王秀麗 徐振興

（廈門中醫(yī)院檢驗(yàn)科，福建 廈門 361009）

淺談臨床定量PCR實(shí)驗(yàn)室的質(zhì)量控制

王秀麗 徐振興

（廈門中醫(yī)院檢驗(yàn)科，福建 廈門 361009）

定量PCR；質(zhì)量控制

PCR聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction）自問(wèn)世以來(lái)以其高靈敏性、高特異性、高效性在某些疾病如感染性疾病、腫瘤、法醫(yī)學(xué)、及科學(xué)研究等領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用。PCR的高敏感性和高特異性已經(jīng)體現(xiàn)了其臨床診療價(jià)值，正因如此，對(duì)其檢測(cè)中的錯(cuò)誤也會(huì)有放大作用，往往引起嚴(yán)重的后果。在醫(yī)患矛盾較為突出的今天，做好PCR檢驗(yàn)質(zhì)量控制，發(fā)出正確的PCR檢測(cè)結(jié)果尤為重要。本文對(duì)實(shí)踐工作中的心得和體會(huì)進(jìn)行了總結(jié)，對(duì)PCR檢驗(yàn)的各個(gè)環(huán)節(jié)進(jìn)行質(zhì)量控制，探討PCR檢驗(yàn)分析中的質(zhì)量控制方法及實(shí)驗(yàn)效果。

1 分析前的質(zhì)量控制

1.1 實(shí)驗(yàn)室環(huán)境：嚴(yán)格遵守“各區(qū)獨(dú)立、注意風(fēng)向”，禁止使用中央空調(diào)。

1.2 儀器設(shè)備的管理：儀器設(shè)備的正確使用、維護(hù)和校準(zhǔn)是保證PCR結(jié)果準(zhǔn)確的前提，對(duì)實(shí)驗(yàn)室中的儀器設(shè)備如擴(kuò)增儀、離心機(jī)、加樣器、真空泵、生物安全柜等建立一套規(guī)范化、標(biāo)準(zhǔn)的操作程序。

1.3 試劑的貯存與比對(duì)：試劑一般貯存在-20 ℃以下。通過(guò)肉眼觀察試劑盒應(yīng)完整無(wú)破損，標(biāo)識(shí)清楚——廠家名稱、批準(zhǔn)文號(hào)、生產(chǎn)日期、有效期等；在更換不同批號(hào)的試劑時(shí)，本實(shí)驗(yàn)室還建立了不同批次試劑間的比對(duì)程序；試劑現(xiàn)用現(xiàn)配，避免提前配好。

1.4 檢驗(yàn)者素質(zhì)：PCR都是微量操作，要想獲得穩(wěn)定可靠的檢測(cè)結(jié)果，操作人員就需要一定的專業(yè)技術(shù)知識(shí)與經(jīng)驗(yàn)，要盡可 能做到知其然又知其所以然。從實(shí)際工作上來(lái)看，不同的操作者所獲得的測(cè)定結(jié)果往往差異也很大，因此，人員培訓(xùn)相當(dāng)重要，尤其是內(nèi)部針對(duì)性的培訓(xùn)[1]。

1.5 標(biāo)本的采集、運(yùn)送、接收及編號(hào)：標(biāo)本采集、運(yùn)送、接收及編號(hào)是準(zhǔn)確發(fā)放報(bào)告的基礎(chǔ)。有些患者特別是肝病患者很多都需要長(zhǎng)期治療和定期復(fù)查，經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)非常重，有時(shí)會(huì)出現(xiàn)冒用醫(yī)保卡的現(xiàn)象，這就需要相關(guān)人員嚴(yán)格執(zhí)行對(duì)各類標(biāo)本的查對(duì)。

2 分析中的質(zhì)量控制

2.1 PCR儀器的保養(yǎng)和校正：PCR儀是PCR擴(kuò)增的關(guān)鍵儀器，儀器的保養(yǎng)是PCR儀能正常工作的前提。實(shí)驗(yàn)室建立了標(biāo)準(zhǔn)化操作程序，本實(shí)驗(yàn)室采用的是羅氏LightCycler480實(shí)時(shí)熒光PCR儀，嚴(yán)格按照儀器的說(shuō)明書(shū)及儀器的標(biāo)準(zhǔn)操作程序進(jìn)行日、周、月保養(yǎng)。儀器是否處于一個(gè)良好的工作狀態(tài)是檢驗(yàn)結(jié)果正確與否的重要保障。

2.2 主要污染來(lái)源與防污染措施：做好PCR最重要的工作就是防治污染。實(shí)驗(yàn)室中主要的污染來(lái)源：①實(shí)驗(yàn)室樣本中含有的待測(cè)微生物；②PCR擴(kuò)增產(chǎn)物引起的殘留污染。PCR擴(kuò)增引起擴(kuò)增產(chǎn)物累積增加，如果不采取有效的防污措施，在很短的時(shí)間內(nèi)累積的氣溶膠化的擴(kuò)增產(chǎn)物就會(huì)污染實(shí)驗(yàn)室中的耗材、試劑和儀器設(shè)備等，造成嚴(yán)重的后果。污染重在預(yù)防，為了避免實(shí)驗(yàn)室污染，獲得準(zhǔn)確、可靠的檢測(cè)結(jié)果，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)制定一套具體可行的污染防護(hù)措施并嚴(yán)格執(zhí)行。防污措施：①嚴(yán)格實(shí)驗(yàn)室分區(qū)及嚴(yán)格遵守實(shí)驗(yàn)室工作制度，不同分區(qū)的物品如加樣器、筆等不得混用，建立外來(lái)人員登記程序；②在每次實(shí)驗(yàn)后可使用10%次氯酸鈉清洗實(shí)驗(yàn)室包括工作臺(tái)面、加樣器、離心機(jī)等，然后再用70%乙醇或清水洗去殘留次氯酸鈉。本實(shí)驗(yàn)室每次實(shí)驗(yàn)結(jié)束后都將實(shí)驗(yàn)操作板放入10%次氯酸鈉溶液中浸泡1 h，而且盛有次氯酸鈉的容器還要定期更換，本實(shí)驗(yàn)室曾經(jīng)有段時(shí)間陰性對(duì)照曲線總是有抬頭，經(jīng)多方查找原因，確定是沒(méi)有及時(shí)更換浸泡實(shí)驗(yàn)操作板的容器引起的；③紫外線照射。

