鄭樹安

（福建農(nóng)林大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，福州350002）

蜜蜂的細(xì)胞及體液免疫

鄭樹安

（福建農(nóng)林大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，福州350002）

在長(zhǎng)期的進(jìn)化過(guò)程中，蜜蜂形成了一套有效避免和減輕各種病原體及異物對(duì)其自身造成影響的防衛(wèi)體系，主要包括體壁、消化道等機(jī)械屏障，各種清理行為，蜂產(chǎn)品的抗菌性能，以及蜜蜂的細(xì)胞和體液免疫作用等。本文簡(jiǎn)要介紹蜜蜂的細(xì)胞和體液免疫。

蜜蜂是一個(gè)古老的生物類群，不但生產(chǎn)各種營(yíng)養(yǎng)豐富的蜂產(chǎn)品，也是眾多開花植物的傳粉者，在生態(tài)系統(tǒng)中占有重要地位。盡管蜜蜂無(wú)T和B淋色細(xì)胞，無(wú)免疫球蛋白及完整的補(bǔ)體系統(tǒng)，缺乏特異的抗原-抗體反應(yīng)，但其也具有一套獨(dú)特的免疫系統(tǒng)，主要由細(xì)胞免疫（cellular immunity）和體液免疫（humoral immunity）組成。蜜蜂細(xì)胞免疫主要依賴漿細(xì)胞或粒細(xì)胞對(duì)外來(lái)病原物或異物的吞噬（phagocytosis）和包被作用（encapsulation）；而體液免疫系統(tǒng)是以抗菌肽、凝集素、溶菌酶、酚氧化酶等，配合多種血細(xì)胞建立的一個(gè)開放完整的防御體系。一般認(rèn)為誘導(dǎo)蜜蜂免疫系統(tǒng)啟動(dòng)的誘導(dǎo)物并不是針對(duì)某一特定的誘導(dǎo)源，也沒有相應(yīng)的特異性結(jié)合，即蜜蜂的免疫為“非專一性”免疫，不同的誘導(dǎo)源均可誘導(dǎo)蜜蜂產(chǎn)生類似的抗菌物質(zhì)，且經(jīng)誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)具有廣譜性，而非針對(duì)特定的誘導(dǎo)物質(zhì)。

一、蜜蜂的細(xì)胞免疫

跟其他昆蟲一樣，蜜蜂的循環(huán)系統(tǒng)屬于開放式血液循環(huán)，不具備哺乳動(dòng)物那樣與體腔完全分離的管網(wǎng)系統(tǒng)，它的整個(gè)體腔就是血腔，血液和組織液不能區(qū)分，血淋巴遍布于蜜蜂所有組織和器官。當(dāng)外來(lái)病原體和異物進(jìn)入后，蜜蜂依靠血細(xì)胞的吞噬、成瘤、包囊等作用殺滅病原菌，并通過(guò)凝集作用和傷口修復(fù)以防止外來(lái)物進(jìn)一步侵入蜜蜂體腔。

1.吞噬作用

吞噬作用是指單個(gè)血細(xì)胞對(duì)入侵病原體完成識(shí)別、吞噬和消化清除的過(guò)程，僅能處理少量外來(lái)物，主要分為五個(gè)階段：（1）化學(xué)接觸吸引；（2）識(shí)別：（3）附著；（4）攝入；（5）消化或排除。

在外來(lái)物被蜜蜂漿血細(xì)胞或粒血細(xì)胞識(shí)別、附著和攝入后，將被溶酶體和吞噬體形成的吞噬溶酶體消化。溶酶體向吞噬溶酶體釋放各種水解酶以殺滅外來(lái)物。但有時(shí)，被捕獲的細(xì)菌可能在吞噬細(xì)胞中繁殖，使細(xì)胞死亡，釋放出更多的細(xì)菌，進(jìn)一步在昆蟲血液中繁殖，導(dǎo)致致命的敗血癥的發(fā)生。

