，其主要與PEDV的S蛋白的S1區(qū)結(jié)合。Li等[27]通過將pAPN基因轉(zhuǎn)染至犬腎細胞(Madin Darby Canine Kidney，MDCK，MDCK是PEDV的非易感性細胞)，使得MDCK能夠表達pAPN后，再用PEDV能成功感染MDCK，因此發(fā)現(xiàn)pAPN是PEDV的功能性受體；通過免疫熒光和中和試驗發(fā)現(xiàn)pAPN還具有介導PEDV復制的能力。楊殿奎等[37]構(gòu)建了表達 pAPN的真核系統(tǒng)，建立了穩(wěn)定表達pAPN的MDCK細胞系，并進一步明確了pAPN是PEDV細胞感染的受體。單智夫[38]將去信號肽的pAPN分為SPA、SPB、SPC 3個片段轉(zhuǎn)染到MDCK并成功表達，同時對轉(zhuǎn)染3個片段的MDCK細胞接種PEDV，發(fā)現(xiàn)SPC段的MDCK細胞出現(xiàn)病變，初步證明了pAPN的受體功能域存在于SPC段(即pAPN的500aa-963aa)。

雖然這初步證明了pAPN是PEDV的功能受體，但是PEDV卻不能在能夠表達pAPN的豬睪丸細胞ST上進行增殖，反而TGEV卻能在其上增殖。Eeuri等[39]人研究發(fā)現(xiàn)PEDV的感染其實是與pAPN受體的分布密度是有關系的。在Vero細胞中添加pAPN的實驗中也證明了這一點[29]。事實上原代ST細胞表達內(nèi)源性pAPN的量很低，多對PEDV不敏感，但經(jīng)過基因重組能夠高效表達pAPN的ST細胞能支持PEDV在其上感染并高效增殖[39]。JIN等[40]發(fā)現(xiàn)對PEDV感染敏感的Vero細胞鑒定中并未鑒定到pAPN，這一結(jié)果是否說明PEDV還存在其他感染途徑或感染方式。對于PEDV的感染方式，Cong等[41]發(fā)現(xiàn)PEDV不僅通過Vero E6和豬小腸上皮細胞(IECs)的頂端質(zhì)膜進入細胞，而且產(chǎn)生的子代病毒也從這些極化上皮細胞的頂端質(zhì)膜位點釋放。同時在這些細胞的極化位點存在pAPN，采用共聚焦顯微鏡觀察表明pAPN介導PEDV的極化感染，因此可能是PEDV感染IECs的功能性受體。

2.3犬氨基肽酶N(cAPN)cAPN長3 383 bp，編碼976個氨基酸，作為粘附受體介導CCoV感染宿主，引起急性腸道傳染病。CCoV主要分為I型和II型，二者除了S蛋白和ORF3區(qū)域，結(jié)構(gòu)十分接近[42]，臨床上分離的主要為II型。CCoV-A76不同于其他II型CCoV，它只能結(jié)合cAPN來感染犬細胞系，而其它CCoV可以通過結(jié)合fAPN感染貓細胞(貓腎細胞CRFK、貓?zhí)フ７渭毎鸄K-D、貓肺細胞Fc2Lu、貓乳腺上皮細胞FMEC)并高效繁殖[43]。

2.4貓氨基肽酶N(fAPN)fAPN全長3 135 bp，編碼968個氨基酸，不僅可以作為FCoV的受體，還可作為多種I型冠狀病毒和III型冠狀病毒中雞傳染性支氣管炎病毒(IBV)的受體[44]。FCoV與CCoV相似，也分為I型和II型，其中II型能夠結(jié)合fAPN高效感染宿主細胞，引起貓傳染性腹膜炎(FIP)，而I型卻很難結(jié)合fAPN進入細胞，但有報道稱I型依賴貓樹突狀特異性非整合素細胞間粘附分子(feline dendritic cell-specific intercellular adhesion molecule grabbing non-integrin，fDC-SIGN)感染宿主[45]。因此，Tekes等[46]構(gòu)建了能編碼II型FCoV的S蛋白(79-1146bp)的I型FCoV，該I型FCoV就可與fAPN結(jié)合而感染宿主細胞。各冠狀病毒雖然能與fAPN結(jié)合，但結(jié)合的活性位點也不完全相同。Tusell等[8]研究表明fAPN的R1區(qū)(732-746aa)和R2(761-788 aa)是FCoV、CCoV和TGEV感染的關鍵位點，而288-290aa位點是HCoV-229E的感染的關鍵位點；TGEV的感染依賴于fAPN的R1區(qū)，而FCoV侵染細胞需要同時具備R1和R2區(qū)所編碼的殘基，CCoV不僅需要R1區(qū)和R2區(qū)，還需要N740殘基的參與才能感染細胞，而fAPN中T742片段若被T742V或者T742R置換則會破壞TGEV、CCoV和FCoV與受體的活性。

3氨基肽酶受體抑制劑及抗體相關研究

3.1人氨基肽酶N抑制劑目前關于APN抑制劑(APNIs，APN Inhibitors)的研究主要集中在控制人類腫瘤疾病方面，主要有天然產(chǎn)物以及化學合成小分子兩大類。天然產(chǎn)物主要有：烏苯美司、海洋天然產(chǎn)物Psammaplin A、姜黃素、Probestin，Phebestin，Amastatin，Lapstatin，Leuhistin等；化學合成小分子主要有：β-硫酚異羥肟酸類、3-氨基-2-羥基-苯丁酸(AHPA)類、1，2-二氨基-3-苯基丙烷類、1,3,4-噻二唑類、L-精氨酸衍生物類、L-賴氨酸衍生物類、環(huán)酰亞胺類、磷酸衍生物類、氯霉胺衍生物類以及黃酮-8-乙酸衍生物類等[47]。近年，作為新的APN選擇性抑制劑的前體結(jié)構(gòu)，苯丙環(huán)庚酮類似物、新二氫吲哚-2,3-二酮衍生物被發(fā)現(xiàn)具有高效抑制活性和高選擇性作用[48-49]。雖然hAPN抑制劑的研究取得了進展，但進一步研究開發(fā)對APN抑制活性更強、選擇性更高、生物利用度更高、藥效時間更長和毒副作用更弱的化合物將成為發(fā)展趨勢。