2.3 室內(nèi)質(zhì)控：室內(nèi)質(zhì)控可以監(jiān)測(cè)與控制實(shí)驗(yàn)室工作的精密度，提高常規(guī)檢驗(yàn)工作中批內(nèi)、批間樣本檢驗(yàn)結(jié)果的一致性，是用以確定檢驗(yàn)結(jié)果是否可靠、可否發(fā)出的一項(xiàng)重要工作[2]。儀器、試劑、耗材、核酸提取操作等因素都會(huì)影響質(zhì)控品的檢測(cè)[3]。在每次實(shí)驗(yàn)過(guò)程中按照本實(shí)驗(yàn)室的室內(nèi)質(zhì)控要求測(cè)定陰性質(zhì)控，高、低值2種濃度的質(zhì)控血清。質(zhì)控樣本的擺放順序在每一次擴(kuò)增檢驗(yàn)時(shí)都相應(yīng)順延，以保證核酸提取和擴(kuò)增中所有檢測(cè)結(jié)果都符合質(zhì)控要求。

2.4 室間質(zhì)控：室間質(zhì)量控制是實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制體系中重要組成部分，是保證患者的檢驗(yàn)結(jié)果及其報(bào)告的準(zhǔn)確性和可靠性，以及各個(gè)實(shí)驗(yàn)室間檢測(cè)結(jié)果的可比性的重要手段。隨著PCR技術(shù)的發(fā)展與普及，PCR檢測(cè)的室間質(zhì)控越來(lái)越重要。本實(shí)驗(yàn)室每年都積極參加省臨檢中心和衛(wèi)生部的室間質(zhì)評(píng)，并對(duì)反饋回來(lái)的室間質(zhì)評(píng)成績(jī)進(jìn)行認(rèn)真分析和總結(jié)，及時(shí)改正存在的問(wèn)題。

2.5 利用患者就診資料進(jìn)行質(zhì)控比對(duì)：檢測(cè)結(jié)果與臨床情況的相關(guān)性如何，需要掌握患者的主要臨床情況，包括患者的病情與變化情況；檢測(cè)項(xiàng)目和其他項(xiàng)目的相關(guān)性，如大三陽(yáng)患者在未經(jīng)抗病毒治療下DNA很少陰性；前后檢測(cè)結(jié)果的對(duì)比，將本次檢測(cè)結(jié)果與上幾次檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較等，都是可行的方法[4]。這些可以通過(guò)醫(yī)師或者患者的溝通來(lái)做到，或者通過(guò)LIS檢驗(yàn)系統(tǒng)的“報(bào)告查詢”功能來(lái)實(shí)現(xiàn)，從而保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的正確發(fā)出。

3 分析后的質(zhì)控

這一階段質(zhì)量保證的主要工作如下：檢驗(yàn)結(jié)果的正確發(fā)出，咨詢服務(wù)，以及對(duì)檢驗(yàn)樣品的保存及處理[5]。

3.1 報(bào)告單的及時(shí)發(fā)出：檢驗(yàn)報(bào)告單要求及時(shí)、準(zhǔn)確、完整地發(fā)出，保證醫(yī)師能夠及時(shí)的獲得檢驗(yàn)結(jié)果。同時(shí)需要有報(bào)告簽發(fā)和審核程序。檢驗(yàn)者還應(yīng)切記保護(hù)患者隱私。

3.2 咨詢服務(wù)：實(shí)驗(yàn)室應(yīng)主動(dòng)的努力做好咨詢服務(wù)這項(xiàng)工作，在解釋檢驗(yàn)結(jié)果時(shí)應(yīng)耐心、細(xì)致、有理有據(jù)。

3.3 檢驗(yàn)樣品的保存和處理：每天實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，每份樣本吸取0.5mL血清到離心管中，放入2～8 ℃冰箱內(nèi)保存7 d。后由衛(wèi)生人員集中處理。

[1] 李金明.實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)[M].北京:人民軍醫(yī)出版社,2012:143.

[2] 李金明.感染性疾病免疫測(cè)定的室內(nèi)質(zhì)量控制[J].醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)與臨床,2007,18(1):3-6.

[3] 陳松.法醫(yī)DNA實(shí)驗(yàn)室的DNA污染和防范[J].刑事技術(shù),2007(3): 16-20.

[4] 徐忠玉.發(fā)光免疫分析的質(zhì)量控制[J].檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)與臨床,2010,7 (3):280-281.

[5] 葉應(yīng)撫,王毓三,申子瑜.全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程[M].3版.南京:東南大學(xué)出版社,2006:113.

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