2.成瘤作用

當(dāng)病原物大量進(jìn)入血腔，漿血細(xì)胞的吞噬作用已經(jīng)無(wú)法完全對(duì)其清除時(shí)，蜜蜂將啟動(dòng)更有效的防御機(jī)制，即成瘤作用（nodule formation）。成瘤作用是指多個(gè)血細(xì)胞聚集起來(lái)，對(duì)大量的小型病原物進(jìn)行包圍并殺死的過(guò)程。與病原物接觸后，血細(xì)胞發(fā)生破裂，誘導(dǎo)病原物周圍血液固定在凝血塊中。血細(xì)胞和細(xì)菌的聚集體被厚層的扁平血細(xì)胞包圍，形成的瘤脫離血液循環(huán)，黏附在內(nèi)部器官的表面，逐漸死亡。

3.包囊作用

包囊實(shí)質(zhì)上是和成瘤相同的過(guò)程，只是包囊的對(duì)象體積更大，直徑超過(guò)10 μm較大的外來(lái)物體，包括在線蟲等寄生性外來(lái)物入侵時(shí)，蜜蜂血細(xì)胞啟動(dòng)包囊作用。在細(xì)胞包囊中，數(shù)層血細(xì)胞在寄生蟲、它們的卵、真菌菌絲體和孢子、細(xì)菌菌株或原生動(dòng)物周圍組成的囊袋。

在包囊中由于窒息或有毒廢物的積累可使寄生蟲的胚胎、幼蟲死亡。被包裹的寄生蟲可能由于黑變反應(yīng)產(chǎn)生的醌中毒而死亡。孵化的幼蟲可能發(fā)育不全、生長(zhǎng)受到阻礙。當(dāng)然，在長(zhǎng)期的進(jìn)化中，有些被包囊的寄生蟲也可能生存下來(lái)，逃出包囊。

4.傷口修復(fù)和凝集作用

受傷后形成的傷口往往是病原菌侵入蜜蜂體腔的主要入口，在長(zhǎng)期進(jìn)化中，蜜蜂通過(guò)血凝塊和傷口的迅速愈合，消除了微生物進(jìn)入的潛在通道。加上吞噬作用、成瘤和包囊作用，使血細(xì)胞脫粒和釋放凝塊物質(zhì)，截留或捕獲外來(lái)物質(zhì)。

在傷口修復(fù)中，血細(xì)胞大量聚集在創(chuàng)傷處，封閉傷口。同時(shí)誘集大量漿血細(xì)胞在凝血塊底部形成包被，殺死傷口內(nèi)的病原物，阻止它們侵入。從而達(dá)到防御目的。

二、蜜蜂的體液免疫

蜜蜂沒有淋巴免疫器官，當(dāng)病原菌或其他異物侵入時(shí)，不會(huì)產(chǎn)生抗體，但能誘導(dǎo)血淋巴內(nèi)相應(yīng)肽類和蛋白質(zhì)含量的增加。盡管這些有防衛(wèi)能力的肽類和蛋白質(zhì)與誘導(dǎo)源沒有特異關(guān)系，但也可以起到抑制和殺滅病原微生物的作用。因此，適當(dāng)?shù)囊圆糠植粫?huì)引起蜜蜂患病的誘導(dǎo)物刺激蜜蜂，也能增強(qiáng)其抵抗力。

蜜蜂的體液免疫依賴血淋巴中的先天性免疫和獲得性免疫。先天性免疫因子包括溶菌酶、酚氧化酶、凝集素等。獲得性免疫需要人工或自然的誘導(dǎo)，典型的有蜜蜂抗菌肽。

1.溶菌酶

溶菌酶（lysozyme）又稱胞壁質(zhì)酶（muramidase）或N-乙酰胞壁質(zhì)聚糖水解酶（N-acetylmuramide glycanohydrlase），是一種能水解致病菌中黏多糖的堿性酶。主要通過(guò)破壞細(xì)胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之間的β-1，4糖苷鍵，使細(xì)胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽，導(dǎo)致細(xì)胞壁破裂內(nèi)容物逸出而使細(xì)菌溶解。溶菌酶還可與帶負(fù)電荷的病毒蛋白直接結(jié)合，與DNA、RNA、脫輔基蛋白形成復(fù)鹽，使病毒失活。因此，該酶具有抗菌、消炎、抗病毒等作用，但主要攻擊革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌。