3.2豬氨基肽酶N抑制劑及抗體近年來pAPN的抑制劑或抗體研究成為熱點。噬菌體展示技術、抗pAPN抗體為PEDV或TGEV的檢測和控制提供了研究方向，比如抗pAPN多克隆抗體、單鏈抗體。Sun等[50]通過原核表達pAPN-C蛋白免疫兔，制備的抗pAPN-C片段的多克隆抗體能夠識別pAPN。同時通過噬菌體ELISA技術，用制備的抗pAPN的單鏈抗體(single-chain fragment variable, scFv)能夠與pAPN發(fā)生特異性結(jié)合[51]。

3.2.1TGEV的豬氨基肽酶N抑制劑針對pAPN的多抗血清的制備為TGEV的檢測和藥物的研發(fā)提供了參考價值。Liu等[52]構(gòu)建了能夠穩(wěn)定表達去信號肽pAPN的大腸桿菌BL21，提取和純化表達的pAPN免疫兔獲得了高滴度的抗pAPN多克隆抗體，該抗體能與重組pAPN和天然pAPN發(fā)生中和反應，且能阻斷TGEV的感染。該研究還發(fā)現(xiàn)pAPN在豬小腸內(nèi)的主要表達位點為小腸刷狀緣，這與臨床上病毒感染的侵入機制相符合。另外，噬菌體展示肽PM1對豬睪丸細胞ST抗TGEV也具有一定保護力[53]。然而，TGEV在呼吸道能夠大量增殖，但是在腸道的增殖量卻很低[54]，推測TGEV在感染機體時可能還存在其他一些關鍵因素。

3.2.2PEDV的豬氨基肽酶N抑制劑在抑制PEDV病毒方面，由于APN具有種屬特異性，PEDV與pAPN的特異性結(jié)合可以被抗pAPN多克隆抗體或抗病毒的單克隆抗體所封閉[40]。在肌注PEDV前，肌注可溶性pAPN會增強PEDV的抗體水平[55]。Meng等[56]用噬菌體展示技術設計出3個肽段(H、S和F)，發(fā)現(xiàn)這3個合成肽對感染了PEDV的Vero細胞沒有直接抑制作用，但H肽和PEDV在37 ℃預孵育1 h后再感染Vero細胞，PEDV的感染卻受到抑制，并發(fā)現(xiàn)H肽是和PEDV的S蛋白發(fā)生反應從而抑制病毒感染，H肽的發(fā)現(xiàn)為篩選S蛋白參與PEDV病毒結(jié)合和抑制位點奠定了基礎。

4展望

由于APN病毒結(jié)合位點的多樣化和復雜化，雖然目前已對部分冠狀病毒依賴的APN鑒定出了一些受體位點，但仍然沒有闡明APN具體的病毒結(jié)合區(qū)。目前APN作為抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的靶點，其相關作用機制和抑制劑的研究已經(jīng)取得了較大的進展[57-58]，這也許可給APN在冠狀病毒上的研究提供一些借鑒和啟示。

pAPN作為冠狀病毒受體的揭示對闡明冠狀病毒的感染與致病機制提供了重要的理論依據(jù)，對研發(fā)抗病毒藥物、新型疫苗和受體抑制劑等都有幫助。但目前許多冠狀病毒的受體及確切機制尚不清楚，未對APN受體功能域進行精確定位，某些特定細胞中是否必須依賴pAPN才對病毒易感；冠狀病毒是否存在其他多種受體或者侵入途徑。冠狀病毒可引起人和多種動物發(fā)生疫病，冠狀病毒的APN受體及其他受體的深入解析將具有重要的公共衛(wèi)生意義。

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DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2016.01.018

通訊作者：黃小波，Email: rsghb110@126.com

中圖分類號：S855.3

文獻標識碼：A

文章編號：1002-2694(2016)01-0089-06

Corresponding author:Huang Xiao-bo, Email: rsghb110@126.com

收稿日期：2015-05-11；修回日期:2015-08-11

Review of aminopeptidase N as the receptor of coronavirus

CHEN Jie,HUANG Xiao-bo,ZHANG Yu-di,QING Ying,LI Ya-qing,WEN Xin-tian,CAO San-jie,WEN Yi-ping,WU Rui

(1.ResearchCenterofSwineDisease/LaboratoryofAnimalInfectiousDiseaseandMicroarray,CollegeofVeterinaryMedicine,SichuanAgriculturalUniversity,Chengdu611130,China)

Abstract:Aminopeptidase N(APN), a type II transmembrane glycoprotein that belongs to zinic-dependent membrane-bound metallopretease family, exists in many tissues of human and mammals as the binding-receptor of coronavirus. Participating in the coronavirus adhesion and invasion, aminopeptidase N is closely related to the coronavirus infection. In this essay, there is an overview of structure, function and inhibitors of aminopeptidase N that as functional receptor of HCoV-229E, FCoV, CCoV, TGEV, PEDV. This paper mainly introduces the progress of aminopeptidase N as functional receptors of human and swine coronavirus, so as to provide a reference to further research and application of APN receptor.

Keywords:aminopeptidase N; coronavirus; receptor