蜜蜂正常的血淋巴（無(wú)免疫性的）含有低水平的溶菌酶，以達(dá)到避免擦傷和受傷害的目的。蜜蜂幼蟲和成蟲的血淋巴中，溶菌酶濃度約為5～25 μg/ml，蛹含有5～10 μg/ml，飛翔蜂血淋巴中約40 μg/ml。受侵染時(shí)，蜜蜂幼蟲比成蜂對(duì)溶菌酶的合成反應(yīng)更強(qiáng)烈。如：用大腸桿菌活細(xì)胞感染以后，幼蟲溶菌酶的濃度可高達(dá)330 μg/ ml，前蛹期達(dá)1300 μg/ml；而成蜂感染細(xì)菌后，血淋巴中溶菌酶濃度升高不明顯。

2.酚氧化酶

酚氧化酶（Phenoloxidse，PO）是一類含銅氧化酶，在蜜蜂的正常生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中具有重要的生理功能。PO通常以其非活化狀態(tài)的前體酚氧化酶酶原的形式存在于蜜蜂的血淋巴中，PO及其因子構(gòu)成了酚氧化酶原激活系統(tǒng)。該系統(tǒng)由PO、蛋白酶、模式識(shí)別蛋白和蛋白酶抑制劑構(gòu)成，與昆蟲機(jī)體受到外源物刺激產(chǎn)生免疫防御因子有著密切的關(guān)系，是參與并同時(shí)聯(lián)系體液免疫與細(xì)胞防御反應(yīng)的少數(shù)通路之一。

在細(xì)胞免疫過(guò)程中，蜜蜂血細(xì)胞激發(fā)酚氧化酶的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，PPO活化后形成PO的一個(gè)重要的生物學(xué)功能是在外侵物周圍合成黑色素。激活的PO將酪氨酸羥基化為多巴，多巴再被氧化為多巴色素、二羥吲哚，最后形成黑色素。因此，酚氧化酶是黑色素生物合成有關(guān)的關(guān)鍵酶，并參與血細(xì)胞對(duì)外來(lái)物質(zhì)的吞噬、成瘤、包囊及黑化過(guò)程。

酚氧化酶也是昆蟲的體液免疫依賴的先天性免疫因子。病原微生物進(jìn)入昆蟲血腔時(shí)，病原體自身的某些成分與宿主血細(xì)胞的特殊識(shí)別蛋白識(shí)別并結(jié)合，激活絲氨酸蛋白酶原級(jí)聯(lián)，接著引起酚氧化酶原級(jí)聯(lián)的活化，使酚氧化酶原裂解成酚氧化酶，參與機(jī)體的免疫防御反應(yīng)。

3.凝集素

凝集素（lectin）是一類促使細(xì)胞凝集的蛋白或糖蛋白，具有專一的糖基識(shí)別能力，能與特異的受體進(jìn)行結(jié)合，且只在與特異性受體結(jié)合后，結(jié)構(gòu)和空間構(gòu)象發(fā)生變化，才能發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)。凝集素可作為血細(xì)胞的表面受體，起識(shí)別外源入侵物并與之結(jié)合或介導(dǎo)血細(xì)胞對(duì)異源分子的吞噬作用，增強(qiáng)血細(xì)胞中酚氧化酶的功能，促進(jìn)細(xì)胞對(duì)入侵物的包囊和黑化反應(yīng)。它不僅在防御體系中有清除異物的作用，而且在變態(tài)發(fā)生時(shí)，對(duì)清除不必要的組織和細(xì)胞也起到了重要的作用。

4.抗菌肽

抗菌肽原指昆蟲體內(nèi)經(jīng)誘導(dǎo)而產(chǎn)生的一類具有抗菌活性的堿性多肽物質(zhì)，分子量在2000～7000左右，由20～60個(gè)氨基酸殘基組成。這類活性多肽多數(shù)具有強(qiáng)堿性、熱穩(wěn)定性以及廣譜抗菌等特點(diǎn)。目前已知的蜜蜂抗菌肽主要有防衛(wèi)素、蜜蜂抗菌肽、蜂蛾抗菌肽和膜翅抗菌肽。

（1）蜜蜂防衛(wèi)素：蜜蜂防衛(wèi)素含51個(gè)氨基酸，其序列組成與蜂王漿中的抗菌肽royalisin幾乎相同，僅有一個(gè)氨基酸不同，都對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌有作用。通過(guò)編碼蜜蜂防衛(wèi)素的cDNA克隆的分析，發(fā)現(xiàn)其C-末端是酰胺化的，這種酰胺化的修飾作用對(duì)于穩(wěn)定分子的雙螺旋結(jié)構(gòu)進(jìn)而保障分子的溶菌活性是非常重要的。蜜蜂防衛(wèi)素前體結(jié)構(gòu)是由19個(gè)氨基酸組成的信號(hào)肽序列、22個(gè)氨基酸組成的前序列以及51個(gè)氨基酸組成的成熟序列組成。蜜蜂防衛(wèi)素對(duì)高溫穩(wěn)定，100℃加熱15 min仍可保持活性。

（2）蜜蜂抗菌肽：目前發(fā)現(xiàn)的蜜蜂抗菌肽多達(dá)19種，是含有18個(gè)氨基酸殘基的小肽，富含脯氨酸，感染微生物的蜜蜂體內(nèi)的apidaecin是由許多異構(gòu)物組成，主要對(duì)革蘭氏陰性菌起作用。不同的蜜蜂抗菌肽具有相同的保守序列，比較典型的是在C-端有8個(gè)氨基酸的保守序列，即PRPPHPRL。保守序列與其抗菌活性直接相關(guān)，保守序列的取代會(huì)造成蜜蜂抗菌肽抗菌作用的減弱和喪失。

編碼蜜蜂抗菌肽的基因轉(zhuǎn)錄成的前體mRNA是由編碼16個(gè)氨基酸的信號(hào)肽序列、編碼16個(gè)氨基酸的前序列、數(shù)量不等地由幾乎相同的84個(gè)核苷酸組成的重復(fù)單元（一般為1～12個(gè)）以及此C-末端序列而成，每個(gè)單元由一個(gè)編碼成熟的抗菌肽序列和編碼6～8個(gè)氨基酸以及一個(gè)二肽序列RR（N-末端的第一個(gè)單元的二肽是兩個(gè)精氨酸AA）組成。

（3）膜翅抗菌肽：膜翅抗菌肽由93個(gè)氨基酸殘基組成，是一種典型的陽(yáng)離子型多肽，N-末端有一個(gè)2-吡咯酮-5-羧酸。其抗菌原理是通過(guò)改變細(xì)菌膜通透性達(dá)到抑制革蘭氏陽(yáng)性菌和少數(shù)革蘭氏陰性菌的生長(zhǎng)，最低抑菌濃度較其他抗菌肽要低。不同于其他抑菌肽在離子濃度增加時(shí)抑菌效果降低的特性，膜翅抗菌肽的抑菌效果并不隨溶液中離子強(qiáng)度的增加而減少。其前體結(jié)構(gòu)是由17個(gè)氨基酸組成的信號(hào)肽序列、17個(gè)氨基酸組成的前序列及93個(gè)氨基酸組成的成熟肽組成。

（4）蜂蛾抗菌肽：蜂蛾抗菌肽含有34個(gè)氨基酸殘基，包括10個(gè)脯氨酸殘基。其氨基末端序列與蜜蜂抗菌肽相似，具有廣譜的抗革蘭氏陰性菌的作用，對(duì)植物來(lái)源的革蘭氏陰性菌的抑菌活性更低。蜂蛾抗菌肽除了19個(gè)氨基酸組成的信號(hào)肽外，無(wú)其他前導(dǎo)序列，因此它的加工成熟過(guò)程非常簡(jiǎn)單，只要進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，通過(guò)翻譯加工將信號(hào)肽除去，即成為有生物活性的蜂蛾抗菌肽。

蜜蜂自身的細(xì)胞和體液免疫對(duì)其抵御外界病原物的入侵和保障蜜蜂及蜂群的健康具有重要作用，如何充分提高和利用蜜蜂自身的免疫力是值得進(jìn)一步研究的課題。值得注意的是，能量和營(yíng)養(yǎng)是影響蜜蜂免疫力的重要因素，充分保證蜂群的食物和營(yíng)養(yǎng)，是提高蜜蜂免疫力和蜂群健康水平的重要措施之一。

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